尤紅俊,趙倩倩,茍棋玲,董夢雅

特發(fā)性擴張型心肌病(pediatric idiopathic dilated cardiomyopathy,PIDC)是兒童常見的心肌病,是造成兒童心力衰竭的主要原因之一,同時導致惡性心律失常、血栓栓塞和猝死在內的一系列不良結局。目前小兒擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)的早期診治水平不斷提高,但病因不明、缺乏精準治療,此類患兒預后不容樂觀[1-2]。本研究基于基因表達綜合數據庫(gene expression omnibus,GEO)中PIDC的二代測序數據,尋找疾病的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),通過基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析探討發(fā)病機制,并構建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡,篩選其中的核心基因,整合其與心肌病及心力衰竭風險的關系,輔以免疫細胞浸潤分析,尋找疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵基因,為疾病的精準靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 數據下載及預處理

在GEO[3-4]中搜索“pediatric idiopathic dilated cardiomyopathy”,選取數據集GSE99321,其由美國科羅拉多大學藥理學系Tatman P等科研人員免費提供,采用GPL16791 Illumina HiSeq 2500 (Homo sapiens)為平臺,收錄14例小兒左心室組織二代測序數據,其中7例小兒PIDC作為試驗組,另7例無心力衰竭小兒作為對照組。數據進行歸一化預處理。

1.2 差異表達分析

采用統(tǒng)計軟件R語言(版本4.1.1)“DESeq2”[5]包進行差異基因表達分析。以|log2(fold change)|≥1,P<0.05為DEGs的篩選條件。運用R語言ggplot2和pheatmap包繪制火山圖和熱圖,進行DEGs可視化分析。

1.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析

使用R語言clusterProfiler和org.Hs.eg.db(Homo sapiens)包對DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析[6-7]。GO富集分析分別在生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)三方面對基因進行功能注釋[8]。KEGG分析展示基因參與的信號通路。利用R語言ggplot2包將結果可視化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 PPI網絡分析

將DEGs導入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,http://string-db.org/cgi/input.pl),進行PPI網絡分析[9]。設定可信度confidence為0.4,輸出TSV格式文件,用于Cytoscape分析[10]。

1.5 核心基因篩選

使用Cytoscape 3.7.3 軟件插件CytoHubba篩選出PPI網絡中的核心基因。CytoHubba利用12種評分策略剖析PPI網絡,包括最大相關準則(maximum correlation criterion,MCC)、度值(Degree值)等,該12種拓撲算法無優(yōu)劣之分[11]。MCC代表基因/蛋白間最大相關性標準,以MCC值排序,居前5位的基因為PPI網絡的核心基因。

1.6 利用CTD數據庫評估核心基因與心肌病和心力衰竭的關聯(lián)性

利用比較毒理基因組學數據庫(comparative toxicogenomics database,CTD)(http://ctdbase.org/)分析核心基因與心肌病及心力衰竭風險的關系。CTD整合了化合物-基因/蛋白質相互作用、化合物-疾病和基因-疾病關系的信息,探索與疾病機制相關的假設[12]。

1.7 免疫細胞浸潤分析

單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)[13]根據表達譜計算每個基因的rank值,分析得到每個樣本的免疫細胞的相對含量,有助于了解疾病狀態(tài)下組織中所有免疫細胞的浸潤情況,探討其與疾病轉歸的關系。采用ssGSEA算法分析PIDC中28種免疫細胞在免疫浸潤微環(huán)境中的比例。運用R語言pheatmap包和vioplot包繪制熱圖和小提琴圖進行可視化免疫細胞浸潤分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基因差異表達分析

對原始矩陣數據進行歸一化處理(見圖1A、圖1B)后,與對照組比較,PIDC左心室組織中有137個DEGs,其中70個表達上調、67個表達下調。對DEGs繪制火山圖進行可視化分析(見圖1C)。取差異顯著前100個基因繪制熱圖(見圖1D)。

圖1 PIDC基因差異表達分析(A為原始矩陣數據歸一化處理前;B為原始矩陣數據歸一化處理后;C為基因差異表達分析火山圖;D為基因差異表達分析熱圖。其中紅色表示上調;藍色表示下調)

2.2 DEGs富集分析

GO功能富集分析顯示:DEGs主要參與對外部刺激的正向調節(jié)、炎癥反應的調節(jié)、中性粒細胞的激活和介導的免疫、細胞-基質黏附的正向調節(jié)、細胞外結構、含膠原的細胞外基質等。詳見圖2A。KEGG通路富集分析顯示:DEGs參與細胞凋亡、胰島素抵抗、花生四烯酸代謝和缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號通路等。詳見圖2B。

圖2 GO功能富集和KEGG通路富集分析氣泡圖(A為GO富集分析;B為KEGG富集分析)

2.3 PPI網絡分析及核心基因篩選

對DEGs進行PPI網絡分析,將離散節(jié)點隱去后,構建的初始PPI網絡中節(jié)點(基因/蛋白)135個、邊(蛋白互作關系)186條,平均節(jié)點度值為2.76,PPI富集P值<1.0e-16。輸出TSV格式文件并導入Cytoscape軟件,以CytoHubba插件進行拓撲計算,取MCC排名居前5位的基因作為核心基因,即信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activitor of transcription 3,STAT3)、CD68、高親和力IgE受體γ亞基基因(high-affinity IgE receptor gamma subunit gene,FCER1G)、細胞周期蛋白D1(cyclinD1,CCND1)和CD163。亮色標記的節(jié)點為核心基因,顏色深淺代表MCC值大小,共36個節(jié)點、100個邊,詳見圖3A。以分組比較呈現兩組5個核心基因的差異表達,詳見圖3B。

圖3 差異基因構成的PPI網絡中鑒定核心基因及分組比較(A為鑒定核心基因;B為分組比較柱狀圖。＊P<0.05,＊＊P<0.01。色彩鮮明的節(jié)點為5個核心基因)

2.4 核心基因與心肌病、心力衰竭的關系

核心基因與心肌病、心力衰竭的相互作用評分分析提示,5個核心基因STAT3、CD68、FCER1G、CCND1和CD163與心肌病、心力衰竭關聯(lián)緊密。詳見圖4?？梢姾诵幕蚺c心肌病、心力衰竭關聯(lián)性得分情況,得分越高提示關聯(lián)性越大。

2.5 免疫細胞浸潤分析

與對照組比較,試驗組左心室組織中央記憶型CD8+T細胞含量較高,活化的樹突樣細胞、骨髓來源的抑制性細胞、自然殺傷T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、濾泡輔助性T細胞含量較低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。圖中紅色表示上調,藍色表示下調。

圖5 PIDC免疫細胞浸潤分析熱圖

圖6 PIDC免疫細胞浸潤分析小提琴圖

3 討 論

PIDC具有較高的發(fā)病率、死亡率,是小兒心臟移植的主要原因之一,嚴重威脅兒童身心健康。該病發(fā)病機制復雜,尚未明確,因而治療難度較大。本研究基于生物信息學分析,探討免疫相關的分子機制,并篩選出核心基因及浸潤的免疫細胞,從而為探討疾病機制、尋求治療靶點提供理論依據。

首先,本研究發(fā)現PIDC左心室組織中存在137個DEGs。其次,GO功能富集和KEGG通路富集分析發(fā)現DEGs的功能主要集中在對外部刺激的正向調節(jié)、炎癥反應的調節(jié)、中性粒細胞的激活和介導的免疫、細胞-基質黏附的正向調節(jié)、細胞外結構、含膠原的細胞外基質等;這些差異基因主要富集在細胞凋亡、胰島素抵抗、花生四烯酸代謝和HIF-1信號通路等。免疫介導的炎癥損傷是DCM發(fā)生發(fā)展中的關鍵過程之一[14]。已有研究報道,炎癥反應由凋亡分子Fas配體(Fas ligand,FasL)通過心肌細胞和成纖維細胞中的細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular-signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)被激活,最終誘導DCM和心力衰竭的發(fā)生。阻斷ERK1/2通路、抑制炎癥等可阻止疾病的進展[15]。有研究顯示,DCM中炎癥趨化因子水平顯著升高[16]。中性粒細胞作為炎癥反應的重要參與者,其水平的高低與DCM心力衰竭的嚴重程度相關[17]。心臟細胞外基質是一個動態(tài)分子網絡,為心臟功能提供結構支撐。細胞-基質相互作用的改變、細胞外基質重塑被認為是心肌擴張過程中細胞重構的重要組成部分[18-19]。細胞外基質重塑通過影響細胞歸巢、成纖維細胞激活、局部黏附蛋白表達參與DCM等,導致心力衰竭發(fā)生發(fā)展[20]。

同時本研究結果顯示,細胞凋亡是PIDC發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵致病因素之一。轉錄因子p53是人體重要的管家基因,可維持正常的心臟結構和生理功能。已有研究報道,p53水平升高促進DCM中的心臟重構,這可能是通過誘導細胞凋亡、細胞周期停滯實現的[21]。有研究顯示,基因PPP1R13L雙等位變異與PIDC強烈相關,而PPP1R13L的功能是編碼p53蛋白的促凋亡蛋白抑制劑[22]。阿霉素作為一種化療藥物,可提高腫瘤病人生存率,但其誘導DCM的作用也有報道,認為這種不良反應是阿霉素通過增加線粒體膜通透性,進而增加心肌細胞凋亡實現的[23]。本研究結果顯示,胰島素抵抗在PIDC中有致病作用。胰島素抵抗通過增加游離脂肪酸氧化,造成心肌細胞能量代謝障礙,促進DCM的形成;反之,DCM通過促炎細胞因子釋放、兒茶酚胺等激素釋放,交感神經系統(tǒng)的激活,進一步加重胰島素抵抗[24]。上述研究均提示,干預細胞凋亡和胰島素抵抗可能成為PIDC的治療方向。有研究顯示,花生四烯酸CYP450酶代謝的產物可能在克山病和DCM的發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵作用,如CYP2C19基因上調和蛋白表達頻繁可能是一種保護性補償反應,而CYP1A1可能加重心肌損傷[25]。本研究富集分析結果顯示,差異基因顯著參與花生四烯酸代謝通路,提示該通路可能作為PIDC心力衰竭治療的靶點[26]。HIF-1是缺氧/缺血血管反應的主要調節(jié)因子,驅動數百個基因的轉錄激活,涉及血管反應、血管生成及骨髓源性血管生成細胞的動員和歸巢[27]。特發(fā)性擴張型心肌病表現為血管生成缺陷,且心外膜血管疏松與HIF-1增加相關[28]。本研究發(fā)現多個基因以下調方式參與HIF-1信號通路中,提示該通路可能被抑制。干預HIF-1信號通路,可影響心肌血管生成,可能是PIDC的治療靶點之一。

其次,本研究通過PPI網絡分析篩選了5個與心肌病及心力衰竭關系密切的核心基因。STAT3是對心臟具有保護作用的轉錄因子,STAT3的激活通過增強心肌細胞的預適應和后適應、抗炎、誘導生存基因表達、維持線粒體功能等多種方式發(fā)揮心臟保護作用。既往研究顯示,STAT3通路的下調可誘發(fā)DCM的心肌不良重構[29]。有研究表明,心肌細胞特異性STAT3通過維持肌萎縮蛋白和α-肌聚糖的表達水平,防止擴張表型的發(fā)生和發(fā)展[30]。本研究發(fā)現STAT3的水平在PIDC中是顯著下調的。CD68是巨噬細胞的標志,目前關于其在心肌病和心力衰竭中作用的研究結果存在爭議。有研究顯示,巨噬細胞作為炎癥過程的重要參與者,其在慢性炎癥的心力衰竭病人中水平顯著升高[31]。相關研究顯示,與健康對照組相比,DCM病人心肌細胞中的巨噬細胞數量無顯著變化[32-33]。CD163是M2型巨噬細胞的標志,其在DCM中的研究結果存在爭議。有研究報道,CD163陽性細胞數量的增加與DCM病人較差的預后顯著相關,是心肌組織中膠原含量的獨立預測因素,可能參與DCM的心室重塑[34]。有研究顯示,CD163水平與DCM的嚴重程度無關[35]。本研究分析發(fā)現CD68和CD163的水平在PIDC病人中均是降低的。這些結果提示巨噬細胞可能通過復雜的機制參與PIDC的發(fā)生發(fā)展,仍需進一步研究。FCER1G作為固有免疫基因,參與炎癥通路,誘導多種疾病發(fā)生[36]。一項體細胞和單細胞RNA測序數據的綜合分析發(fā)現,FCER1G參與DCM的免疫過程[37],其與DCM或心力衰竭的關系,在這2種疾病病理生理狀態(tài)中的作用仍待進一步研究。CCND1是重要的細胞周期調節(jié)蛋白,促進細胞周期從DNA合成前期(G1期)到DNA復制期(S期)的轉換,其水平的上調參與多種腫瘤的進展[38]?；蚣÷?lián)蛋白(TTN)的功能是編碼肌節(jié)中最大的結構蛋白,其截段突變導致TTN缺乏是家族性和散發(fā)性DCM的主要原因。Liao等[39]研究顯示,CCND1上調可抑制TTN缺乏引起的DCM,結果提示TTN不足導致DCM促進心肌細胞的細胞周期治療,CCND1是其中一個重要的治療靶點。核心基因在PIDC的發(fā)病機制仍待研究,可能成為治療PIDC和DCM的新靶點。

最后,本研究進行免疫細胞浸潤分析發(fā)現,與對照組比較,試驗組6種細胞含量有顯著差異。CD8+T細胞在PIDC的心肌組織中含量升高。Luppi等[40-41]研究顯示,DCM病人心肌組織中有CD8+T淋巴細胞浸潤。Rao等[42]進一步研究提示,增多的CD8+T細胞主要位于纖維化的心肌中。上述研究結果提示CD8+T細胞在PIDC的發(fā)病機制,特別在心室重構中發(fā)揮著重要的致病作用。DCM和心力衰竭病人中樹突樣細胞減少[32,43]。本研究分析發(fā)現樹突樣細胞在PIDC的心肌組織中含量降低。關于骨髓來源的抑制性細胞與DCM的研究較少,Zhang等[44]研究顯示,DCM病人循環(huán)中數量顯著升高,且與N末端腦鈉肽前體呈正相關,與左室射血分數呈負相關。本研究分析發(fā)現,骨髓來源的抑制性細胞在PIDC病人心肌組織中減少,不一致的研究結果提示其在DCM發(fā)生發(fā)展中的作用有待進一步研究。本研究發(fā)現,PIDC心肌組織中自然殺傷T細胞含量減少。有研究顯示,自然殺傷T細胞在DCM中含量降低[45]。已有基礎研究顯示,DCM小鼠脾臟中自然殺傷T細胞數量減少,補充外源性的樹突樣細胞可激活體內的自然殺傷T細胞,延長DCM小鼠生存,預防心臟收縮功能下降,抑制間質纖維化[46]。這些結果提示免疫細胞調節(jié)治療可能成為治療DCM的新策略。

綜上所述,炎癥及免疫反應在PIDC的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用,5個核心基因和6種免疫細胞與PIDC發(fā)生發(fā)展密切相關,是其防治的潛在靶點。本研究對PIDC關鍵基因及信號通路進行了分子機制探討,并輔以免疫細胞浸潤分析,后期仍需進一步深入探討免疫浸潤細胞與關鍵基因或通路的關聯(lián)性。