田開月，曲信芹，韓城昊，尹坤，楊盼盼，黃玉波*，趙軍*

(1. 周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 周口 466000；2. 青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266000；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdVs)屬于腺病毒科禽腺病毒屬[1]，包含3個(gè)亞群。I群禽腺病毒根據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)和限制性酶切圖譜可分為A、B、C、D、E 5個(gè)種，12個(gè)血清型[2]，其中，禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起雞肝炎-心包積液綜合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)。FAdV-4主要感染3～6周齡的肉雞，感染雞表現(xiàn)精神沉郁、羽毛松亂、拉白色和綠色稀糞等臨床癥狀，剖檢可見心包有淡黃色積液、包涵體肝炎和腎炎等病理變化，死亡率高達(dá)80%～90%[3-4]。2015年在我國主要養(yǎng)禽省份暴發(fā)的HHS，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。

FAdV-4為基因組長(zhǎng)約45 kb的無囊膜雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，六鄰體蛋白(hexon)、纖維蛋白(fiber)和五鄰體基座蛋白(penton base)為病毒衣殼主要組成部分。 其中fiber與penton base相連，形成二十面體病毒衣殼的頂端。fiber蛋白在介導(dǎo)病毒感染、決定病毒致病性和誘導(dǎo)特異性中和抗體方面發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)AdV-4每個(gè)五鄰體基座上有fiber1和fiber2兩種長(zhǎng)度不同的fiber蛋白[9-11]?，F(xiàn)有的研究顯示，fiber1在介導(dǎo)FAdV-4病毒的感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而fiber2在致病性和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究[12-13]。

FAdV-4的有效防控依靠快速診斷和疫苗免疫?，F(xiàn)有診斷以檢測(cè)病毒核酸的分子生物學(xué)方法為主，目前防控FAdV-4感染的商品化疫苗包括全病毒滅活疫苗和fiber2蛋白亞單位疫苗[14-15]。養(yǎng)禽業(yè)需要檢測(cè)FAdV-4抗原和抗體的血清學(xué)方法，以便實(shí)現(xiàn)FAdV-4感染的血清學(xué)監(jiān)測(cè)和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。本研究用純化的FAdV-4中國流行株免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得2株分泌抗FAdV-4 fiber2蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為建立FAdV-4的血清學(xué)診斷和評(píng)價(jià)疫苗效力的方法，以及fiber2蛋白功能的進(jìn)一步研究提供了研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室提供；FAdV-4中國流行株CH/HNJZ/2015(GenBank登錄號(hào)KU558760)、新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株、傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41株、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)HQ株、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)HP株、減蛋綜合征病毒(EDSV)Z16株均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所保存；雞肝癌細(xì)胞系(LMH)購自美國ATCC公司；6周齡 BALB/c 小鼠購自山東朋悅動(dòng)物中心；胎牛血清購自Biological Industries公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、次黃嘌呤氨基喋啶(HAT)、次黃嘌呤(HT)、PEG1500購自Sigma公司；鼠單抗Ig分型試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC羊抗鼠IgG購自Proteintech公司。

1.2 FAdV-4擴(kuò)增與純化

將FAdV-4 接種于LMH細(xì)胞單層，待細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)收取細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，6 000 r/min 4 ℃離心30 min，收取上清進(jìn)行蔗糖梯度離心。

1.3 動(dòng)物免疫

將純化后的FAdV-4用終濃度0.02%的甲醛滅活后與等體積的弗氏完全佐劑乳化，采用皮下多點(diǎn)注射方式免疫6周齡BALB/c小鼠3只，分別命名為1號(hào)鼠、2號(hào)鼠和3號(hào)鼠。其后每隔10 d分別進(jìn)行二免和三免，用弗氏不完全佐劑與等體積的FAdV-4乳化后皮下多點(diǎn)注射。三免10 d后尾部靜脈采血，使用前期建立的間接 ELISA測(cè)定血清效價(jià)[16]。選擇ELISA效價(jià)高于1∶10 000 的小鼠，在融合前3 d用純化的FAdV-4腹腔注射進(jìn)行沖刺免疫。

1.4 細(xì)胞融合與單克隆抗體制備

1.4.1 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選

取沖刺免疫后3 d的小鼠的脾臟組織，分離脾細(xì)胞后與SP2/0 細(xì)胞用PEG1500進(jìn)行融合。融合后3 d，用含有HAT的RPMI 1640篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。用以fiber2蛋白為包被抗原的間接ELISA篩選能夠分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。選取檢測(cè)結(jié)果為陽性、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)孔、亞克隆以及凍存。

1.4.2 腹水的制備與純化

取0.5 mL弗氏不完全佐劑對(duì)2只16周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射，9 d后分別腹腔注入106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2株可分泌抗fiber2蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨大，采集腹水，利用優(yōu)球蛋白沉淀法純化單克隆抗體。

1.5 單克隆抗體的鑒定

1.5.1 亞型鑒定

按照鼠單克隆抗體Ig亞類鑒定試劑盒說明書操作，對(duì)獲得的小鼠腹水單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。

1.5.2 反應(yīng)原性鑒定

取純化的FAdV-4感染的LMH細(xì)胞裂解液、fiber2蛋白和正常的LMH細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，以制備的小鼠腹水作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，對(duì)所制備小鼠腹水與FAdV-4及其fiber2蛋白的反應(yīng)原性進(jìn)行Western blot分析。

1.5.3 特異性鑒定

分別以超速離心純化的NDV La Sota疫苗株、IBV M41株、IBDV HQ株、H9N2 AIV HP株、EDSV Z16株作為包被抗原(1 μg/孔)，純化的fiber2蛋白作為陽性抗原對(duì)照，用間接ELISA方法檢測(cè)所制備小鼠腹水的特異性。

1.5.4 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)單克隆抗體與FAdV-4 fiber2蛋白的反應(yīng)性

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的表達(dá)FAdV-4 fiber2蛋白的重組NDV La Sota株rLa Sota-fiber2和NDV La Sota株分別感染DF1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立未感染的細(xì)胞為空白對(duì)照。在感染后24 h，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，PBST洗滌；用0.1%的Triton X-100室溫透化30 min，PBST洗滌；用含1% BSA的PBST作為封閉液，室溫作用1.5 h，PBST洗滌；用制備的小鼠腹水作為一抗，用封閉液稀釋(1∶100)，4 ℃過夜，PBST洗滌3遍；用FITC羊抗鼠IgG(1∶2 000)作為二抗37 ℃ 1 h，PBST洗3遍后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 中和活性檢測(cè)

采用固定病毒稀釋抗體的方法檢測(cè)所制備單克隆抗體的中和活性。將制備的雜交瘤細(xì)胞的小鼠腹水原液進(jìn)行2倍倍比稀釋，與等體積的100 TCID50FAdV-4病毒液混合，37 ℃作用1 h，然后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的LMH細(xì)胞單層，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。連續(xù)7 d每日觀察細(xì)胞病變，鑒定所制備單克隆抗體對(duì)FAdV-4的中和活性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠抗體效價(jià)的測(cè)定

3次免疫后第10天，測(cè)定免疫小鼠血清中抗fiber2蛋白的抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，3號(hào)小鼠抗體水平較高，稀釋10 000倍后OD450 nm仍然達(dá)到1.5以上。為保證融合成功率，選取3號(hào)小鼠進(jìn)行沖刺免疫后，取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合(圖1)。

圖1 間接ELISA檢測(cè)三免后小鼠血清中抗FAdV-4 fiber2蛋白抗體

2.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞型鑒定

融合的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過5輪亞克隆后，獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗fiber2蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2C3和7B4。將相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別注射到小鼠腹腔制備腹水。利用鼠單克隆抗體亞類分型試劑盒鑒定抗體亞型。結(jié)果顯示，獲得的單克隆抗體均為IgM亞型,輕鏈均為Kappa型(圖2)。

圖2 單克隆抗體亞型和輕鏈類型鑒定

2.3 單克隆抗體反應(yīng)原性分析

采用Western blot檢測(cè)所獲得的2株單克隆抗體腹水與FAdV-4及其fiber2蛋白的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，獲得的2株單抗均可與FAdV-4及其fiber2蛋白特異性反應(yīng)，在66 kDa左右出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，其中單抗7B4與FAdV-4及其fiber2蛋白的反應(yīng)性較強(qiáng)(圖3B)；2株單抗均與陰性對(duì)照無反應(yīng)(圖3)。

M.蛋白Marker；1. FAdV-4全病毒；2.fiber2蛋白；3.LMH細(xì)胞對(duì)照。

2.4 單克隆抗體特異性的鑒定

為了鑒定抗FAdV-4 fiber2蛋白單抗的特異性，利用間接 ELISA 方法檢測(cè)獲得的單克隆抗體腹水與FAdV-4及其他常見家禽病毒的反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，獲得的2株單克隆抗體均能夠與FAdV-4及其fiber2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與禽的其他常見病原NDV、IBV、IBDV、H9N2亞型AIV和EDSV等均無交叉反應(yīng)(圖4)。

圖4 單克隆抗體特異性鑒定

2.5 單克隆抗體IFA鑒定

為了進(jìn)一步檢測(cè)單克隆抗體與FAdV-4 fiber2蛋白的反應(yīng)性，本研究利用間接免疫熒光檢測(cè)2C3和7B4單克隆抗體腹水與真核細(xì)胞中表達(dá)的fiber2蛋白的反應(yīng)性。圖5結(jié)果顯示，2C3和7B4單克隆抗體腹水均能夠識(shí)別重組病毒rLa Sota-fiber2感染的DF1細(xì)胞中表達(dá)的fiber2蛋白，產(chǎn)生特異性熒光，而La Sota疫苗株感染的DF1細(xì)胞和空白對(duì)照均未出現(xiàn)特異的熒光，說明獲得的單克隆抗體也能夠特異性識(shí)別天然構(gòu)象的fiber2蛋白，可用于后續(xù)FAdV-4的檢測(cè)和fiber2蛋白功能的相關(guān)研究。

圖5 IFA檢測(cè)單克隆抗體2C3和7B4與細(xì)胞中表達(dá)的FAdV-4 fiber2蛋白的反應(yīng)性

a. 正常細(xì)胞對(duì)照；b～g. 添加單抗，濃度分別為1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024和1∶4 096；h. FAdV-4感染對(duì)照。

2.6 單克隆抗體中和活性的鑒定

在鑒定單克隆抗體腹水能夠特異性識(shí)別FAdV-4及其fiber2蛋白的基礎(chǔ)上，本研究檢測(cè)了單克隆抗體對(duì)FAdV-4的中和活性。圖6結(jié)果顯示，2C3和7B4單克隆抗體腹水在1∶256稀釋條件下依然能夠有效阻斷FAdV-4導(dǎo)致的細(xì)胞病變，說明獲得的2株單克隆抗體均具有良好的FAdV-4中和活性。

3 討論

自2015年以來，由FAdV-4導(dǎo)致的HHS在我國主要養(yǎng)禽省份暴發(fā)流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。建立FAdV-4抗原和抗體的檢測(cè)方法對(duì)于監(jiān)測(cè)FAdV-4的流行和評(píng)價(jià)FAdV-4相關(guān)疫苗的免疫效力，以及制定有效防控HHS的措施均至關(guān)重要。fiber2是FAdV-4的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，與FAdV-4的致病性密切相關(guān)，同時(shí)含有型特異性抗原表位，且可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體[11-14]。因此，fiber2是研制FAdV-4亞單位疫苗，建立FAdV-4檢測(cè)方法和解析FAdV-4致病機(jī)理的重要靶標(biāo)。單克隆抗體的突出優(yōu)點(diǎn)是特異性好，利用針對(duì)fiber2的單克隆抗體可以建立檢測(cè)FAdV-4及其fiber2蛋白的抗原夾心ELISA和間接免疫熒光等方法，也可以建立檢測(cè)抗FAdV-4及其fiber2抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA。在研究FAdV-4的致病機(jī)理方面，抗fiber2單克隆抗體可以用于fiber2蛋白的亞細(xì)胞定位、fiber2蛋白與宿主互作蛋白的鑒定等。

國內(nèi)已經(jīng)有多個(gè)單位制備了抗FAdV-4的fiber2蛋白的單克隆抗體。謝明等[17]利用大腸桿菌表達(dá)的fiber2蛋白作為免疫原和篩選抗原，獲得多株能穩(wěn)定分泌抗fiber2蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞，所制備的單克隆抗體在斑點(diǎn)雜交和間接免疫熒光試驗(yàn)中能較好地識(shí)別FAdV-4及其fiber2蛋白，但不能在Western blot試驗(yàn)中識(shí)別上述抗原，對(duì)于所制備的單抗是否具有病毒中和活性也沒有報(bào)道。朱榮芳等[18]利用大腸桿菌表達(dá)的fiber2 Head蛋白作為免疫原和篩選抗原制備了相應(yīng)的單克隆抗體，制備的單克隆抗體在ELISA、Dot-blot、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)和IFA等試驗(yàn)中均可特異性識(shí)別 fiber2 Head 蛋白和 FAdV4，但在 Western blot 試驗(yàn)中沒有雜交反應(yīng)。同樣，所制備單克隆抗體是否具有病毒中和活性也不得而知。王萍等[19]利用FAdV-4全病毒作為免疫原，用純化的原核表達(dá)的fiber2蛋白作為篩選抗原，研制出了4株針對(duì)FAdV-4的單克隆抗體，其中單克隆抗體3C2在體外能有效抑制FAdV-4的感染，但4株單克隆抗體也均不能識(shí)別Western blot試驗(yàn)中的fiber2蛋白。郭瑞珍等[20]利用原核表達(dá)的可溶性重組蛋白 NusA-fiber2作為免疫原，篩選獲得3株能穩(wěn)定分泌抗fiber2蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，所獲得的單克隆抗體具有良好的Western blot和IFA反應(yīng)性，但病毒中和活性較低。綜上所述，目前抗FAdV-4 fiber2蛋白單克隆抗體存在的主要問題是在Western blot試驗(yàn)中不能識(shí)別fiber2蛋白和不具有良好的病毒中和活性。

本研究利用純化的FAdV-4中國流行株全病毒作為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，用純化的大腸桿菌表達(dá)的可溶性fiber2蛋白作為篩選抗原，成功獲取2株分泌抗fiber2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所制備的單克隆抗體2C3和7B4在Western blot和IFA中均能識(shí)別FAdV-4及其fiber2蛋白，同時(shí)還具有良好的FAdV-4特異性和中和活性。結(jié)合國內(nèi)其他單位制備抗fiber2單克隆抗體的結(jié)果，或許利用FAdV-4全病毒作為免疫原，利用可溶性的fiber2蛋白作為篩選抗原是獲得具有優(yōu)良免疫反應(yīng)原性和病毒中和活性單克隆抗體的較好策略。關(guān)于小鼠的免疫次數(shù)和免疫間隔，多數(shù)研究人員采用3次連續(xù)免疫和1次沖刺免疫。免疫的間隔采用間隔10 d或間隔2周不等，但通常是在第3次免疫后用ELISA或IFA測(cè)定免疫小鼠血清中的特異性抗體效價(jià)，然后取抗體效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行沖刺免疫，收獲其脾細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞融合[17-21]。本研究采用間隔10 d進(jìn)行3次連續(xù)免疫，選擇ELISA效價(jià)為1∶10 000 的小鼠，在融合前用純化的FAdV-4腹腔注射進(jìn)行沖刺免疫，然后取其脾細(xì)胞進(jìn)行融合，最終獲得了性能較好的單克隆抗體。至于采取幾次免疫和多長(zhǎng)的免疫間隔時(shí)間，目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。但根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，無論采用哪種免疫策略，選取免疫后ELISA抗體效價(jià)在1∶10 000 以上的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通常能夠得到性能良好的單克隆抗體。此外，在單克隆抗體的篩選過程中，要采用ELISA、IFA和Western blot多種篩選方法，以便獲得具有多種優(yōu)良特性的單克隆抗體?？傊?，本研究研制的抗FAdV-4 fiber2蛋白單克隆抗體，為FAdV-4檢測(cè)方法的建立及fiber2蛋白功能的深入研究提供了研究材料。