張藎元,劉 巍,劉紅旭,田 偉,連妍潔,佟 彤

冠狀動脈性心臟病簡稱冠心病,指冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化,引起管腔狹窄或閉塞,心肌缺血缺氧甚至壞死導(dǎo)致的心臟病,也稱為缺血性心臟病[1]。《中國心血管健康與疾病報告2021》指出,我國心血管病患病率持續(xù)上升,推算我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)3.3億例,其中冠心病1 139萬例[2]。冠心病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和過早死亡的主要原因[3],可見冠心病嚴(yán)重危害人類健康,是重大的公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)治療冠心病在提高臨床療效、改善疾病預(yù)后等方面有一定優(yōu)勢,為治療冠心病增添了新活力。

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)許心如結(jié)合30年臨床經(jīng)驗,針對氣陰兩虛、瘀血內(nèi)阻型冠心病組方二參通脈湯,后發(fā)展為三參通脈合劑口服液、三參通脈合劑,藥物組成包括太子參、玄參、丹參、延胡索、赤芍、白芍、細辛、柴胡、枳實、娑羅子等。有研究顯示,三參通脈合劑口服液治療輕中度冠心病臨床療效優(yōu)于消心痛[4],可降低冠心病病人內(nèi)皮素(ET)水平,促進降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)釋放,改善冠狀動脈血流[5],降低冠心病病人偏高的T細胞亞群比值(CD4+/CD8+),抑制免疫功能亢進,改善心肌缺血[6]。三參通脈合劑可降低血漿纖維蛋白原(FIB)水平,提高纖溶酶(PL)水平,改善血液高凝狀態(tài)[7],其與常規(guī)西藥聯(lián)用可進一步提高冠狀動脈成形術(shù)或(及)支架置入術(shù)后心絞痛再發(fā)作病人的臨床療效[8]。有實驗顯示,三參通脈合劑口服液可增加冠狀動脈流量,降低冠狀動脈阻力、外周阻力及心肌耗氧量,縮小心肌缺血家犬心肌梗死范圍,改善ST段異常[9]。目前針對三參通脈合劑治療冠心病的藥理學(xué)機制研究較少。中藥復(fù)方是中醫(yī)藥物治療疾病的主要載體,數(shù)千年的臨床實踐明確了中藥復(fù)方的有效性,因其具有多成分、多靶點、多途徑、系統(tǒng)調(diào)控等作用特點,較難進行系統(tǒng)的機制研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)和整體水平,構(gòu)建“疾病-表型-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)以探討藥物與機體的相互作用,是適用于中藥復(fù)方機制探討的研究方法[10]。逆向分子對接可將小分子化合物與三維結(jié)構(gòu)的相關(guān)靶點進行空間和能量匹配,從而評價預(yù)測藥物小分子與潛在作用靶點的結(jié)合活性,補充了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果,從分子水平闡釋了中藥治療疾病的作用機制[11]。本研究基于分子水平,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù),從化學(xué)成分、作用靶點、分子功能和信號通路等多方面系統(tǒng)探討三參通脈合劑治療冠心病的作用機制。研究流程圖見圖1。

圖1 三參通脈合劑治療冠心病作用機制的研究流程圖

1 資料與方法

1.1 三參通脈合劑潛在活性化合物及作用靶點篩選

應(yīng)用高通量中醫(yī)藥實驗和參考指導(dǎo)數(shù)據(jù)庫HERB[12](http://herb.ac.cn)檢索三參通脈合劑核心藥物太子參、玄參、丹參、延胡索、赤芍、白芍、細辛、柴胡、枳實、娑羅子所含化學(xué)成分,根據(jù)化學(xué)成分的藥物動力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion,ADME)參數(shù)進行篩選。具體篩選過程及條件:首先根據(jù)HERB數(shù)據(jù)庫中口服生物利用度(oral bioavailability,OB)初步篩選得到OB≥30%的成分;其次利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)初篩得到化學(xué)成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu),將其導(dǎo)入SwissADME平臺[13](http://www.swissadme.ch/)進一步篩選。設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)[14]:藥代動力學(xué)(pharmacokinetics)為胃腸道吸收[15](gatrointestinal absorption),為“high”;類藥性(druglikeness)為5個相關(guān)參數(shù)(lipinski、ghose、veber、egan、muegge),≥2個參數(shù)為“high”,篩選后得到三參通脈合劑潛在活性化合物。

將篩選最終所得化合物的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺[16](http://www.swisstargetprediction.ch/),物種選擇“Homo sapiens”,篩選可能性(probability)>10%的蛋白作用靶點,將Gene Symbol導(dǎo)入Excel中。

1.2 冠心病潛在作用靶點預(yù)測及篩選

以“coronary atherosclerotic heart disease”“coronary heart disease”“CHD”“ischemic heart disease”為檢索詞,檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫[17](https://www.genecards.org/)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)數(shù)據(jù)庫[18](http://www.omim.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫[19](http://www.disgenet.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫[20](http://www.drugbank.ca/)、TTD(Therapeutic Target Database)數(shù)據(jù)庫[21](http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)獲得冠心病的作用靶點。根據(jù)靶點與疾病相關(guān)性評分的中位數(shù)篩選各數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果,將5個數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果合并,刪除重復(fù)靶點,獲得冠心病的潛在致病靶點。采用UniProt數(shù)據(jù)庫[22](https://www.uniprot.org/)將所得疾病靶點規(guī)范為Gene Symbol。

1.3 三參通脈合劑治療冠心病的潛在靶點預(yù)測

將篩選得到的三參通脈合劑作用靶點與冠心病靶點導(dǎo)入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),取交集得到藥物與疾病的共同靶點,繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

利用軟件Cytoscape 3.9.1[23],根據(jù)韋恩圖中的共同靶點構(gòu)建三參通脈合劑治療冠心病的“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點(node)表示三參通脈合劑中各味中藥、潛在活性化合物及作用靶點,邊(edge)表示中藥與成分、成分與靶點之間的關(guān)系。

1.5 構(gòu)建靶點蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)

為闡明靶點蛋白之間的相互作用,將得到的共同靶點導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫[24](https://cn.string-db.org/),物種選擇“homo sapiens”,設(shè)置靶點關(guān)聯(lián)置信度為中等置信度0.4,其余參數(shù)設(shè)置為默認值,構(gòu)建靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.9.1進行可視化處理,利用CytoNCA插件進行拓撲分析,以參數(shù)度值(Degree)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、緊密中心性(closeness centrality,CC)、局部邊連通性(local average connectivity-based method,LAC)進行篩選,篩選條件為每個參數(shù)均大于中位數(shù)值,篩選核心靶點。

1.6 基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

為尋找三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預(yù)測靶點顯著富集的主要功能注釋及信號通路,將獲得的藥物-疾病共同靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫[25](http://metascape.org),進行GO功能富集分析,包括分子功能(molecular functions,MF)、生物過程(biological process,BP)和細胞組分(cellular components,CC)3個方面及KEGG通路富集分析。設(shè)置物種為“H.sapiens”,Min Overlap為3,Pvalue cutoff為0.01,保存結(jié)果并繪圖。

1.7 分子對接評估

根據(jù)“中藥-成分-靶點”、PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)文獻篩選主要活性成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接評估。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫[26](https://www.rcsb.org/)獲得靶點蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)的pdb格式;通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得藥物小分子結(jié)構(gòu)的sdf格式,并通過OpenBabel3.1.1[27](http://openbabel.org/wiki/Main_Page)轉(zhuǎn)化為pdb格式保存。使用AutoDock Tools 1.5.7[28](https://ccsb.scripps.edu/mgltools/)對靶點蛋白和藥物小分子進行pdb格式處理后保存為pdbqt格式:對靶點蛋白去水、加氫,并設(shè)置為受體;對藥物小分子加氫,設(shè)置為配體,檢測并選擇扭轉(zhuǎn)鍵。設(shè)置對接口袋后采用AutoDock Vina1.1.2[29](https://vina.scripps.edu/)進行分子對接,以對接評分結(jié)合能(affinity)評價配體與靶點的結(jié)合活性:對接結(jié)合能<-17.79 kJ/mol認為配體與靶點之間具有結(jié)合活性,結(jié)合能<-20.93 kJ/mol表明結(jié)合活性較佳,結(jié)合能<-29.30 kJ/mol說明兩者之間有強烈的對接活性[14,30]。通過PyMOL 2.3.0[31]繪制部分分子對接模型。

2 結(jié) 果

2.1 三參通脈合劑的潛在活性化合物及靶點篩選

初步篩選后共獲得437個三參通脈合劑主要活性成分,其中太子參14個,玄參16個,丹參68個,延胡索44個,赤芍29個,白芍38個,細辛75個,柴胡121個,枳實23個,娑羅子9個,合并后去除重復(fù)成分72個,最終篩選得到中藥復(fù)方三參通脈合劑潛在活性化合物365個,基本信息見表1。初步共獲得所有成分的預(yù)測靶點4 029個,其中太子參312個,玄參124個,丹參603個,延胡索564個,赤芍377個,白芍460個,細辛399個,柴胡542個,枳實503個,娑羅子145個,合并后去除重復(fù)靶點3 003個,最終獲得三參通脈合劑主要活性成分預(yù)測靶點1 026個。

表1 三參通脈合劑的潛在活性化合物

2.2 冠心病相關(guān)靶點獲取

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫得到9 393個疾病相關(guān)靶點,相關(guān)性得分(relevance score)最高值為131.24分,最低值為0.10分,以相關(guān)性得分≥17.93分為條件篩選得到1 175個靶點。檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫得到1577個疾病相關(guān)靶點,得分最高值為0.7,最低值為0.01,以得分≥0.02為條件篩選得到794個靶點。其余數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果分別為OMIM數(shù)據(jù)庫420個、DrugBank數(shù)據(jù)庫35個、TTD數(shù)據(jù)庫6個。合并后共2 430個靶點,刪除635個重復(fù)值,最終獲得1 795個疾病相關(guān)靶點。

2.3 三參通脈合劑治療冠心病潛在作用靶點預(yù)測

將篩選得到的1 026個三參通脈合劑作用靶點與1 795個冠心病靶點相映射,取交集得到320個潛在治療靶點,繪制韋恩圖。詳見圖2。

圖2 三參通脈合劑-冠心病靶點韋恩圖

2.4 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖與主要活性成分分析

交集得到的320個靶點來源于10味中藥的212個潛在活性成分,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1系統(tǒng),構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含561個節(jié)點、3 314條邊。紫色圓形代表復(fù)方中的中藥;六邊形代表中藥的活性化合物;藍色菱形代表作用靶點。黃色為太子參、灰色為玄參、橙紅色為丹參、青色為延胡索、淡粉色為赤芍、紫色為白芍、粉紅色為細辛、淡黃色為柴胡、淡紫色為枳實、綠色為娑羅子、橙黃色為多種中藥共有。網(wǎng)絡(luò)中的成分為多種中藥共有,以19個命名為A-S的節(jié)點表示共有化合物成分的中藥組合,命名方式見表2。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值表示通過該節(jié)點的邊的條數(shù),認為度值越大表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。網(wǎng)絡(luò)中有161個(76%)化合物與2個及以上靶點作用,化合物平均度值為15.38,中位數(shù)度值為8,度值居前10位的化合物見表3。度值較高的化合物可能在三參通脈合劑治療冠心病中發(fā)揮重要的作用。253個(79%)靶點與2個及以上化合物連接,即與其他蛋白有共同配體,靶點度值越高提示該靶點可能參與三參通脈合劑治療冠心病。

表2 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中A-S命名規(guī)則

表3 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中度值居前10位的化合物

圖3 三參通脈合劑-冠心病“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

將藥物-疾病共同靶點導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫得到PPI網(wǎng)絡(luò),將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.9.1可視化,利用CytoNCA插件進行拓撲分析,以參數(shù)(度值、BC、CC、LAC)大于中位數(shù)為條件,篩選核心靶點。共篩選2次:初始320個節(jié)點、6 145條邊,第1次篩選(度值≥30、BC≥0.001、CC≥0.491、LAC≥14.08)后得到107個節(jié)點、2 517條邊;第2次篩選(度值≥62、BC≥0.004、CC≥0.536、LAC≥30.034)后得到34個節(jié)點、511條邊,篩選過程見圖4。得到的34個節(jié)點為核心基因:清蛋白(ALB)、蛋白激酶B(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素1B(IL1B)、Src酪氨酸激酶(SRC)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、胱天蛋白酶3(CASP3)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、90 kDa熱休克蛋白αA1(HSP90AA1)、低氧誘導(dǎo)因子-1A(HIF1A)、HRAS原癌基因(HRAS)、雌激素受體1(ESR1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、白細胞介素8(CXCL8)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(CCND1)、趨化因子配體2(CCL2)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)、Toll樣受體4(TLR4)、絲裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)、Ras同源基因家族成員A(RHOA)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、去乙酰化酶Sirtuin-1(SIRT1)、C型蛋白酪氨酸磷酸酶受體(PTPRC)、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、Janus激酶2(JAK2)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員1(SERPINE1)、E1A結(jié)合蛋白P300(EP300)、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1(PTPN1)。核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖5。

圖4 核心靶點篩選過程及結(jié)果

圖5 核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示,三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預(yù)測靶點主要富集在2 753個BP、305個MF、186個CC中。顯著性較高的20個結(jié)果見圖6A～圖6C。三參通脈合劑治療冠心病涉及的BP包括蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)(positive regulation of protein phosphorylation)、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)、循環(huán)系統(tǒng)過程(circulatory system process)等;MF包括蛋白激酶活性(protein kinase activity)、內(nèi)肽酶活性(endopeptidase activity)、激酶結(jié)合(kinase binding);CC包括膜筏(membrane raft)、受體復(fù)合物(receptor complex)、軸突(axon)等。

圖6 三參通脈合劑活性化合物預(yù)測靶點的GO和KEGG富集分析(A為GO-MF富集分析;B為GO-BP富集分析;C為GO-CC富集分析;D為KEGG富集分析)

KEGG富集分析結(jié)果顯示,三參通脈合劑活性化合物治療冠心病的預(yù)測靶點主要富集在226條通路,詳見圖6D。顯著性較高的20條通路包括癌癥途徑(pathways in cancer)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、Ca2+信號通路(calcium signaling pathway)、環(huán)磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)等。根據(jù)靶點的信號通路富集構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)見圖7,該網(wǎng)絡(luò)有229個節(jié)點、495條邊,其中節(jié)點包括209個基因靶點、20條信號通路。黃色圓形代表預(yù)測靶點,紅色箭頭代表富集的KEGG信號通路。三參通脈合劑治療冠心病涉及多靶點、多通路。

圖7 “靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接結(jié)果

根據(jù)“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)文獻選擇三參通脈合劑治療冠心病潛在主要藥物成分,綜合考慮PPI網(wǎng)絡(luò)與“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)選擇可能的核心靶點基因。將11種主要藥物成分與5個核心靶點AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3進行分子對接。共得到55組受體-配體,55組對接最低結(jié)合能見圖8,55組對接結(jié)合能均<-20.93 kJ/mol,提示結(jié)合活性均較佳;其中39組(70.9%)對接結(jié)合能<-29.30 kJ/mol,提示有強烈的對接活性。以SRC-紫丹參素C(przewaquinone c,HBIN040997)組合對接結(jié)合能最低,為-41.02 kJ/mol,結(jié)合活性最佳;STAT3-去氫延胡索甲素(dehydrocorydaline,HBIN022998)對接結(jié)合能最高,為-24.70 kJ/mol,結(jié)合活性相對較差。55組受體-配體中有25組屬于“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),平均對接結(jié)合能為-32.40 kJ/mol,提示網(wǎng)絡(luò)中藥物化合物與靶點間對接活性良好,預(yù)測方法合理。另有30組網(wǎng)外組合,平均對接結(jié)合能為-31.52 kJ/mol,對接活性良好,在今后研究中值得進一步挖掘與探討。部分受體-配體分子對接模型圖見圖9。靶點蛋白、蛋白質(zhì)殘基、藥物小分子分別以3種不同顏色標(biāo)記,黃色虛線為氫鍵。

圖8 三參通脈合劑預(yù)測潛在化合物成分與核心靶點分子對接結(jié)果

圖9 三參通脈合劑預(yù)測化合物-靶點分子對接部分模型圖

3 討 論

冠心病的病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),AS累及冠狀動脈,冠狀動脈供血減少,與心肌需血之間發(fā)生矛盾,即冠狀動脈血流量無法滿足心肌代謝的需要,引起心肌缺血缺氧,進一步積聚乳酸等代謝產(chǎn)物刺激神經(jīng)產(chǎn)生疼痛。既往研究顯示,AS的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)皮細胞(EC)損傷、血小板功能異常、平滑肌細胞(SMC)增生等有關(guān),炎癥反應(yīng)促使斑塊不穩(wěn)定或破裂,繼發(fā)嚴(yán)重持續(xù)的心肌缺血[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物治療通過改善冠狀動脈血供,降低心肌耗氧,改善病人癥狀,同時阻止AS進展,預(yù)防心肌梗死,改善預(yù)后。

中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹”范疇,主要病機為心脈痹阻,瘀血為病理產(chǎn)物。本病臨床以老年人多見,表現(xiàn)為氣虛血瘀、氣陰兩虛等夾雜證候。許心如教授經(jīng)多年臨床觀察,運用氣血辨證理論,創(chuàng)建益氣養(yǎng)陰、活血通脈的方法治療胸痹,以三參通脈合劑為代表方劑。方中太子參益氣養(yǎng)陰、丹參活血通脈為君藥;延胡索通脈止痛,赤白芍共用養(yǎng)血散瘀止痛,玄參滋陰散結(jié),上四味為臣藥;佐娑羅子、細辛溫通止痛,助君藥通脈而制其苦寒;枳實、柴胡為使藥,加強行氣之功,助氣機條達,諸藥合用益氣滋陰、理氣活血、化瘀止痛。本方常用黃芪加強益氣之功;加酸棗仁、女貞子之品效養(yǎng)陰之用。臨床廣泛使用三參通脈合劑輔助治療冠心病。

3.1 三參通脈合劑治療冠心病的潛在有效成分分析

本研究“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中,靶點數(shù)量排名居前5位的潛在有效成分為mono-O-methylwightin、柚皮素(naringenin)、izoteolin、紫丹參素C(przewaquinone C)、芹菜素三甲醚(5,7,4′-trimethylapigenin),來源于丹參、赤芍、枳實、延胡索4味藥物。其中柚皮素來源于赤芍、枳實,既往研究顯示,柚皮素通過減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激、抑制血管SMC增殖和遷移[32]、改善脂代謝[33]、抗血小板聚集[34]等防治AS及冠心病。目前關(guān)于mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚干預(yù)冠心病的相關(guān)研究較少,作用機制有待進一步驗證。網(wǎng)絡(luò)中一些化學(xué)成分來源于三參通脈合劑中的多味中藥,且與較多冠心病靶點相連,可能是三參通脈合劑治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中木犀草素來源于三參通脈合劑中3味藥物,與38個靶點相連;槲皮素來源于4味藥物,與38個靶點相連;山柰酚來源于7味藥物,與37個靶點相連。既往研究顯示,木犀草素、槲皮素、山柰酚通過調(diào)節(jié)脂代謝[35-36]、抗炎及抗氧化應(yīng)激[35-39]、抑制SMC增生[40]等方面抗AS;可擴張血管、抗血小板聚集[36]防治冠心病;對心肌缺血再灌注損傷有保護作用[36,38-39]。

基于文獻發(fā)現(xiàn)一些已知藥物的主要藥效成分在網(wǎng)絡(luò)中與較多靶點相連。丹參主要成分丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、隱丹參酮(cryptotanshinone)均與22個靶點相連。既往研究顯示,丹參酮ⅡA通過抗炎[41]、抑制SMC增殖并誘導(dǎo)凋亡[42-43]、抗血小板聚集[44]等機制干預(yù)冠心病。隱丹參酮可改善缺血區(qū)供血[45]、抑制SMC增殖[46]等。延胡索主要成分去氫延胡索甲素(dehydrocorydaline)在網(wǎng)絡(luò)中與36個靶點相連。相關(guān)研究表明,去氫延胡索甲素可擴張冠狀動脈,增加冠狀動脈血流[47];作用于二磷酸腺苷(ADP)受體(P2Y1和P2Y12)以抗血小板聚集[48];抑制巨噬細胞炎癥以改善動脈順應(yīng)性,增加斑塊穩(wěn)定性[49];降低鈣超載,保護缺血心肌[50]。

3.2 三參通脈合劑治療冠心病的潛在靶點分析

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名居前10位的靶點為ALB、AKT1、GAPDH、VEGFA、IL1B、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、CASP3。綜合考慮“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的重要性,AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3可能在三參通脈合劑治療冠心病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,主要涉及炎癥反應(yīng)、細胞異常增殖、細胞凋亡等。

相關(guān)研究顯示,Src蛋白激酶通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)信號通路、p38絲裂原活化蛋白激(p38 MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路等,參與EC的炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)巨噬細胞吞脂和遷移、刺激血管SMC遷移及增殖[51],參與AS整個病理過程;Src可促進血小板活化和血栓形成[52]。STAT3所屬的STAT蛋白家族是酪氨酸蛋白激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號級聯(lián)的一部分,參與調(diào)控機體免疫反應(yīng)、血管EC及SMC的遷移與增殖、血管SMC凋亡等[53]。有研究顯示,JAK/STAT信號通路及其內(nèi)源性細胞因子信號抑制物(SOCS)在AS炎癥反應(yīng)中有雙向調(diào)控作用[54]。EGFR參與調(diào)控AS進程中SMC、EC及單核細胞/巨噬細胞的增殖與遷移,促進AS發(fā)展[55]。有研究顯示,EGFR表達減少引起循環(huán)中骨髓源性循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(EPCs)數(shù)量減少,活性降低,不利于EC損傷修復(fù),參與冠心病的發(fā)病機制[56]。CASP3、AKT1等靶點與細胞凋亡密切相關(guān),細胞凋亡參與冠心病的病理過程,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定、易于破裂,促進血栓形成,誘發(fā)冠狀動脈痙攣;細胞凋亡是心肌梗死的方式之一,與心肌再灌注損傷密切相關(guān),可能促使心力衰竭演化[57]。阻斷或減少心肌細胞凋亡對治療冠心病有重要意義。CASP3所在Caspase家族是參與和執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵,在細胞凋亡過程中處于核心位置;AKT是PI3K/AKT信號通路的主要參與者,對細胞凋亡有負性調(diào)節(jié)作用。AKT1活化后通過Caspase家族、Bcl-2家族、Par-4、轉(zhuǎn)錄因子家族、代謝途徑等調(diào)節(jié)細胞凋亡[58]。冠心病涉及多個病理過程,炎癥反應(yīng)、細胞異常增殖、細胞凋亡等機制不是絕對獨立存在,而是互相作用,共同參與形成冠心病發(fā)生發(fā)展機制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。三參通脈合劑的潛在有效成分可能在多方面發(fā)揮作用,進而干預(yù)冠心病及AS。

3.3 三參通脈合劑治療冠心病KEGG通路富集分析

KEGG富集分析顯示,三參通脈合劑治療冠心病可能與脂質(zhì)和AS途徑、流體剪切應(yīng)力和AS途徑、Ca2+信號通路、cAMP信號通路、輔助性T細胞17(Th17)細胞分化通路、NF-κB信號通路、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)途徑等相關(guān),主要涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細胞增殖、細胞凋亡等機制。

脂質(zhì)和AS途徑、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)途徑等提示三參通脈合劑干預(yù)冠心病可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)。AS動脈血管壁內(nèi)斑塊富含脂質(zhì),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高,積聚于血管壁,生成氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL),導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,促進冠心病進展,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低LDL-C水平可防治冠心病。有研究顯示,脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)途徑使巨噬細胞中脂滴穩(wěn)定性升高,進而改善巨噬細胞極性和炎癥反應(yīng),在危險因素未變化的情況下,防治AS進展[59]。NF-κB信號通路、Th17細胞分化通路等與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)。AS是一種進展緩慢的慢性炎癥疾病。炎癥伴隨從早期EC修飾脂質(zhì)激活到斑塊的破裂的AS全過程,并促進AS進展。NF-κB信號通路可從多種途徑激活NF-κB。既往研究顯示,NF-κB控制AS相關(guān)細胞因子、趨化因子、黏附分子、急性期蛋白、凋亡調(diào)節(jié)因子和增殖刺激因子等基因的轉(zhuǎn)錄,對AS有調(diào)節(jié)作用[60]。Th17在慢性炎癥疾病中有促炎作用,有研究顯示,AS進展與增殖激活的Th17細胞相關(guān),在白細胞介素(IL)-18缺乏情況下,高膽固醇飲食小鼠中膽固醇與同型半胱氨酸通過替代的IL-23/Th17通路協(xié)同加速AS[61]。流體剪切應(yīng)力和AS途徑提示在動脈分叉、分支開口和彎曲處往復(fù)運動、低剪切應(yīng)力的擾動流促進動脈壁的氧化、炎癥狀態(tài)和AS發(fā)展[62]。血管SMC的異常增殖和遷移受cAMP/PKA信號通路調(diào)控。有研究顯示,質(zhì)子感應(yīng)受體T細胞死亡偶聯(lián)基因8(TDAG8)通過cAMP/PKA信號通路介導(dǎo)血管SMC的增殖和遷移[63],參與AS發(fā)生發(fā)展。阿司匹林可抑制cAMP信號通路,下調(diào)血管SMC增殖率,上調(diào)血管SMC凋亡率,抑制AS進展[64]。鈣信號通路調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài),鈣超載促使心肌細胞凋亡、EC損傷,導(dǎo)致冠心病進展[65]?？傊?主要的KEGG富集通路與冠心病及AS發(fā)生發(fā)展相關(guān),三參通脈合劑可能通過調(diào)節(jié)上述信號通路脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細胞增殖、細胞凋亡,從而干預(yù)冠心病及AS進展。

3.4 分子對接結(jié)果分析

分子對接是基于分子水平預(yù)測并評價藥物小分子與靶點蛋白的相互作用,分析體的結(jié)合位點及二者的結(jié)合親和力,在分子結(jié)構(gòu)方面補充網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測能力。本研究使用AutoDock軟件進行分子對接,該軟件基于格點能量的計算方法,將靶點蛋白嵌入網(wǎng)格中,在每個網(wǎng)格點放置1個探針原子,軟件中AutoGrid程序?qū)⒂嬎闾结樑c目標(biāo)之間的相互作用能,將數(shù)值存儲在網(wǎng)格中[66]。在模擬對接階段,AutoDock Vina程序根據(jù)構(gòu)象搜索算法探索藥物小分子對接的構(gòu)象狀態(tài),并根據(jù)AutoGrid生成的能量網(wǎng)格評估對接模擬中每個點配體-受體的相互作用,二者結(jié)合力由自由結(jié)合能評價,自由結(jié)合能越低提示結(jié)合越緊密。

本研究對11個小分子化合物與5個核心靶點產(chǎn)生的55個組合以剛性受體-柔性配體的方式進行分子對接,即允許配體調(diào)整可旋轉(zhuǎn)鍵。55組對接結(jié)合能均<-20.93 kJ/mol,提示結(jié)合活性均較好,其中有25組屬于“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),平均對接結(jié)合能為-32.40 kJ/mol,為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果增加了分子結(jié)構(gòu)上的可信度。網(wǎng)絡(luò)Degree值居前5位的化合物中,mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚干預(yù)冠心病的機制缺少文獻與研究的支持,與冠心病核心靶點AKT1、SRC、EGFR、STAT3、CASP3等結(jié)合活性較強,可能為今后治療冠心病提供新的藥物小分子選擇。30組網(wǎng)外組合平均對接結(jié)合能為-31.52 kJ/mol,對接活性良好,為三參通脈合劑主要藥物小分子干預(yù)冠心病的作用機制提出更多可能,值得進一步研究?？傊?分子對接從分子水平解釋藥物小分子干預(yù)冠心病的作用機制提供了潛在依據(jù),為冠心病基礎(chǔ)研究尚未關(guān)注到的潛在小分子化合物提出新的可能性,增加了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的完整性與可靠性。

4 小 結(jié)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,預(yù)測三參通脈合劑作用于冠心病的主要成分與核心靶點,進行GO富集分析與KEGG富集分析預(yù)測主要涉及的分子功能、生物進程與信號通路。結(jié)果提示三參通脈合劑主要活性成分包括柚皮素、木犀草素、槲皮素、山柰酚、去氫延胡索甲素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等有相關(guān)研究支持的成分與mono-O-methylwightin、izoteolin、紫丹參素C、芹菜素三甲醚等有待繼續(xù)研究的成分,可能主要通過SRC、STAT3、NF-κB信號通路、Th17細胞分化通路等抑制炎癥反應(yīng);通過EGFR、cAMP信號通路等抑制SMC、EC等的增殖與遷移;通過AKT1、CASP3、Ca2+信號通路等下調(diào)心肌細胞凋亡;通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝穩(wěn)定斑塊、降低危險因素等多種機制干預(yù)冠心病及AS的發(fā)生發(fā)展。本研究對核心靶點與主要活性成分進行分子對接,結(jié)果顯示,所有預(yù)測的對接組合結(jié)合活性均較好,在物質(zhì)結(jié)構(gòu)方面增強了預(yù)測意義,可能為今后干預(yù)冠心病研究提供潛在選擇。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果是基于已有研究及實驗數(shù)據(jù),其可靠性受原始研究結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法弱化了各成分的含量關(guān)系,篩選潛在藥用成分條件理想化,上述局限性可能導(dǎo)致本研究結(jié)果的假陽性與假陰性。本研究提供了今后冠心病研究的潛在方向,尚需大量針對性實驗驗證,深入探討三參通脈合劑干預(yù)冠心病的藥理學(xué)機制。