金士杰,趙凰宏,關(guān)東升,馬 振,宋甜甜,王曉靜
阿爾茨海默病又稱老年性癡呆,臨床以認知功能缺損、精神情感障礙等為主要表現(xiàn),屬于不可逆性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于阿爾茨海默病的病理機制研究尚未統(tǒng)一定論,多數(shù)認為其可能涵蓋Tau蛋白的異常表達、神經(jīng)細胞的凋亡、基因的遺傳關(guān)聯(lián)等多方面。隨著老齡化時代的到來,阿爾茨海默病發(fā)病率不斷增長[1],預(yù)計2030年全球阿爾茨海默病病人將達到6 570萬例[2]。然而阿爾茨海默病無法治愈,嚴重影響病人生存和生活質(zhì)量,因此,亟須尋求新思路和新方法滿足臨床需求。隨著現(xiàn)代生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式普及,有研究顯示,長期感知負性情緒可加速認知衰老的進程,是導(dǎo)致阿爾茨海默病的重要病因[3]。柴胡、白術(shù)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,二者是臨床用于疏肝健脾、調(diào)暢情志的經(jīng)典配伍藥對。有研究顯示,柴胡、白術(shù)具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的重要功能,是防治阿爾茨海默病的主要中藥[4-5]。侯俊林等[6]運用以“柴胡-白術(shù)”藥對為主的逍遙丸,對肝郁型輕度認知功能障礙進行藥物干預(yù),結(jié)果顯示,用藥后病人學(xué)習記憶成績顯著改善。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)描述了中藥與靶點、疾病等不同作用機制之間的復(fù)雜關(guān)系,可作為成分復(fù)雜、靶點眾多中藥及方劑的重要研究工具,與中醫(yī)“整體觀念”一致。現(xiàn)階段運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法驗證柴胡-白術(shù)治療阿爾茨海默病的作用機制臨床研究報道較少,限制了中藥多成分、多靶點、多途徑機制的研究新視角。本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、GeneCards、STRING平臺等,對柴胡-白術(shù)治療阿爾茨海默病作用活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析,進而探討該藥對治療阿爾茨海默病的作用機制,并采用DAVID平臺進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,以期為探討柴胡-白術(shù)治療阿爾茨海默病的作用機制提供新思路。
利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查找柴胡-白術(shù)的活性成分及與活性成分相關(guān)的潛在靶點。在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中,將靶點物種限定為人,檢索所有靶點蛋白的官方名稱。將柴胡-白術(shù)藥對活性成分和對應(yīng)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1,構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。
登錄GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫,在檢索框中輸入“Alzheimer disease”,得到阿爾茨海默病的人類基因。將疾病靶基因和柴胡-白術(shù)藥對有效成分對應(yīng)靶基因運用R3.6.2程序進行對接,找到柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病機制中發(fā)揮作用的靶基因。之后將這些靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),并運用CytoNCN對網(wǎng)絡(luò)中所有靶點進行拓撲分析,共篩選出40個關(guān)鍵靶標,最后通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。
將得到的40個關(guān)鍵靶標和柴胡-白術(shù)藥對有效成分,通過Cytoscape 3.7.1構(gòu)建藥物-分子-關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)。
使用DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)平臺對得到的40個關(guān)鍵靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,以P<0.05作為篩選條件。
經(jīng)過TCMSP收集得到柴胡的活性成分349種、白術(shù)的活性成分55種,根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18,同時去掉重復(fù)成分,篩選出柴胡-白術(shù)藥對的有效化合物成分共24種。通過UniProt數(shù)據(jù)庫對24種活性成分進行對應(yīng)靶點基因檢索,其中將具有靶標的16種化合物(見表1)的294個基因進行去重處理,余167個靶基因,并將柴胡-白術(shù)16個活性成分及167個靶基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 軟件中,構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。柴胡活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)包括185個節(jié)點、310條邊,其中粉紫色為167個靶基因節(jié)點和黃色為16個活性化合物節(jié)點[柴胡(綠色)12個,白術(shù)(藍色)4個]。根據(jù)化合物與靶基因關(guān)聯(lián)的度值(Degree值),認為槲皮素、山柰素、豆甾醇、異鼠李素、3β-乙酸化蒼術(shù)酮等可能是該藥對發(fā)揮主要作用的活性成分。
圖1 柴胡-白術(shù)藥對活性成分-基因靶點網(wǎng)絡(luò)圖
表1 柴胡-白術(shù)藥對含有的16種活性成分
通過GeneCards收集到與阿爾茨海默病相關(guān)的靶基因8 730個,之后將疾病靶基因和柴胡-白術(shù)有效成分對應(yīng)的167個靶基因運用R3.6.2程序進行對接,找到柴胡-白術(shù)治療阿爾茨海默病機制中發(fā)揮作用的靶基因138個。將這些潛在靶標輸入STRING數(shù)據(jù)庫,將物種限定為“Homo sapiens”,探尋靶基因相互間的作用關(guān)系,并進行可視化分析(見圖2)。其次,將STRING生成的文件輸入Cytoscape 3.7.1,運用CytoNCN對網(wǎng)絡(luò)中所有靶點進行拓撲分析,滿足每個靶點的Degree值、接近中心度(betweenness)、介度中心度(closeness)等拓撲參數(shù)值大于中位數(shù),篩選出40個基因作為關(guān)鍵靶點[7],繪制出柴胡-白術(shù)藥對-阿爾茨海默病關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3),共40個節(jié)點、493條邊。Degree值代表該靶點在網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中需要承載的流量,即數(shù)值越大提示流量越大,居前10位分別為蛋白激酶B(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、白細胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄因子c-JUN N-末端激酶1/2(JNK)、癌基因(MYC)、表皮生長因子(EGF)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、核磷蛋白FOS(FOS)可能是該藥對的主要調(diào)控對象。將上述40個關(guān)鍵靶點和柴胡-白術(shù)藥對分子之間的相互關(guān)系通過Cytoscape 3.7.1進行可視化分析,構(gòu)建“藥物-分子-關(guān)鍵靶標”網(wǎng)絡(luò)(見圖4),9個活性成分與40個關(guān)鍵靶點之間的相互作用反映了柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病有效成分的多靶點作用機制,其中,槲皮素介數(shù)最高,可作用于33個核心靶基因,是柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病的主要成分。
圖2 柴胡-白術(shù)藥對-阿爾茨海默病的作用靶點交互網(wǎng)絡(luò)圖
圖3 柴胡-白術(shù)藥對-阿爾茨海默病的關(guān)鍵靶點交互網(wǎng)絡(luò)圖
圖4 “藥物-成分-關(guān)鍵靶點”交互網(wǎng)絡(luò)圖
使用DAVID平臺對40個關(guān)鍵靶標進行GO功能富集分析,按照P<0.05得到313條信號相關(guān)條目,其中19條細胞組分信號通路、241條生物過程信號通路及53條分子功能通路。選取20條密切的通路功能信息,詳見表2。細胞組分方面,主要與細胞質(zhì)有關(guān),活性成分主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能中;生物過程方面,主要通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、對有機環(huán)狀化合物的細胞反應(yīng)、細胞增殖正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、肽基絲氨酸磷酸化、藥物反應(yīng)、血管內(nèi)皮細胞遷移的陽性調(diào)節(jié)、基因表達的陽性調(diào)控、MAPK梯級、炎癥反應(yīng)等多個機制發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用。
表2 柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病作用靶點的GO功能富集分析
將40個關(guān)鍵靶標導(dǎo)入DAVID平臺進行KEGG通路富集分析。按照P<0.05篩選出104條信號通路,選取20條與阿爾茨海默病密切相關(guān)的重要通路。除了存在阿爾茨海默病通路外,還涉及癌癥途徑、乙型肝炎、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、ErbB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT信號通路、膠質(zhì)瘤、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、叉頭蛋白表達因子O(FOXO)信號通路、細胞凋亡、胰島素抵抗、多巴胺能突觸、膽堿能突觸、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸、長期抑郁等通路。詳見表3。柴胡-白術(shù)藥對可能主要通過上述通路對阿爾茨海默病發(fā)揮作用。
表3 柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病作用靶點的KEGG通路富集分析
中醫(yī)學(xué)根據(jù)阿爾茨海默病的認知功能減退及人格、行為改變等典型癥狀,將其歸屬于“癡呆”的范疇,認為該病的發(fā)生、發(fā)展與情辨志關(guān)系密切,肝氣郁結(jié)、脾胃虧虛是重要病機之一?!侗孀C錄·呆病門》有云:“然而呆病之成,必有其因,大約其始也,起于肝氣之郁;其終也,由于胃氣之衰”?!兜崮媳静荨酚涊d:“柴胡,味苦,性微寒,陰中陽也。入肝、膽二經(jīng)”?!端幤坊x》中言:“白術(shù)……性氣與味俱厚,入脾胃三焦三經(jīng)”。柴胡-白術(shù)是臨床經(jīng)典的配伍藥對,二者合用具有疏解肝氣、健運脾胃之功效。有研究顯示,以“柴胡-白術(shù)”為主配伍的方劑,具有減輕自由基氧化損害、調(diào)節(jié)中樞膽堿能神經(jīng)元和單胺類神經(jīng)元活性的重要作用,是臨床防治阿爾茨海默病的主要方劑之一[8]。侯俊林等[6]運用逍遙丸對癡呆臨床前期中老年病人進行藥物干預(yù),結(jié)果顯示,用藥后DNA的氧化損傷較用藥前明顯改善。
柴胡-白術(shù)藥對的“化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析中,槲皮素對應(yīng)的關(guān)鍵靶標最多,說明其是該藥對防治阿爾茨海默病的主要成分?,F(xiàn)代研究顯示,槲皮素具有抗氧化、抗炎、保護神經(jīng)元、平衡鈣穩(wěn)態(tài)和提高突觸間傳遞的作用,可治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[9-10]。本研究通過對該藥對關(guān)鍵靶點的篩選,發(fā)現(xiàn)其有效化合物成分主要通過AKT1、MAPK1、CASP3、IL-6、VEGFA、JUN、MYC、EGF、MAPK8、FOS等靶點改善認知功能。MAPK1和MAPK8是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要分子,可激活MAPK磷酸化和Bcl-2磷酸化途徑,通過Tau的過度磷酸化和淀粉樣蛋白-β(Aβ)肽在液泡中的積累,產(chǎn)生細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元細胞死亡[11-12]。有研究顯示,腦血流改變是阿爾茨海默病早期突出的持續(xù)性變化,VEGFA mRNA表達可影響神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞表達,EGF可防止Aβ誘導(dǎo)的體外對腦內(nèi)皮細胞損害,若二者表達異??赡茉黾宇净及柎暮D〉娘L險[13]。AKT1、CASP3、IL-6、JUN等基因及MYC、FOS等參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等生物過程,均在細胞凋亡、細胞增殖及細胞遷移等多種細胞過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[14-17]。GO功能富集分析結(jié)果顯示,柴胡-白術(shù)藥對的活性成分可能主要通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、細胞增殖正調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化、血管內(nèi)皮細胞遷移的陽性調(diào)節(jié)、MAPK梯級、炎癥反應(yīng)等多機制發(fā)揮治療阿爾茨海默病的作用。KEGG富集通路除了包括阿爾茨海默病通路、膽堿能突觸、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸等常見通路外,同時發(fā)現(xiàn)了多條重要通路,其中癌癥的途徑通路、MAPK信號通路值得關(guān)注。
癡呆和癌癥是人口老齡化的病理產(chǎn)物,極大影響了人們的生存質(zhì)量,二者存在相互沖突的現(xiàn)象,即癌癥以不受控制的細胞增殖為特征,進行性神經(jīng)元死亡提示著神經(jīng)退行性變。相關(guān)研究團隊檢索138個與阿爾茨海默病、癌癥相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)124個在細胞代謝過程中緊密相連,選擇性自噬接頭蛋白(SQTM1)、泛素竣基末端水解酶(UGHL1)、分子伴侶蛋白(STUB1)、表皮生長因子受體(EGFR)等9個基因在二者疾病中呈顯著相關(guān)[18]。有研究對神經(jīng)膠質(zhì)瘤和阿爾茨海默病的miRNA表達數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn),has-miR-106a、has-miR-20b、has-miR-424等13個miRNA中有12個出現(xiàn)反向表達模式[19]。因此,可能需要在阿爾茨海默病群體中研發(fā)特定癌癥藥物或在癌癥病人中運用特定的治療阿爾茨海默病藥物。本研究結(jié)果顯示,MYC、FOS、AKT1及游離DNA EGFR等與膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多個途徑關(guān)系密切,均是柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病的關(guān)鍵靶標,且EGFR也是Cristina研究團隊檢索結(jié)果中阿爾茨海默病和癌癥顯著相關(guān)的基因之一,柴胡、白術(shù)也是癌癥治療常用藥[20-21]。推測柴胡-白術(shù)藥對治療癌癥和阿爾茨海默病具有“異病同治”的雙向調(diào)節(jié)功效。因此,探討癌癥與阿爾茨海默病之間看似沖突疾病的干預(yù)機制,可能為今后新藥研發(fā)、臨床研究提供了方向。無論是關(guān)鍵靶標還是富集結(jié)果,MAPK信號通路均與阿爾茨海默病有密切聯(lián)系。ERK1/2、c-JUN和p38-MAPK是MAPK信號通路主要組成部分,激活信號通路在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。其中的MAPK/ERK通路可在纖維狀A(yù)β誘導(dǎo)下持續(xù)激活,引起Tau蛋白的異常磷酸化、神經(jīng)突的變性及神經(jīng)元細胞凋亡,進而影響學(xué)習記憶能力[22]。因此,認為柴胡-白術(shù)治療阿爾茨海默病的調(diào)節(jié)是通過多途徑實現(xiàn)的。
綜上所述,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討柴胡-白術(shù)藥對治療阿爾茨海默病的復(fù)雜機制,柴胡-白術(shù)藥對多成分作用于相關(guān)靶點及通路,從而發(fā)揮治療作用。本研究存在一定的局限性:中藥復(fù)方中其他中藥成分對該藥對的活性成分差異產(chǎn)生影響、過濾掉的藥物成分作用貢獻及上述提及的該藥對治療癌癥與阿爾茨海默病機制的關(guān)聯(lián)性等尚未明確,本研究結(jié)果有待后續(xù)實驗進一步驗證。