賈彩霞 周潔如 朱洪希 吳旦

摘 要：目的：建立牛肉中多種磺胺類藥物殘留量的檢測方法。方法：處理均質(zhì)后的牛肉，用乙酸乙酯提取出目標(biāo)物，用HLB小柱凈化，氮吹，復(fù)溶。以0.1%的甲酸甲醇與0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)T3色譜柱進(jìn)行分離，采用離子源為電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測，外標(biāo)法定量。結(jié)果：18種磺胺在2～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好（r＞0.996），方法的檢出限為2 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為64.87%～105.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～6.8%。結(jié)論：本方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于牛肉中18種磺胺類藥物的檢測。

關(guān)鍵詞：固相萃取；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺類藥物；牛肉

Determination of Sulfonamide Residues in Beef by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

JIA Caixia， ZHOU Jieru， ZHU Hongxi， WU Dan

（Changzhou Institute of Inspection and Testing Standards Certification， Changzhou 213000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of sulfonamides residues in beef. Method： The homogenized beef was treated， the target was extracted with ethyl acetate， purified by HLB column， nitrogen blowing， and redissolved. 0.1% formic acid methanol and 0.1% formic acid aqueous solution were used as mobile phase for gradient elution， and separated by T3 column. Ion source was used as electrospray ion source， scanning mode was positive ion scan， detection mode was multi-reaction monitoring， and quantitative method was external standard method. Result： The internal linear relationship of 18 sulfonamides was good （r＞0.996） in the range of 2～200 ng·mL-1. The limits of detection and quantification were 2 μg·kg-1 and 10 μg·kg-1. The recoveries were 64.87%～105.00% and the relative standard deviations were 1.6%～6.8%. Conclusion： The method is sensitive， accurate and suitable for the detection of 18 sulfonamides in beef.

Keywords： solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; beef

獸藥殘留是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品中原型藥物或其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留[1]。獸藥殘留主要是由于不按規(guī)定、非法使用及濫用獸藥造成獸藥在動(dòng)物體內(nèi)不斷積累而引起[2]。常見的獸藥殘留包括酰胺醇類、磺胺類和喹諾酮類等[3]。其中，磺胺類藥物對(duì)于鏈球菌等細(xì)菌有預(yù)防和治療的作用。該藥物價(jià)格低廉、使用方便以及藥效明顯，在各類畜禽的養(yǎng)殖過程中大量使用。但該藥對(duì)生態(tài)環(huán)境和對(duì)畜牧生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有嚴(yán)重危害，且該藥會(huì)引起人過敏反應(yīng)，甚至有致癌性。

由于生活質(zhì)量越來越高，動(dòng)物源食品的出口貿(mào)易急劇增長，人們對(duì)食品質(zhì)量與安全的關(guān)注度大大提高。因此，幾乎每個(gè)國家都出臺(tái)了動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測限量。獸藥的最高殘留限量基本都在1 mg·kg-1以下，即百萬分之一級(jí)別，許多禁用藥要求會(huì)更低，無疑屬于痕量分析范疇，所以獸藥殘留的檢測一直是食品檢測中的難點(diǎn)[4-7]。常用的檢測方法包括傳統(tǒng)的溶劑萃取、固相萃取、凝膠色譜、多項(xiàng)技術(shù)組合及QuEChERS試劑包等多種方法[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉中多種磺胺類藥物殘留量，以滿足實(shí)驗(yàn)室牛肉樣品中18種磺胺類藥物的常規(guī)檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺類混標(biāo)（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺甲氧噠嗪（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲酸（色譜純）；濃氨水。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津，LCMS-8050）；12孔固相萃取裝置（CNW）；氮吹儀；高速離心機(jī)；渦旋振蕩儀；超聲波清洗器；HLB固相萃取柱（CNW）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取適量有代表性的新鮮或解凍空白牛肉，攪碎并均質(zhì)，-18 ℃保存。

1.2.2 提取

稱取4 g（精確至0.01 g）試樣，用10 mL的乙酸乙酯提取，高速渦旋1 min，再經(jīng)超聲提取20 min，8 000 r·min-1冷凍離心5 min，收集上清液于20 mL干凈容量瓶中，剩余殘?jiān)性偌尤? mL乙酸乙酯，重復(fù)前述提取步驟后合并上清液于同一20 mL容量瓶中，定容至刻度。取上清液5 mL，加水5 mL，振蕩1 min，45 ℃氮吹除去乙酸乙酯層。

1.2.3 凈化

HLB固相萃取柱分別依次經(jīng)6 mL甲醇和6 mL水活化，吸取上述經(jīng)氮吹除去乙酸乙酯的液體以每秒1～2滴的速度過固相萃取柱，依次用6 mL水和6 mL 20%甲醇水淋洗，抽干，再用2×4 mL 5%氨水甲醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗脫，收集該洗脫液，45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 0.2%甲酸乙腈溶液∶水（2∶3）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將多種磺胺類混標(biāo)用0.2%甲酸乙腈水（2∶3）配制成濃度分別為2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以牛肉為空白基質(zhì)，通過提取、凈化、氮吹干后用1 mL前述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行復(fù)溶，進(jìn)樣。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC T3（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫見表1。

1.2.6 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測。質(zhì)譜參數(shù)見見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液的提取效果。分別稱取4 g陰性樣品，在10 μg·kg-1條件下進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，用Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液進(jìn)行提取、凈化、氮吹復(fù)溶后上液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。由表3可知，乙酸乙酯對(duì)本方法所研究的18種磺胺類藥物的提取效果最佳，因此選用乙酸乙酯為提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

本文針對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了流動(dòng)相類型以及酸度的實(shí)驗(yàn)。①流動(dòng)相類型通常改變出峰時(shí)間。正常情況下通過一二級(jí)質(zhì)譜掃描得到磺胺類藥物的離子對(duì)，通過離子對(duì)即可對(duì)其進(jìn)行定性分析。但本實(shí)驗(yàn)18種磺胺中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶的分子量及母離子、子離子均一致，只是基團(tuán)位置不同，無法通過離子對(duì)進(jìn)行定性分析，需調(diào)節(jié)出峰時(shí)間區(qū)分該3種物質(zhì)。因此，在流動(dòng)相類型方面，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)，此3種磺胺出峰時(shí)間各不相同（圖1），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)，只出2個(gè)峰，表明峰重合未分開（圖2）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相。②酸度。選擇水-甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇2種。通常加酸調(diào)節(jié)酸度可以提高正離子掃描模式下的離子化強(qiáng)度且改善峰型，因此實(shí)驗(yàn)通過添加0.1%甲酸比較酸度增強(qiáng)時(shí)，18種磺胺類藥物的峰型是否有變化。結(jié)果表明，以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，磺胺類藥物峰型出現(xiàn)分裂、拖尾或不尖銳的現(xiàn)象，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相后峰型所改善，峰型變尖銳且強(qiáng)度增加，響應(yīng)提高。以乙酰胺酸為例，200 ng·mL-1乙酰胺酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，峰型不尖銳，強(qiáng)度為716 042，見圖3（a），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)，峰型尖銳且強(qiáng)度達(dá)749 404，見圖3（b）。綜合考慮，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

掃描模式采用正離子模式，在正離子掃描模式下得到一級(jí)質(zhì)譜圖后，找到母離子，再用二級(jí)質(zhì)譜掃描得到子離子，分別選定為定性離子和定量離子，再分別對(duì)碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值。多種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜條件參數(shù)見表2，質(zhì)譜圖見圖4。

表3 加標(biāo)濃度為10 μg·kg-1時(shí)3種提取液的回收率結(jié)果

名稱 1%甲酸

乙腈/% 乙酸

乙酯/% Mcllvaine-Na2EDTA/%

乙酰胺酸 76.44 83.47 84.01

磺胺吡啶 69.95 80.85 75.24

磺胺嘧啶 75.71 82.55 87.16

磺胺甲惡唑 84.82 93.74 59.50

磺胺噻唑 79.76 77.71 73.20

磺胺甲嘧啶 76.89 85.68 78.37

磺胺二甲異惡唑 83.75 74.04 68.37

磺胺甲噻二唑 82.69 85.37 72.65

苯甲?；前?75.58 79.23 63.36

磺胺二甲異嘧啶 66.84 77.35 88.44

磺胺二甲嘧啶 80.94 90.37 80.50

磺胺間甲氧嘧啶 88.19 95.16 83.44

磺胺甲氧噠嗪 75.46 83.08 75.45

磺胺對(duì)甲氧嘧啶 77.81 87.86 70.11

磺胺氯噠嗪 86.51 89.52 61.03

磺胺鄰二甲氧嘧啶 52.26 69.94 57.56

磺胺間二甲氧嘧啶 84.99 95.76 60.62

磺胺苯吡唑 62.76 69.34 65.30

圖1 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜圖

圖2 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜圖

溶液（200 ng·mL-1）的質(zhì)譜圖

（a）以水-甲醇為流動(dòng)相

（b）以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相

圖3 200 ng·mL-1乙酰胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰型圖

圖4 18種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

在2～200 ng·mL-1，18種目標(biāo)物濃度與其對(duì)應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表4。

2.5 回收率及精密度

以牛肉為空白基質(zhì)，按照提取、凈化、氮吹、復(fù)溶步驟進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為低

（10 μg·kg-1）、中（20 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3個(gè)水平，回收率及精密度結(jié)果見表5。

3 結(jié)論

本方法的18種磺胺類物質(zhì)均在2～200 ng·mL-1內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，方法檢出限為2 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，回收率為64.87%～105.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～6.8%。本方法提取率高，檢測步驟快速簡單。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，能夠滿足日常檢測需求。

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