郭 玲,孫鳳萱**,趙洪進(jìn),鄧建業(yè),宋 坤,杜 鵬,李 艷***

(1.山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心,濟(jì)南 250012;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院,濟(jì)南 250021;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科,濟(jì)南 250012;4.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100871)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期高血壓疾病,多于妊娠20周后出現(xiàn),常伴有多系統(tǒng)受累和損害,發(fā)病率約為2%～8%[1-2]。PE常引起孕產(chǎn)婦HELLP綜合征、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth retardation,IUGR)、早產(chǎn)等嚴(yán)重并發(fā)癥,并可增加患者及子代遠(yuǎn)期心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。胎盤形成過程中滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過淺與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其具體分子機(jī)制尚未明確,缺乏有效的早期診斷和治療方法[1]。因此,深入闡明PE的發(fā)病機(jī)制并鑒定有效靶標(biāo)分子有助于針對(duì)PE及其他胎盤功能障礙相關(guān)妊娠疾病的精準(zhǔn)診療體系的建立。

WNT/β-catenin信號(hào)通路在滋養(yǎng)細(xì)胞融合、分化、增殖、侵襲和遷移等過程中均發(fā)揮著重要作用[5]。WNT家族成員5A(WNT5A)是一種分泌蛋白,屬于β-catenin非依賴WNT通路的經(jīng)典配體,可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、極性以及分化等,在胚胎發(fā)育和器官穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6]。目前,WNT5A在PE患者胎盤組織中的表達(dá)及其對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)作用仍存較大爭(zhēng)議[7-9]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族中一員,已被確定為人類子宮內(nèi)膜蛻膜化的生物標(biāo)志物,可通過激活經(jīng)典的SMAD1/5/9-SMAD4信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。但BMP2對(duì)WNT信號(hào)通路的影響及其與PE的關(guān)系目前鮮少研究。本研究旨在評(píng)估胎盤WNT5A表達(dá)水平與PE嚴(yán)重程度的相關(guān)性,并探討B(tài)MP2對(duì)WNT5A表達(dá)的調(diào)控作用及PE發(fā)生的潛在分子機(jī)制,以期為PE的早期診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇2020年5月至2020年12月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)終止妊娠的27例PE孕婦(PE組)和38例血壓正常的健康孕婦(對(duì)照組),收集所有研究對(duì)象的胎盤組織。PE組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)妊娠20周后新發(fā)高血壓伴蛋白尿(≥0.3mg尿蛋白/24h);(2)單胎妊娠;(3)未使用輔助生殖技術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)先前存在繼發(fā)性/原發(fā)性高血壓、妊娠期糖尿病及心血管疾病;(2)患有慢性自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺自身免疫或抗磷脂綜合征等);(3)有不良孕產(chǎn)史或其他妊娠合并癥等。對(duì)照組為同期因臀位、子宮瘢痕和社會(huì)因素等選擇剖宮產(chǎn)終止妊娠的血壓正常且無其他妊娠合并癥的健康孕婦。本研究已獲得山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 永生化人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/高糖培養(yǎng)基。置37℃、5% CO2和95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育,培養(yǎng)基每隔一天更換一次。重組蛋白添加前,將細(xì)胞維持在含0.1% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/高糖培養(yǎng)基中饑餓處理24h。

1.1.3 人類原代絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblasts,EVT)分離和培養(yǎng) 人類原代EVT于人類孕早期(妊娠6～9周)的新鮮絨毛組織中機(jī)械分離得到[11-12]。分離純化的人類原代EVT細(xì)胞使用含10% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.4 主要試劑 DMEM/高糖培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)GE Hyclone公司;人重組BMP2和WNT5A蛋白均購(gòu)自美國(guó)R&D公司;WNT5A Taqman引物購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;α-Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;WNT5A、β-catenin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司;8μm Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 去生長(zhǎng)因子的Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1∶8稀釋混勻,50μL/孔覆蓋Transwell小室,37℃溫箱,靜置2h。每個(gè)小室中用250μL含0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)基種植5×104個(gè)細(xì)胞,小室下方加750μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中靜置孵育36h,棉簽擦去小室膜內(nèi)側(cè)未侵襲的細(xì)胞,用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞20min,PBS沖洗,Hoechst33258染細(xì)胞核30min。在熒光顯微鏡下拍照,每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞數(shù)后取平均值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol Reagent提取胎盤組織和細(xì)胞總RNA,檢測(cè)RNA濃度和純度。使用Prime Script RT reagent Kit進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔重復(fù)檢驗(yàn),GAPDH為參照,采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量相對(duì)值。引物序列:WNT5A-F:CCTGAAGGAGAAGTACGACAG,WNT5A-R:CCTGAAGGAGAAGTACGACAG;GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT,GAPDH-R:GACAAGCTTCCCGTTCTCAG。

1.2.3 蛋白免疫印跡 使用含適量蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA試劑盒按說明書檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1h,加一抗4℃過夜孵育,TBST洗膜,加相應(yīng)二抗,室溫?fù)u床孵育1h,用ECL法化學(xué)發(fā)光后采集圖像。

1.2.4 RNA-seq測(cè)序 將經(jīng)空白對(duì)照和外源性BMP2處理24h后的HTR8/SVneo細(xì)胞,干冰冷凍寄送生物公司進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。提取mRNA,PCR擴(kuò)增,2%瓊脂糖凝膠回收目的條帶,定量后按比例混合上機(jī)。橋式PCR擴(kuò)增生成clusters,Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因注釋和富集,篩選Cut offP≤0.05,fold change≥2的基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié) 果

2.1 正常組與PE組患者的一般資料比較 PE組分娩時(shí)體重、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、平均動(dòng)脈壓、早產(chǎn)率及小于孕齡兒(small for gestational age infant,SGA)比例均高于正常對(duì)照組,而分娩孕周和新生兒出生體重均低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 PE組與Control組患者一般資料比較

2.2 WNT5A在PE胎盤中表達(dá)降低 RT-qPCR結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,PE組胎盤組織中WNT5A表達(dá)水平明顯降低(P<0.0001)(圖1)。

圖1 WNT5A在PE胎盤組織中表達(dá)水平****P<0.001

2.3 胎盤WNT5A mRNA水平與PE嚴(yán)重程度相關(guān) 與對(duì)照組相比,PE組血清肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amintransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但各項(xiàng)指標(biāo)均在臨床正常值范圍內(nèi)(表2)。胎盤WNT5A可較好地用于評(píng)估PE嚴(yán)重程度,曲線下面積(area under curve,AUC)為0.844(95%CI為0.74～0.95,P<0.001)(圖2)。

圖2 胎盤WNT5A水平與PE嚴(yán)重程度相關(guān)

表2 PE組與Control組患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.4 WNT5A促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲并抑制β-catenin活性 HTR8/SVneo細(xì)胞暴露于含人重組WNT5A蛋白(200ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基中并進(jìn)行Transwell侵襲力測(cè)定,結(jié)果顯示,WNT5A處理組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)(圖3A)。人原代EVT細(xì)胞中,Western blot法結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比,WNT5A處理組降低活化β-catenin蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

2.5 BMP2下調(diào)WNT5A表達(dá) HTR8/SVneo細(xì)胞經(jīng)人重組BMP2蛋白(25ng/mL)處理24h后,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNAseq)結(jié)果火山圖顯示W(wǎng)NT5A mRNA水平顯著降低(圖4A);差異顯著的基因主要富集于“TGF-β信號(hào)通路”、“WNT信號(hào)通路”和“細(xì)胞黏附”等相關(guān)的信號(hào)通路中(圖4B)。

圖4 BMP2處理人滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序分析A:BMP2和空白對(duì)照處理后(n=3)差異表達(dá)基因的火山圖;B:差異表達(dá)基因所在的信號(hào)通路富集分析結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNAseq結(jié)果,使用25ng/mL人重組BMP2蛋白分別處理HTR8/SVneo和人類原代EVT細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置3、6、12、24h時(shí)間梯度,RT-qPCR結(jié)果表明BMP2降低了HTR8/SVneo細(xì)胞和人類原代EVT細(xì)胞中WNT5A mRNA水平(圖5A、B)。Western blot法結(jié)果顯示,BMP2降低了WNT5A蛋白表達(dá)水平,但增加了細(xì)胞內(nèi)活化的β-catenin蛋白水平(圖5C～H)。

圖5 BMP2對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞WNT5A和β-catenin表達(dá)的影響A、B:RT-qPCR檢測(cè)WNT5A mRNA表達(dá);C～H:Western blot法檢測(cè)WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá);*P<0.05,**P<0.01,****P<0.01

2.6 BMP2通過激活SMAD1/5/9-SMAD4通路負(fù)調(diào)控WNT5A表達(dá) HTR8/SVneo細(xì)胞先用DMSO或BMP2受體抑制劑DMH-1預(yù)處理1h,經(jīng)人重組BMP2蛋白(25ng/mL)或空白對(duì)照處理24h,RT-qPCR結(jié)果顯示BMP2受體抑制劑DMH-1預(yù)處理可阻斷BMP2對(duì)WNT5A mRNA水平的下調(diào)(圖6A)。Western blot法結(jié)果顯示BMP2可上調(diào)磷酸化的SMAD1/5/9蛋白的表達(dá)(圖6B),并且DMH-1預(yù)處理可消除BMP2介導(dǎo)的這一作用(圖6C)。

圖6 BMP2受體抑制劑DMH-1阻斷BMP2激活SMAD1/5/9通路介導(dǎo)的WNT5A下調(diào)A:RT-qPCR測(cè)定WNT5A mRNA表達(dá);B:Western blot法檢測(cè)SMAD1/5/9蛋白表達(dá);C:Western blot法檢測(cè)磷酸化SMAD1/5/9蛋白表達(dá)

2.7 WNT5A參與PE發(fā)生的作用模式圖 母胎界面WNT5A表達(dá)不足通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程,引起胎盤發(fā)育異常,導(dǎo)致PE發(fā)生(圖7)。

3 討 論

PE是妊娠期常見的胎盤源性疾病,嚴(yán)重影響母胎健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期胎兒死亡的主要原因之一[13]。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為,妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲受損和胎盤螺旋動(dòng)脈重塑不足是PE發(fā)生發(fā)展中的重要事件,而蛻膜化異常在PE發(fā)生過程中的作用亦得到越來越多的關(guān)注[14]。在胎盤形成和母胎界面建立的過程中,人類滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)子宮內(nèi)膜這一過程受到多種分子的精確調(diào)控。已有研究報(bào)道WNT5A在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力參與PE發(fā)生過程中的作用,但BMP2信號(hào)通路與WNT5A抑制的Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的相互作用及其在PE發(fā)生機(jī)制中的作用尚未明確。

WNT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化、組織再生和器官穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與母胎界面建立以及妊娠維持密切相關(guān)[15-17]。WNT通路包括經(jīng)典β-catenin依賴通路和非經(jīng)典非β-catenin依賴通路。經(jīng)典WNT信號(hào)通路分子如WNT2、WNT4、β-catenin等在胎盤多種細(xì)胞中表達(dá),可通過調(diào)控蛻膜細(xì)胞或滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為參與PE的發(fā)生發(fā)展[18-20]。然而非經(jīng)典WNT通路分子在調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞行為及PE進(jìn)程中的作用目前仍存爭(zhēng)議。WNT5A是非經(jīng)典WNT信號(hào)通路的重要配體,并且能通過抑制或促進(jìn)其他WNT配體的表達(dá)影響經(jīng)典WNT通路。WNT5A在多種腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,但其作用存在較大異質(zhì)性,如在卵巢癌中WNT5A可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和侵襲過程;而在乳腺癌中WNT5A被認(rèn)為可抑制腫瘤細(xì)胞的EMT和侵襲[21]。在女性生殖系統(tǒng)中,WNT5A存在胎盤成纖維細(xì)胞、胎盤巨噬細(xì)胞和多種滋養(yǎng)細(xì)胞亞型中[22-23],但其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其分子作用機(jī)制亟待進(jìn)一步明確。Chen等研究發(fā)現(xiàn),WNT5A可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[24]。本研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充人重組WNT5A蛋白可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲,這與Takahashi等研究結(jié)果一致[7,9,25]。本研究發(fā)現(xiàn),WNT5A處理后β-catenin的活性被抑制,這與先前在人類絨毛膜癌中的研究結(jié)果相一致[26]。本研究還發(fā)現(xiàn),PE患者胎盤組織中WNT5A表達(dá)水平顯著下調(diào),提示W(wǎng)NT5A表達(dá)受損可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,從而參與PE發(fā)生。

TGF-β超家族成員BMP2在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的多種亞型中均有表達(dá),已被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜蛻膜化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[27]。蛻膜化過程異常能導(dǎo)致胚胎著床時(shí)期的子宮微環(huán)境發(fā)生改變,影響隨后的滋養(yǎng)細(xì)胞分化及胎盤發(fā)育[28]。既往研究表明,在成骨分化過程中,BMP2與WNT信號(hào)通路關(guān)系密切[29]。骨分化與滋養(yǎng)細(xì)胞分化有一定相似性,本研究基于外源性人重組BMP2蛋白處理的人滋養(yǎng)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄圖譜結(jié)果,并在人滋養(yǎng)細(xì)胞系和原代EVT細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)BMP2可顯著下調(diào)WNT5A表達(dá),上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活化β-catenin水平。隨后對(duì)BMP2調(diào)控下游基因表達(dá)的經(jīng)典SMAD信號(hào)通路檢測(cè),發(fā)現(xiàn)BMP2可激活經(jīng)典SMAD1/5/9通路負(fù)調(diào)控WNT5A的表達(dá),并且這一作用可被BMP2受體抑制劑所阻斷。以上發(fā)現(xiàn)提示,BMP2可通過激活經(jīng)典的SMAD1/5/9通路抑制WNT5A表達(dá),從而降低了WNT5A對(duì)于經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路的抑制,進(jìn)而影響PE病理進(jìn)程。

綜上所述,WNT5A在PE患者胎盤組織中表達(dá)降低,其表達(dá)受到BMP2及激活的SMAD1/5/9信號(hào)通路調(diào)控。母胎界面WNT5A表達(dá)不足通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程,引起胎盤發(fā)育異常,導(dǎo)致PE發(fā)生。本研究為后續(xù)揭示W(wǎng)NT5A在PE發(fā)生發(fā)展中潛在作用的研究提供了創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但由于PE病因的復(fù)雜性和疾病分類的多樣性,本研究未對(duì)WNT5A在特定臨床背景下對(duì)PE的調(diào)控作用進(jìn)行探究,如早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE之間胎盤病變存在的差異等,且研究納入的樣本量相對(duì)較少,未來仍有待進(jìn)一步的深入研究。