張穎蕾，陳蕾曉，李國艷，卓然，鐘真，黃遠城，唐小川，王曉麗

(廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005)

隨著全球變暖，氣溫逐年升高，熱應激對于動物機體的生長發(fā)育、生理功能等均產生了不利影響，因此尋求緩解熱應激的相關研究受到了廣泛關注[1-2]。睪丸是雄性動物的生殖器官，參與睪酮的合成、精子的產生等正常生殖生理過程，有研究表明熱應激對睪丸生精能力有顯著影響[3-4]。絞股藍多糖(Gynostemmapentaphyllumpolysaccharides，GPP)是葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍中的主要活性成分之一，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗衰老、抗氧化和免疫調節(jié)等作用[5-6]。但有關絞股藍多糖對緩解熱應激的研究較少，對熱應激導致睪丸氧化損傷的保護作用還未見報道。因此，本研究在實驗室前期研究基礎上，以成年雄性小鼠為試驗對象，在相同的熱應激條件下，觀察絞股藍多糖對熱應激小鼠睪丸氧化損傷的保護作用，為絞股藍多糖的進一步研究與開發(fā)利用提供新的方向與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 絞股藍多糖的提取與糖含量測定

絞股藍原料購自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。洗凈、烘干，經粉碎3 cm過篩加工后，避光干燥保存。參考楊勤等[7]文章中提到的方法，實驗室水提醇沉法提取絞股藍多糖，苯酚硫酸法測定絞股藍多糖含量為 71.1%。

1.2 主要試劑

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(WST-1 法)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(紫外法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(比色法)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)、睪酮(TESTO)測試盒均購于南京建成生物工程研究所。雄激素受體(AR)免疫組化試劑盒，購自美國Santa cruz公司。

1.3 實驗動物與分組

6周齡，體重(20±0.2)g，SPF級昆明系健康雄性小鼠，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心(許可證編號：SYXK桂2020-0004)50只，飼養(yǎng)于標準鼠籠中，隨機將小鼠分為5組：空白對照組(Con)、熱應激對照組(HS)、絞股藍多糖低劑量組(GPP-L)、絞股藍多糖中劑量組(GPP-M)、絞股藍多糖高劑量組(GPP-H)，每組10只。Con組和HS組每天腹腔注射生理鹽水，其余組每天腹腔注射絞股藍多糖溶液，劑量按體重分別為50 mg/kg (GPP-L)、100 mg/kg(GPP-M)和200 mg/kg (GPP-H)，以10 mL/(kg·d)連續(xù)給藥，連續(xù)給藥2周后進行連續(xù)7 d的熱應激，應激條件為38 ℃ 45 min接著42 ℃ 20 min，21 d后處死，按照試驗設計采樣備用。

1.4 血清睪酮測定及臟器指數(shù)計算

小鼠末次用藥1 d后眼眶采血，分離血清，采用放射免疫分析法測定血清中睪酮含量，結果以ng/mL表示。處死后75%酒精浸泡消毒后剪開腹腔，取出雙側睪丸分別稱重，根據(jù)公式，臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/ 體重(g)×100%，計算睪丸指數(shù)。

1.5 曲精小管直徑測定

常規(guī)石蠟切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色。光學顯微鏡(40×)下觀察睪丸組織結構形態(tài)，拍照。通過Image Pro Plus軟件測量睪丸曲精小管直徑(每組隨機測定20個管徑，管徑以最長管徑與最短管徑的平均值為準)，記錄并分析統(tǒng)計。

1.6 睪丸組織細胞凋亡及雄性激素受體的表達測定

按TUNEL原位凋亡及雄性激素受體(AR)檢測試劑盒說明書操作。光鏡下(40×)觀察組織細胞染色情況，每組隨機選取5個視野。利用 Image Pro Plus軟件測定所選定視野凋亡細胞、AR陽性細胞累計光密度值(IOD)與視野下睪丸組織的面積(Area)，計算各個視野下的凋亡細胞、IOD/Area。

1.7 睪丸組織抗氧化指標測定

取睪丸組織，以重量∶體積為1∶9的比例加入帶冰的生理鹽水中，采用組織勻漿研磨機研磨各睪丸組織，勻漿后離心，取上清液進行分裝，用于試劑盒檢測氧化損傷指標丙二醛(MDA)的含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)都用IBM SPSS Statistics 26統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各指標采用單因素方差分析法(ANOVA)進行多組間數(shù)據(jù)分析比較，LSD-t檢驗法進行組間數(shù)據(jù)分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”來表示。使用Image Pro Plus軟件對圖片進行分析。

2 結果

2.1 睪丸指數(shù)及血清睪酮含量的變化

通過對各組雙側睪丸分別稱重并計算睪丸指數(shù)，采用放射免疫分析法對各組血清中睪酮含量進行測定，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析，結果如表1所示，GPP各劑量組睪丸指數(shù)與HS組比較均有所增長，但差異不顯著。GPP-L和GPP-M組血清睪酮含量與HS組相比均顯著升高(P<0.05)，GPP-H與HS組無顯著差異，但均低于Con組。

2.2 睪丸組織形態(tài)學、曲精小管直徑的變化

各組睪丸分別進行石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠睪丸生精小管及各級生精細胞的形態(tài)，如圖1所示。空白對照組(圖1A)睪丸組織形態(tài)正常；熱應激對照組(圖1B)睪丸生精小管生精上皮變薄，生精細胞數(shù)量減少，管腔內見到脫落的生精細胞，各級生精細胞排列紊亂，且管腔內精子數(shù)目減少；各絞股藍多糖組(圖1C、D、E)生精小管外形較規(guī)則，界膜較完整，生精上皮層數(shù)增多，生精細胞排列整齊、緊密，生精小管的結構接近于正常組，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央，且精子數(shù)目較多。

A.Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組。

每組隨機對20個曲精小管直徑進行測量分析，結果如表2所示。GPP各劑量組睪丸曲精小管直徑與HS組相比均顯著增大(P<0.05)，且GPP-L、GPP-M組曲精小管直徑顯著低于GPP-H和Con組(P<0.05)，GPP-H組曲精小管直徑顯著高于Con組(P<0.05)，GPP-L、GPP-M組間差異不顯著。結合形態(tài)學觀察，表明絞股藍多糖可以改善熱應激引起的睪丸組織結構損傷。

表2 曲精小管直徑的變化

2.3 細胞凋亡及AR的表達

經TUNEL原位末端標記后，如圖2所示，Con組有少量的細胞凋亡，熱應激組凋亡細胞明顯增多，各GPP組的凋亡細胞與Con組相比有所增加。經對凋亡細胞IOD/Area進行統(tǒng)計分析，如表3所示，發(fā)現(xiàn)HS組凋亡細胞的IOD/Area與Con組相比顯著增大(P<0.05)，各GPP劑量組IOD/Area數(shù)值較HS組均有所減小，其中，GPP-M組數(shù)值較HS組顯著減小(P<0.05)且與Con組無顯著差異，GPP-L、GPP-H與HS組IOD/Area差異不顯著。

A.Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組；箭頭所指為TUNEL陽性細胞。

表3 睪丸凋亡細胞IOD/Area、雄性激素受體的變化

經AR免疫組化染色后，如圖3所示，AR定位于細胞核，在曲細精管的基底膜處支持細胞以及間質細胞中表達。HS組及各GPP組與Con組相比，AR陽性細胞減少，表達減弱。隨機選取5個視野，對AR陽性細胞IOD/Area進行統(tǒng)計分析，如表3所示，發(fā)現(xiàn)HS組睪丸組織AR陽性細胞的IOD/Area與Con組相比顯著減小(P<0.05)，各GPP劑量組IOD/Area較熱應激組均有所增大，其中GPP-L和GPP-M組AR表達程度與HS組相比顯著增強(P<0.05)。

A. Con組；B. HS組；C. GPP-L組；D. GPP-M組；E. GPP-H組；箭頭所指為TUNEL陽性細胞；箭頭所指為AR陽性細胞。

2.4 睪丸組織抗氧化指標的變化

通過分光光度法，分別對睪丸組織中MDA、GSH-PX含量及SOD和CAT活力進行檢測，結果見表4，GPP-M和GPP-L組的MDA含量與HS組相比顯著降低(P<0.05)，但高于Con組；GPP-M和GPP-L組的GSH-Px含量、CAT活力、SOD活力與HS組相比顯著升高(P<0.05)，但均低于Con組；GPP-H組的CAT活力、SOD活力與HS組相比顯著升高(P<0.05)。

表4 睪丸組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA含量的變化

3 討論

睪丸對溫度非常敏感，有研究表明，熱應激可導致睪丸萎縮，睪丸指數(shù)變小[7]。睪丸形態(tài)和睪丸指數(shù)是睪丸健康情況的重要指標之一。劉慧娟等[2]在熱應激小鼠日糧中添加蘆丁，發(fā)現(xiàn)其可以提高熱應激小鼠睪丸指數(shù)，顯著增加熱應激小鼠生精小管直徑，降低熱應激小鼠生精細胞脫落比率；高琛等[4]發(fā)現(xiàn)熱應激可以導致小鼠睪丸系數(shù)降低，誘導小鼠睪丸組織結構損傷，黃芩苷可提高熱應激小鼠睪丸指數(shù)，減輕熱應激造成的小鼠睪丸損傷；吳璟等[8]給熱應激小鼠灌胃葫蘆巴堿，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯改善熱應激對小鼠睪丸的損傷程度，生精小管各級層數(shù)明顯增多，生精細胞排列整齊。本研究也發(fā)現(xiàn)GPP可以提高熱應激小鼠睪丸指數(shù)，顯著增加熱應激小鼠曲精小管直徑，改善熱應激對小鼠睪丸的損傷程度-曲精小管外形較規(guī)則，界膜較完整，生精上皮層數(shù)增多，生精細胞排列整齊、緊密，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央。

雄性動物睪丸間質細胞合成和分泌的睪酮，能調控生殖細胞、器官生長發(fā)育成熟，促進精子發(fā)生，維持雄性正常生殖活動及第二性征[9]。有研究表明，熱應激可以抑制睪酮的生成[1]。而黃曉蘭等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠改善高溫引起的血清睪酮濃度降低，對受熱損傷的雄性大鼠生殖系統(tǒng)具有良好的保護作用。姜志洋等[11]發(fā)現(xiàn)日糧中添加姜黃素和槲皮素可降低夏季熱應激對湖羊睪酮分泌的影響。本研究也發(fā)現(xiàn)GPP-L組和GPP-M組均可顯著提高血清睪酮含量，表明GPP能夠改善熱應激引起的血清睪酮下降，對熱應激造成的睪丸生殖生理功能受損具有一定的保護作用。

在性激素調節(jié)過程中，下丘腦-垂體-性腺軸是最直接、最主要的調控方式，睪酮通過AR介導從而發(fā)揮功能。馬瑞[12]研究發(fā)現(xiàn)，AR表達水平受睪酮濃度的調控，且呈時間和劑量依賴性。還有研究表明，應激會引起AR表達水平下調[13]。由此推測，睪酮濃度下降，為了適應睪酮濃度的變化產生了負反饋調節(jié)，AR蛋白表達水平下降。本研究也驗證了這一點，GPP-L和GPP-M組AR表達程度較HS組均顯著增強，說明GPP能夠改善熱應激小鼠睪丸AR蛋白的表達。

Paul等[14]發(fā)現(xiàn)高溫可引起生精細胞凋亡增加，譚秋慧等[15]也發(fā)現(xiàn)熱應激后凋亡陽性細胞明顯增多。而鄧琦等[16]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖對MPP+誘導的PC12細胞凋亡有一定的保護作用。蔡冬寶[17]發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-O-葡萄糖及其代謝產物PCA均可緩解熱應激造成的生精細胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，熱應激組凋亡細胞明顯增多，GPP組凋亡細胞有所減小，其中GPP-M組顯著減小，表明在熱應激情況下小鼠睪丸細胞凋亡加劇，經過GPP處理后小鼠睪丸的細胞凋亡得到一定的緩解。

MDA是眾多脂質過氧化產物的分解產物，MDA的含量反映機體或組織內脂質過氧化程度[18]。CAT、GSH-Px、SOD 3種酶是機體清除自由基的重要組分，三者具有協(xié)同作用，能夠清除生物體代謝產生的自由基和H2O2，共同組成了細胞內的抗氧化酶防御系統(tǒng)[19-20]。高琛等[4]發(fā)現(xiàn)腹腔注射黃芩苷能夠抑制熱應激小鼠睪丸組織中MDA含量的升高，拮抗熱應激引起的SOD、GSH-PX、CAT 3種酶的活力降低。曾新斌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加中劑量的牡蠣粗多糖能夠顯著提高小鼠血液中SOD和GSH-Px的活性，顯著降低MAD活性，改善了應激狀態(tài)下小鼠的生化指標，具有緩解熱應激的作用。秦芹等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖能顯著降低高溫暴露大鼠睪丸組織中MDA含量，提高SOD活性，具有一定抗氧化損傷作用。本研究也發(fā)現(xiàn) GPP-M組和GPP-L組的MDA含量顯著降低，GSH-Px含量、CAT活力、SOD活力顯著升高，抗氧化酶活力恢復，提示絞股藍多糖對熱應激引起的睪丸氧化損傷具有一定的保護作用。

4 結論

GPP可以有效抵制熱應激引起的睪丸組織損傷和細胞凋亡，保護AR蛋白的正常表達以及提高熱應激小鼠睪丸抗氧化能力，其中100 mg/kg GPP效果較明顯。