国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

三生調(diào)脂舒對糖尿病血糖波動大鼠Lp-PLA2活性表達(dá)的影響

2023-11-07 11:33王柔鈞季章龍侯建婷謝文皎
關(guān)鍵詞:調(diào)脂造模主動脈

丁 喆,李 軍,朱 燕,王柔鈞,季章龍,侯建婷,謝文皎

隨著我國步入老齡化社會及人民生活飲食方式的變化,糖尿病發(fā)生率逐年升高[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國糖尿病病人已超過1億例,成為威脅我國人民生活健康的重要疾病[2]。糖尿病的主要死因并非血糖升高,而是由血糖升高帶來的一系列并發(fā)癥,這些并發(fā)癥需積極防治并抑制其進(jìn)展,否則威脅病人生命[3]。相關(guān)研究顯示,通過積極地降低血糖對部分病人仍不能有效抑制并發(fā)癥進(jìn)展,分析原因可能是由于血糖波動影響的[4]。糖尿病病人血糖波動幅度大,目前并無藥物控制血糖波動,因此,如何有效調(diào)節(jié)血糖的波動是目前的研究熱點。三生調(diào)脂舒是我院心血管內(nèi)分泌科的多年經(jīng)驗用方,已在臨床中得到較好應(yīng)用,可治療高脂血癥、動脈硬化及糖尿病,特別是在調(diào)節(jié)血脂方面。前期實驗顯示,三生調(diào)脂舒具有多靶點調(diào)脂的功效[5]。三生調(diào)脂舒在糖尿病中的作用機(jī)制尚未明確。本研究構(gòu)建了糖尿病血糖波動動物模型,以脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein phospholipase 2,Lp-PLA2)為核心指標(biāo)觀察三生調(diào)脂舒對其的作用,使本藥用于糖尿病病人的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、動物與材料

1.1.1 實驗藥物

三生調(diào)脂舒購自我院藥房[昆明市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑,批號:滇藥制字(Z)20082311A],主要由制何首烏、三七、薏苡仁、山楂等構(gòu)成,使用時沖泡即可,每克藥物相當(dāng)于原生藥1.7 g。

1.1.2 實驗動物

雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠90只,體質(zhì)量180~220 g,所有大鼠均購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物合格證號:SCXK(滇)K2020-0004],飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,由中央空調(diào)統(tǒng)一控制溫度和濕度,室溫20~26 ℃,濕度50%~60%,日常采用日光燈給予生活,12 h光暗循環(huán)。飼料和水均自由攝取。

1.1.3 實驗試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)(美國Sigma公司,貨號:V900890);胰島素(來源于豬胰腺)(江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司,貨號:Y0001717);逸智型血糖儀和血糖試紙(德國羅氏公司);大鼠Lp-PLA2測定試劑盒(上海博湖生物科技有限公司,貨號:BH-R101083);C肽測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號分別為H391-1、A003-1-2和A001-3-2);白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)測定試劑盒、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)測定試劑盒和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)測定試劑盒(上海酶聯(lián)免疫生物科技公司,貨號分別為ml028513、ml102828和ml002859);三酰甘油(triacylglycerol,TG)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測定試劑盒和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1和A113-1-1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立

90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,2周后隨機(jī)選取10只作為正常組(Con組),其余80只參照文獻(xiàn)[6]方法建立糖尿病大鼠動物模型,給予腹腔注射1%STZ的檸檬酸緩沖液建立糖尿病大鼠模型(劑量為60 mg/kg,為準(zhǔn)確比較,Con組大鼠給予注射不含有STZ的檸檬酸緩沖液)。注射48 h后,每日09:00~10:00尾靜脈采集大鼠血液監(jiān)測血糖,當(dāng)連續(xù)3 d血糖均≥16.7 mmol/L確認(rèn)造模成功,對造模不成功的大鼠,于第4日注射STZ(30 mg/kg)再次造模,直到所有大鼠均造模成功為止。本研究共造模成功60只大鼠,造模過程中死亡20只。

1.2.2 血糖波動動物模型的建立

參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]報道,造模成功大鼠再次適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,選取10只作為持續(xù)糖尿病高血糖組,其余50只構(gòu)建血糖波動模型。波動模型的建立方法:每日08:00~08:30、14:00~14:30注射0.38 g/kg 50%葡萄糖溶液,注射30 min后,注射1次胰島素(根據(jù)血糖濃度調(diào)節(jié)胰島素的注射量,統(tǒng)計單位注射量4~12 U),上述血糖波動模型連續(xù)給藥6周(為保證結(jié)果具有可比性,持續(xù)高糖組及正常組腹腔注射等量生理鹽水),在造模過程中,死亡8只大鼠,最后剩余42只大鼠成功構(gòu)建血糖波動模型。血糖波動模型構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)為6周后,測量9個時間點(08:00、09:00、10:00、11:00、12:00、15:00、16:00、17:00、18:00)的血糖,并繪制血糖變化趨勢曲線,從圖中可見血糖波動組血糖變化較大,證明造模成功。詳見圖1。

圖1 造模期不同時間血糖比較

1.2.3 動物分組

Con組10只,持續(xù)糖尿病高血糖組(Model-1組)10只,其余42只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病血糖波動對照組(Model-2組,12只)、三生調(diào)脂舒低劑量組(SSTZS-L組,10只),三生調(diào)脂舒中劑量組(SSTZS-M組,10只)及三生調(diào)脂舒高劑量組(SSTZS-H組,10只)。

1.2.4 藥物干預(yù)方法

干預(yù)時將三生調(diào)脂舒溶于蒸餾水,之后按照SSTZS-L組、SSTZS-M組和SSTZS-H組分別以0.5、1.0和2.0 g/(kg·d)三生調(diào)脂舒灌胃,Con組、Model-1組、Model-2組給予等體積的蒸餾水灌胃,干預(yù)時間為6周。6周的干預(yù)時間內(nèi),Model-1組死亡1只,Model-2組死亡4只,SSTZS-L組和SSTZS-H組各死亡1只,死亡原因均為糖尿病并發(fā)癥。最終Con組10只,Model-1組9只,Model-2組8只,SSTZS-L組9只,SSTZS-M組10只,SSTZS-H組9只進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 血液和組織收集方法

1)血清收集:末次給藥結(jié)束后,分批將所有大鼠禁食12 h,于次日09:00腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉,麻醉后剖開腹腔,剪開胸隔膜,找到心尖處,收集大鼠血液,采用低溫高速離心機(jī),4 ℃條件下,以3 000 r/min離心10 min后,收集上清液,2~8 ℃保存,進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)檢測。2)腹主動脈收集:血液收集結(jié)束后,找出腹主動脈后取出,將其裁剪成2段,一段置于4%的多聚甲醛溶液中用于組織病理學(xué),另一段置于超低溫冰箱中用于蛋白表達(dá)檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血糖檢測方法

1)腹腔糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT):用藥結(jié)束后按照美國糖尿病并發(fā)癥動物模型協(xié)會制定的IPGTT操作[8]進(jìn)行,實驗前1 d嚴(yán)格禁食但不禁水12 h,于次日將每只大鼠進(jìn)行稱重,尾靜脈取血后,采用血糖試紙快速測定空腹血糖;配制25%的葡萄糖生理鹽水溶液,按照大鼠體重給予腹腔注射2.5 g/kg處理,注射后立即計時,分別于注射后0、30、60、120和180 min收集大鼠血液,采用血糖試紙對其進(jìn)行血糖檢測并繪圖。2)血糖波動:平均血糖波動幅度(mean amplitude of glycemic excursions,MAGE)檢測參照文獻(xiàn)[9]報道方法:治療結(jié)束后,測體質(zhì)量及1 d內(nèi)測定4次隨機(jī)血糖。根據(jù)下列公式計算MAGE,MAGE=∑(λ/x),其中λ為每次血糖波動的最大值和最小值之差,x為有效波動的次數(shù),ν為24 h平均血糖SD值。3)葡萄糖曲線下面積(area under curve of glucose,AUG):根據(jù)常規(guī)血糖檢測的IPGTT結(jié)果繪制血糖曲線圖,并計算AUG。AUG=(G0+G120)/2+G30+G60。

1.3.2 生化指標(biāo)

Lp-PLA2、C肽、MDA、SOD、IL-1α、IL-6、TNF-α、TG、TC、HDL-C和LDL-C均根據(jù)試劑盒提供的說明書嚴(yán)格進(jìn)行,結(jié)束后根據(jù)試劑盒提供的計算公式得到所測指標(biāo)的數(shù)值。

1.3.3 組織病理學(xué)改變

采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察腹主動脈病理學(xué)改變,將腹主動脈從多聚甲醛溶液中取出,交由武漢塞維爾公司完成(按照常規(guī)方法,依次經(jīng)脫水、切片及HE染色即可),返回切片后,采集圖像,每張圖片選取4個不同的視野。

1.3.4 相關(guān)蛋白表達(dá)

將腹主動脈從超低溫冰箱取出,研磨后采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白,之后采用二喹啉甲酸(BCA)法對其進(jìn)行定量并調(diào)平,上述完成后每組各取20 μg蛋白溶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳完成后裁剪目的蛋白的凝膠,采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,之后采用5%的脫脂牛奶封閉2 h,洗滌3次。一抗封閉過夜,洗滌3次,二抗封閉30 min后,洗滌3次,完成后采用蛋白顯影系統(tǒng)將其顯影即完成。采用Image J計算各條帶灰度值,進(jìn)行比較分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)期內(nèi)均正常,飲食飲水良好,毛色光順發(fā)白,反應(yīng)靈敏。糖尿病模型造模成功后,Con組無顯著變化,造模組大鼠表現(xiàn)為明顯消瘦、精神不振,毛發(fā)枯燥發(fā)黃且不順,反應(yīng)遲鈍及動作遲緩。血糖波動模型構(gòu)建成功后,基本情況和糖尿病模型構(gòu)建成功后無明顯差異。給藥后上述情況有一定的好轉(zhuǎn)。

2.2 各組治療后IPGTT各時間血糖比較

記錄的5個時間點(0、30、60、120、180 min),與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組血糖均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);30、60、120、180 min時,Model-2組血糖高于Model-1組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組治療后IPGTT各時間血糖比較(±s) 單位:mmol/L

2.3 各組大鼠血糖波動情況比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組MAGE和AUG均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組MAGE和AUG低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組MAGE和AUG高于Model-1組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血糖波動情況比較(±s)

2.4 各組大鼠血脂指標(biāo)比較

與Con組相比,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組TC、TG和LDL-C均升高(P<0.05),HDL-C降低(P<0.05);SSTZS各劑量組TC、TG和LDL-C低于Model-1組和Model-2組(P<0.05),HDL-C高于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組TC、TG和LDL-C高于Model-1組(P<0.05),HDL-C低于Model-1組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血脂指標(biāo)比較(±s) 單位:mmol/L

2.5 各組大鼠血清炎性因子含量比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組炎性因子指標(biāo)IL-1α、IL-6和TNF-α均升高(P<0.05);SSTZS各劑量組IL-1α、IL-6和TNF-α均低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組IL-1α、IL-6和TNF-α高于Model-1組(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清炎性因子比較(±s)

2.6 各組大鼠血清氧化和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組MDA升高(P<0.05),SOD和C肽降低(P<0.05);SSTZS各劑量組MDA低于Model-1組和Model-2組(P<0.05),SOD和C肽高于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組MDA高于Model-1組(P<0.05),SOD和C肽低于Model-1組(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清氧化和抗氧化因子比較(±s)

2.7 腹主動脈病理學(xué)改變

各組大鼠腹主動脈HE染色結(jié)果可見:Con組細(xì)胞排列整齊規(guī)則,血管壁纖維呈規(guī)則狀;Model-1組細(xì)胞核排列明顯紊亂,且血管內(nèi)的纖維走向紊亂;Model-2組細(xì)胞核紊亂程度進(jìn)一步加劇,同時纖維走向明顯散亂;與Model-1組和Model-2組比較,SSTZS各劑量組明顯好轉(zhuǎn)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈血管改變(HE染色,×64)

2.8 各組大鼠血清、腹主動脈Lp-PLA2含量比較

與Con組比較,Model-1組、Model-2組及SSTZS各劑量組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達(dá)升高(P<0.05);SSTZS各劑量組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達(dá)低于Model-1組和Model-2組(P<0.05);Model-2組血清和腹主動脈Lp-PLA2表達(dá)高于Model-1組(P<0.05)。詳見圖3、表6。

表6 各組大鼠血清、腹主動脈Lp-PLA2含量比較(±s) 單位:μg/L

圖3 各組大鼠腹主動脈Lp-PLA2蛋白表達(dá)條帶圖(A為Con組;B為Model-1組;C為Model-2組;D為SSTZS-L組;E為SSTZS-M組;F為SSTZS-H組)

3 討 論

糖尿病歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇[10]。關(guān)于此病的描述最早見于《素問·奇病論》[11],書中將糖尿病描述為“脾癉”,核心為五氣之溢,“五味入口,藏于胃,脾則行之精氣,津液在脾中不能化則可至人口甘,此肥美所發(fā)地,此類人喜歡吃甜膩食品,長期以此則造成消渴”。三生調(diào)脂舒是我科研發(fā)的一種具有改善脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)的中藥制劑,已在臨床中應(yīng)用超過15年,立意點為“調(diào)養(yǎng)脾腎、活血化瘀、化痰泄?jié)帷?由三七、山楂、制何首烏、薏苡仁等組成,其中制何首烏為君,補腎益肝、化濁降脂;薏苡仁為臣,健脾滲濕、補中益氣;同時佐以生三七以實現(xiàn)行血活血、破瘀散結(jié),佐以山楂以實現(xiàn)活血散瘀、化痰行氣。四味中藥共奏補肝益腎、活血化痰、疏肝健脾,標(biāo)本兼顧、補脾益腎同時疏通氣滯、血瘀、痰阻等標(biāo)實[12-14]。多數(shù)糖尿病病人均表現(xiàn)為脾腎不足、血瘀痰阻,三生調(diào)脂舒的立意和糖尿病的發(fā)生機(jī)制具有明顯的相關(guān)性。臨床和動物實驗研究表明,三生調(diào)脂舒對高脂血癥具有明顯的調(diào)節(jié)作用,可降低2型糖尿病病人超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平[15-16]。根據(jù)中醫(yī)“異病同治”的理論,結(jié)合前期研究工作,推測三生調(diào)脂舒可能對糖尿病血糖波動具有一定的作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血管特異性炎癥標(biāo)志物L(fēng)p-PLA2有關(guān)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,糖尿病是以血漿或血清葡萄糖升高為主要特點的一類代謝性疾病,引起血糖升高的主要因素為胰島素分泌缺陷或胰島素作用缺陷,降糖藥物可降低血糖,但部分病人不能較好地控制相關(guān)并發(fā)癥的進(jìn)展[17-18]。血糖波動可能是造成糖尿病病人控制好血糖但并發(fā)癥仍然進(jìn)展的原因[19]。血糖波動是指病人血糖水平在每日高峰和低谷之間變化不穩(wěn)定的一種狀態(tài),與胰島素功能、飲食、藥物及運動等密切相關(guān),核心為胰島素水平分泌不足或胰島素效應(yīng)不足造成的血糖波動有關(guān)[20]。為此,本研究構(gòu)建了血糖波動動物模型,觀察三生調(diào)脂舒對其的作用,結(jié)果顯示,血糖波動的糖尿病大鼠模型相較于血糖穩(wěn)定的大鼠模型具有高水平的血糖值和波動幅度,提示造模成功。另一方面間接說明血糖波動的糖尿病可能危害更大,采用三生調(diào)脂舒干預(yù)后,大鼠血糖和血糖波動指標(biāo)MAGE和AUG均降低,表明三生調(diào)脂舒可改善糖尿病血糖波動大鼠血糖水平及血糖波動狀態(tài)。

糖尿病血脂異常、炎癥反應(yīng)長期存在、抗氧化能力降低是造成糖尿病病人并發(fā)癥的核心因素,特別是動脈粥樣硬化和冠心病等[21]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,Model-1組和Model-2組血脂、炎性因子及抗氧化指標(biāo)異常,表現(xiàn)為血脂TG、TC和LDL-C升高,HDL-C降低,炎性因子指標(biāo)IL-1α、IL-6和TNF-α升高,抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和C肽降低,氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA升高,Model-2組異常程度高于Model-1組。提示糖尿病血糖波動相較于普通糖尿病具有明顯的血脂異常情況、炎癥反應(yīng)及抗氧化能力降低。與Model-2組相比,三生調(diào)脂舒干預(yù)后,上述指標(biāo)均明顯好轉(zhuǎn),提示三生調(diào)脂舒可改善血脂,降低炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。同時本研究觀察了糖尿病大鼠腹主動脈的變化:Con組細(xì)胞排列整齊有規(guī)則,血管壁纖維呈規(guī)則狀;Model-1組和Model-2組細(xì)胞核紊亂程度進(jìn)一步加劇,同時纖維走向明顯散亂,血糖波動組嚴(yán)重,提示糖尿病血糖波動具有一定的動脈損傷,三生調(diào)脂舒治療后明顯好轉(zhuǎn)。分析與Lp-PLA2相關(guān),Lp-PLA2又稱為血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH),是一種炎性細(xì)胞(主要包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞),促使氧化磷脂水解的磷脂酶[22]。Lp-PLA2又反作用生成溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸等因子在內(nèi)的多種脂類促炎性因子,造成IL-1α、IL-6和TNF-α等指標(biāo)升高,最終導(dǎo)致動脈粥化硬化或冠心病的發(fā)生[23]。IL-1α、IL-6和TNF-α等炎性因子與抗氧化能力降低密切相關(guān),可與SOD和C肽等協(xié)同作用造成機(jī)體抗氧化能力降低、動脈硬化及糖尿病等相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[24-25]。本研究結(jié)果也顯示,與Con組相比,Model-1組和Model-2組血清和腹主動脈組織Lp-PLA2升高,與文獻(xiàn)報道[25]一致,這可能是糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生的因素之一。采用三生調(diào)脂舒干預(yù)后,血清和腹主動脈組織Lp-PLA2含量均降低,提示三生調(diào)脂舒可能對糖尿病血糖波動大鼠血液和腹主動脈組織Lp-PLA2具有一定的抑制作用。

綜上所述,三生調(diào)脂舒對糖尿病大鼠血糖波動具有明顯的調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Lp-PLA2表達(dá),進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)、提高抗氧化能力水平有關(guān)。

猜你喜歡
調(diào)脂造模主動脈
胸主動脈阻斷聯(lián)合主動脈旁路循環(huán)技術(shù)建立大鼠脊髓缺血損傷模型
腎陽虛證動物模型建立方法及評定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展
脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥動物模型造模方法及模型評價
濕熱證動物模型造模方法及評價研究
食欲不振喝點山楂茶
依折麥布聯(lián)合辛伐他汀用于冠心病調(diào)脂治療未達(dá)標(biāo)患者49例
更 正
潤腸通便功能試驗中造模劑的選擇
護(hù)理干預(yù)預(yù)防主動脈夾層介入治療術(shù)后并發(fā)癥
胸腹主動脈置換術(shù)后感染并發(fā)癥救治一例