程林芳 楊帆 劉福民 姚航平 吳南屏 吳海波

浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院傳染病重癥診治全國重點實驗室，國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310003

乙型流感病毒是引起季節(jié)性流感的主要病原之一，有研究表明，每隔7 個流感季會出現(xiàn)1 次乙型流感病毒主導的流感暴發(fā)[1]。 根據(jù)流感病毒表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白，乙型流感病毒分為兩個譜系：B/Victoria/2/87 為代表毒株的Victoria （V） 系和B/Yamagata/16/88 為代表毒株的Yamagata（Y）系[2-3]。2 種譜系乙型流感病毒在全球交替流行[4-5]，目前，傳統(tǒng)流感病毒鑒定方法依賴于臨床樣本中病毒分離，但這些方法耗時長，靈敏度低[6]，而常用流感治療藥物越早服用效果越好。 因此，開發(fā)一種快速、準確的乙型流感病毒檢測方法對臨床早期診斷具有重要意義。

當前臨床常用流感病毒診斷方法主要為實時熒光定量PCR 法，但該方法需要特殊設備條件（熒光定量PCR 儀），手工操作步驟多，易造成污染，不適用于基層地區(qū)或現(xiàn)場檢測。 膠體金免疫層析技術是當前另一種常用的、適合居家自檢的抗原檢測技術，但其靈敏度較低，易導致漏檢。 因此，本研究基于1 對靶向Y 系乙型流感病毒HA 的特異性單克隆抗體，建立1 種ELISA 雙抗體夾心法，該方法具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、無需其他昂貴的實驗儀器等優(yōu)點，能快速、靈敏地檢測Y 系乙型流感病毒，能較早發(fā)現(xiàn)流感病毒感染，控制疫情擴散。

材料與方法

一、細胞株和實驗動物

小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 和MDCK 細胞由浙江大學傳染病重癥診治全國重點實驗室保存。 BALB/c小鼠購自上海斯萊康實驗動物有限公司。

二、流感病毒株

本研究使用的流感病毒株由浙江大學傳染病重癥診治全國重點實驗室保存：B/Phuket/3073/2013（Y 系）、B/Shang Hai/361/2002 （Y 系）、B/Florida/4/2006（Y 系）、B/Hubei-Wujiagang/158/2009（Y 系）、B/Massachusetts/2/2012 （Y 系）、B/Malaysia/2506/2004（V 系）、B/Brisbane/60/2008（V 系）、B/Washington/02/2019（V 系）、A/Michigan/45/2015（H1N1）和A/Texas/50/2012（H3N2）。

三、乙型流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的制備

選擇6～8 周齡BALB/c，雌性小鼠，以純化的Y系乙型流感病毒（B/Phuket/3073/2013）HA 蛋白對小鼠進行免疫[7-8]。 細胞融合前3 天，對小鼠進行加強免疫。 分離小鼠脾細胞，在聚乙二醇作用下與SP2/0細胞進行融合。 雜交瘤細胞在含次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶的DMEM 培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。2 周后，吸取細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA 實驗，篩選陽性克隆。 通過4 次有限稀釋，篩選獲得穩(wěn)定高效表達抗Y 系乙型流感病毒的單克隆雜交瘤細胞株。選擇8 周BALB/c 小鼠，每只接種含5×106個雜交瘤細胞，7～10 d 后收集小鼠腹水。 通過親和純化法（Protein G 瓊脂凝膠）純化腹水中的單克隆抗體，采用Bio-Rad 公司小鼠單克隆抗體免疫球蛋白分型試劑盒分析。

四、單克隆抗體特性分析

將收集5×106個目標單克隆雜交瘤細胞用1 mL的Trizol 裂解后提取RNA，并委托北京義翹神州股份有限公司進行抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)測序[9]。

通過免疫熒光方法檢測單克隆抗體特異性[7]，將MDCK 細胞提前1 天以每孔4×104個細胞接種在48 孔板中。 用PBS 稀釋后的病毒 （感染復數(shù)為0.5）感染細胞16 h。用4%多聚甲醛固定細胞30 min，用0.5% Triton-X100 通透細胞30 min， 用3% 血牛清白蛋白溶液封閉1 h。 每孔加入10 μg/mL 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。 同時設置同型對照（無關同型抗體）和陰性對照（PBS）。用PBS 洗細胞3 遍后加入用5 μg/mL 熒光二抗（Abcam），37 ℃下避光孵育90 min。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核，室溫下避光孵育10 min。 在熒光顯微鏡下觀察實驗結果，觀察到綠色熒光即為陽性。

通過ELISA 檢測單克隆抗體親和力[9]。 將抗體用PBS 稀釋到起始濃度（10 μg/mL）。 將PBS、正常小鼠血清和免疫小鼠血清分別用作空白、陰性和陽性對照。 將所有待測樣本做2 個復孔，并用PBS 進行2 倍倍比稀釋（10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.15、0.08、0.04、0.02 和0.01 μg/mL）。 將所有樣本加入用B/Phuket/3073/2013 HA 蛋白包被的ELISA 酶標板中進行檢測。

五、雙抗體夾心-ELISA 檢測方法的建立

本研究中包被液、 封閉液、TMB 顯色液和終止液均購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。 以單克隆抗體1F7 為捕獲抗體、單克隆抗體2H6 為檢測抗體建立檢測Y 系乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA法[10-12]。 在10 mL 包被液中加入100 μL 的40 μg/mL單克隆抗體1F7，混勻后加入96 孔酶標板中（100 μL/孔），4 ℃過夜包板。 洗板3 次后，在96 孔酶標板中每孔加入200 μL 封閉液，室溫封閉2 h。 洗板3 次后，在酶標板每孔中加入100 μL 待檢樣本，室溫孵育2 h。洗板3 次后，在酶標板每孔中加入100 μL 的1 μg/mL經辣根過氧化酶（HRP）標記試劑盒標記單克隆抗體2H6，室溫孵育1 h。洗板5 次后，在酶標板每孔中加入100 μL TMB 顯色液，室溫避光反應5 min 后，在酶標板每孔中加入100 μL 終止液終止反應。 于450 nm 處測定其光密度值，以測定值除以陰性≥2.1判定為陽性。

六、雙抗體夾心ELISA 靈敏度和特異性驗證

用2 倍倍比稀釋的Y 系乙型流感病毒尿囊液和HA 蛋白（B/phuket/3073/2013）驗證雙抗體夾心ELISA 靈敏度。 將Y 系乙型流感病毒（B/phuket/3073/2013） 依次稀釋至27、26、25、24、23、22、21、20、2-1、2-2、2-3和2-4血凝素單位（HAU），將100 μL 待檢樣本加入ELISA 板中進行檢測。 將來自B/phuket/3073/2013 純化HA 蛋白依次稀釋至10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.15、0.08、0.04、0.02 和0.01 μg/mL， 將100 μL 待檢樣本加入ELISA 板中進行檢測，設陰性對照（空白尿囊液或PBS）。結果判定：空白孔和陰性孔未顯色提示該雙抗體夾心ELISA 有效， 否則無效；以測定值除以陰性≥2.1 判定為陽性。

為了驗證雙抗體夾心ELISA 方法特異性，將30份已知臨床咽拭子樣本加入ELISA 板中進行檢測，包括9 份Y 系乙型流感病毒陽性樣本、6 份V 系乙型流感病毒陽性樣本、4 份H1N1 甲型流感病毒（H1N1）陽性樣本、2 份H3N2 甲型流感病毒（H3N2）陽性樣本以及2 份呼吸道合胞病毒（RSV） 陽性樣本、2 份鼻病毒（RhV）陽性樣本、3 份腺病毒（ADV）陽性樣本、2 份SARS-CoV-2 陽性樣本。

七、雙抗體夾心ELISA 的臨床樣本檢測初步應用

自2020 年1 月至2022 年12 月， 本研究共收集了100 份來自浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院的人鼻咽拭子樣本。 涉及的臨床樣本和病例的采集經浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號: IIT2021694)。 所有臨床樣本分別進行甲乙型流感病毒核酸聯(lián)合測定試劑盒（熒光PCR 法）和雙抗體夾心ELISA 檢測結果比較，初步評價雙抗體夾心ELISA 在檢測臨床樣本的一致性[6]。取100 μL樣本用磁珠法提取RNA，并用甲乙型流感病毒核酸測定試劑盒進行檢測， 另取100 μL 樣本用雙抗體夾心ELISA 檢測。 比較兩者的檢測結果，并計算雙抗體夾心ELISA 的特異性和靈敏度。

結果

一、單克隆抗體特性分析

本研究共獲得了2 株靶向Y 系乙型流感病毒（B/phuket/3073/2013） 血凝素蛋白單克隆抗體1F7和2H6。 同時亞型分析顯示這2 株單克隆抗體均為IgG1，κ 型。

先前的研究表明乙型流感病毒株的進化速度低于甲型流感病毒[13]，其中B/Massachusetts/2/2012（Y 系） 和B/Phuket/3073/2013 （Y 系） 分別作為2014—2015 年和2015—2023 年WHO 推薦的北半球4 價流感疫苗中的Y 系流感病毒疫苗成分，而B/Brisbane/60/2008（V 系）和B/Washington/02/2019（V系） 分別作為2014—2018 年和2020—2022 年WHO 推薦的北半球4 價流感疫苗中的V 系流感病毒疫苗成分。 因此本研究共選取8 株乙型流感病毒株，包括B/Shanghai/361/2002（Y 系）、B/Florida/2006（Y 系）、B/Hubei-Wujiagang/158/2009 （Y 系）、B/Massachusetts/2/2012 （Y 系）、B/Phuket/3073/2013（Y系）、B/Malaysia/2506/2004 （V 系）、B/Brisbane/60/2008（V 系）和B/Washington/02/2019（V 系），作為代表毒株通過免疫熒光實驗檢測單克隆抗體1F7 和2H6 的特異性。 實驗結果提示單克隆抗體1F7 和2H6 與2002—2013 年Y 系乙型流感病毒能夠特異性結合，與V 系乙型流感病毒、甲型H1N1 和甲型H3N2 流感病毒均無交叉反應（圖1）。

圖1 單克隆抗體的特異性檢測結果（20×，DAPI 染核）

通過ELISA 法分析單克隆抗體1F7 和2H6 的親和力，結果提示這2 株單克隆抗體與乙型流感病毒HA 蛋白均具有較好的親和力（圖2）。

圖2 單克隆抗體親和力檢測結果

二、雙抗體夾心ELISA 的建立

將捕獲抗體1F7 結合在96 孔酶標板表面上，用HRP 標記檢測抗體2H6?？乖c固相載體表面的特異性抗體1F7 結合，再與HRP-抗體2H6 結合。加入TMB 底物顯色液，底物即被酶催化成有色產物而顯色。 顯色程度與抗原的量直接相關，因此可根據(jù)顯色的深淺進行定性或定量分析。

三、雙抗體夾心ELISA 的靈敏度和特異性驗證

將Y 系乙型流感病毒尿囊液和血凝素蛋白（B/phuket/3073/2013）進行2 倍倍比稀釋，分析雙抗體夾心ELISA 檢測法的靈敏度。 如圖3 所示，本研究中建立的雙抗體夾心ELISA 能檢測Y 系乙型流感病毒，靈敏度為2-1HAU。

圖3 雙抗體夾心ELISA 檢測法的靈敏度

特異性分析顯示，本研究中建立的雙抗體夾心ELISA 檢測法能特異性檢測Y 系乙型流感病毒，與其他病毒無交叉反應（表1）。

表1 雙抗體夾心ELISA 檢測法的特異性分析

四、雙抗體夾心ELISA 檢測法的重復性

雙抗體夾心ELISA 的重復性實驗顯示批內（表2）和批間（表3）重復變異系數(shù)均小于5%，提示本研究組裝的雙抗體夾心ELISA 具有較好的重復性。

表2 雙抗體夾心ELISA 的批內重復實驗結果

表3 雙抗體夾心ELISA 的批間重復實驗結果

五、雙抗體夾心ELISA 檢測法的臨床應用

用本研究建立的雙抗體夾心ELISA 試劑盒和甲乙型流感病毒核酸聯(lián)合測定試劑盒 （熒光PCR法） 一起檢測100 份來自浙江地區(qū)人鼻咽拭子樣本。 在23 份經甲乙型流感病毒核酸聯(lián)合測定試劑盒(熒光PCR 法) 檢測陽性的樣本中， 雙抗體夾心ELISA 檢測法的陽性率為91.30%（21/23）。 結果顯示，該ELISA 法的陽性準確率91.30%（21/23），陰性準確率為98.70%（76/77）。

討論

當前流感病毒檢測方法主要包括病毒分離、實時熒光定量PCR 和免疫學抗原檢測等方法[14-15]。 由于臨床樣本在轉運過程中可能因保存條件不當而導致病毒失活，使其陽性率大大降低。 此時，流感病毒抗原快速檢測，例如實時熒光定量PCR 和ELISA等方法，展現(xiàn)了其在樣本初篩時特有的快速、簡便、準確和分型診斷等優(yōu)點。 其中， 雙抗體夾心ELISA檢測法通常利用一對識別不同抗原表位的單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，通常靶向抗原的非重疊區(qū)域，因此該方法特異性高，但獲得一對最佳的抗體配對是當前的技術難點。 目前，雙抗體夾心ELISA 檢測法已廣泛應用于檢測不同亞型流感病毒抗原， 包括甲型H5、H6、H7 和H9 流感病毒和乙型流感病毒[10,16-19]。 丘立文等[19]制備了針對乙型流感病毒核衣殼蛋白單克隆抗體并建立了一種乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒，具有較高特異性和靈敏度，與病毒分離和RT-PCR 相當。徐菱等[20]也建立了檢測乙型流感病毒核蛋白的雙抗體夾心ELISA 試劑盒，其最低檢出限為13.26 ng/mL。

本研究共獲得2 株抗Y 系乙型流感病毒HA蛋白的單克隆抗體1F7 和2H6，對獲得的單克隆細胞株的重、輕鏈可變區(qū)基因進行測序，這些序列的獲得可用于下一步重組表達工程抗體和三維結構模擬[9]。另外，單克隆抗體1F7 和2H6 分別作為捕獲和檢測抗體組裝了Y 系乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒。 通過各項條件優(yōu)化，該檢測方法具有良好的特異性， 能檢測Y 系乙型流感病毒，且與其他病毒不發(fā)生交叉反應，該檢測方法的靈敏度達到1.22 ng/mL（HA 蛋白）或2-1HAU/100 μL乙型流感病毒，具有良好的靈敏度；與甲、乙型流感病毒核酸聯(lián)合測定試劑盒（熒光PCR）相比，該檢測方法的陽性準確率和陰性準確率分別為91.30%（21/23）和98.70%（76/77）。 不同于丘立文等[19]和徐菱等[20]建立的針對乙型流感病毒的保守蛋白（核蛋白）的乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒， 本研究針對乙型流感病毒HA 蛋白篩選了特異性單克隆抗體1F7 和2H6， 并基于單克隆抗體1F7和2H6 建立了主要針對Y 系乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒，可以快速、準確地對Y系乙型流感病毒株進行檢測和分型。 同時，必要時該雙抗體夾心ELISA 檢測試劑盒可以與其他檢測V 系乙型流感病毒的檢測試劑盒聯(lián)用， 拓寬其在臨床檢測中的應用。

綜上，本研究基于Y 系乙型流感病毒HA 蛋白制備了2 株特異性單克隆抗體，并進一步建立了檢測Y 系乙型流感病毒的雙抗體夾心ELISA 法，該方法操作簡便，適用于檢測大批量樣本，具有潛在的臨床應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明程林芳:實施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計分析；楊帆：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；劉福民：實施研究、采集數(shù)據(jù)；姚航平：分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、獲取研究經費、行政和技術支持；吳南屏：對文意的知識性內容作批評性審閱、統(tǒng)計分析、行政和技術支持；吳海波：醞釀和設計實驗、分析/解釋數(shù)據(jù)、獲取研究經費、指導、支持性貢獻