歐陽靜, 彭 雙, 譚英征, 周 慧

1.株洲市中心醫(yī)院 感染內(nèi)科,湖南 株洲 412000;2.株洲愷德心血管病醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,湖南 株洲 412000

人呼吸道合胞體病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是由單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成的一種肺炎病毒科病毒,是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人及免疫缺陷患者發(fā)生下呼吸道感染的重要病因,該病毒感染后容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)支氣管或肺功能發(fā)生改變,嚴(yán)重影響患者生命健康[1]。在病毒感染過程中,宿主細(xì)胞可以通過模式識別受體對病毒相關(guān)分子模式進(jìn)行監(jiān)測,然后啟動天然免疫反應(yīng),并通過分泌產(chǎn)生干擾素等細(xì)胞因子殺滅病毒,但RSV能通過多種免疫逃逸機(jī)制產(chǎn)生細(xì)胞感染和遺傳物質(zhì)復(fù)制[2-3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)不具備蛋白質(zhì)編碼功能,但能調(diào)控基因表達(dá),從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)等方面調(diào)節(jié)基因表達(dá)過程[4]。本研究旨在觀察RSV感染的A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)情況,并分析其生物學(xué)功能,以期為從lncRNA角度認(rèn)識RSV及其與A549宿主細(xì)胞之間的相互作用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染 人肺部細(xì)胞系A(chǔ)549、Calu-1、HCC827、MRC-5、HFL1細(xì)胞購自尚恩生物,采用DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)人肺部細(xì)胞系生長至80%密度,PBS洗滌3次,采用感染復(fù)數(shù)為1的RSV感染肺部細(xì)胞系,1 h后加入DMEM維持液(含2% FBS),繼續(xù)放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 RNA提取及l(fā)ncRNA基因芯片檢測 RSV感染A549細(xì)胞24 h后,提取總RNA,采用NanoDropND-1000(美國Thermo)檢測總RNA濃度,并采用瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進(jìn)行檢測。然后采用Agilent lncRNA Human Gene Expression Microarray version基因芯片檢測lncRNA表達(dá)譜,采用Agilent Feature Extraction software進(jìn)行圖像分析。當(dāng)P<0.05且相對表達(dá)量變化倍數(shù)>2時(shí),認(rèn)為lncRNA存在顯著差異,然后采用Cluster 3.0繼續(xù)進(jìn)行層次聚類分析。

1.3 lncRNA靶基因的GO和KEGG功能富集分析 對存在差異表達(dá)的lncRNA相關(guān)靶基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway富集分析,分析lncRNA靶基因可能參與的細(xì)胞通路及潛在疾病類型、生物學(xué)功能。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法驗(yàn)證 將RSV接種于人肺部細(xì)胞系并發(fā)生感染24 h后對細(xì)胞進(jìn)行收集處理,加入TRIzol試劑將細(xì)胞完全裂解,然后使用Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)條件:95℃ 15 min,95℃ 15 s,60℃ 20 s,連續(xù)循環(huán)40次。最后均采用2-△△ct計(jì)算lncRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RSV感染A549細(xì)胞后的lncRNA差異表達(dá) A549細(xì)胞感染RSV后共計(jì)2 415個lncRNA發(fā)生差異表達(dá),包括1 453個上調(diào)lncRNA和962個下調(diào)lncRNA,前10個上調(diào)和下調(diào)最顯著的lncRNA見表1。其中,上調(diào)和下調(diào)最多的lncRNA分別為ENST00000607613.1[差異倍數(shù)(fold change,FC)=165.687]和ENST00000520156.1(FC=23.562)。RSV感染A549細(xì)胞后的lncRNA差異表達(dá)整體分布火山圖和聚類分析見圖1和圖2。

圖1 RSV感染A549細(xì)胞后的lncRNA差異表達(dá)整體分布火山圖(藍(lán)點(diǎn)代表非顯著差異表達(dá)的lncRNA,紅點(diǎn)、綠點(diǎn)分別表示發(fā)生上調(diào)、下調(diào)且存在顯著表達(dá)差異的lncRNA)

圖2 RSV感染A549細(xì)胞后的lncRNA差異表達(dá)聚類分析(紅色、綠色分別表示發(fā)生上調(diào)、下調(diào)且存在顯著表達(dá)差異的lncRNA)

表1 RSV感染A549細(xì)胞后的lncRNA上調(diào)和下調(diào)表達(dá)結(jié)果

2.2 GO和KEGG富集分析 GO富集分析顯示,差異表達(dá)的lncRNA調(diào)控靶基因主要與干擾素(Ⅰ型)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、宿主抗病毒反應(yīng)、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控等免疫反應(yīng)生物學(xué)過程高度相關(guān)。進(jìn)一步的pathway富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)的lncRNA主要調(diào)控干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、免疫及炎癥等信號通路。差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的mRNA靶基因的GO功能富集結(jié)果和KEGG功能富集結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的mRNA靶基因的GO功能富集結(jié)果

圖4 差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的mRNA靶基因的KEGG功能富集結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,18種lncRNA(P17101、P7539、P8209、P25918、P38638-v4、P8612、P8610、P34527-v4、P6011、P4480、P13713、殖及干擾素調(diào)節(jié)過程具有高度相關(guān)性。提取RSV感染的A549細(xì)胞RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),18種lncRNA相對表達(dá)水平分析結(jié)果與表達(dá)譜數(shù)據(jù)一致。見圖5。在人肺部細(xì)胞Calu-1、HCC827、MRC-5、HFL1中18種lncRNA相對表達(dá)水平的上升或下降與A549細(xì)胞一致。見圖6。

圖5 18種顯著差異表達(dá)lncRNA的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果

圖6 18種顯著差異表達(dá)lncRNA在其他人肺部細(xì)胞的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果

P9969、P11891、P34635-v4、P12897、P8069、P3377、P30240)存在顯著差異表達(dá),且上述存在差異表達(dá)的lncRNA與RSV繁

3 討論

在RSV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)生著廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化,上述變化直接或間接介導(dǎo)并參與宿主對RSV感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和固有免疫反應(yīng);同時(shí),RSV可以通過黏膜糖蛋白、融合糖蛋白、基質(zhì)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NS)等多種方式和途徑規(guī)避宿主對其產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[5-6]。RSV與宿主之間的相互作用對于抗RSV藥物以及相關(guān)疫苗的開發(fā)具有關(guān)鍵性的指導(dǎo)意義,但既往研究中關(guān)于兩者之間的相互作用更多集中于RSV與宿主蛋白質(zhì)的相互關(guān)系[7],關(guān)于RSV與宿主之間的相互作用尚且需要進(jìn)一步深入研究。

lncRNA作為非編碼RNA分子,在基因重組、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯等生理過程中發(fā)揮重要作用,與多種疾病密切相關(guān)[8-9],特別是lncRNA的異常表達(dá)是導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因。有研究證實(shí),lncRNA在皰疹病毒等DNA病毒、乙肝病毒等RNA病毒與宿主之間的相互作用中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。當(dāng)RSV感染宿主細(xì)胞后,宿主細(xì)胞lncRNA表達(dá)水平可發(fā)生差異化表達(dá),進(jìn)而通過調(diào)控特異性蛋白的編碼基因而干擾病毒復(fù)制過程。本研究結(jié)果顯示:A549細(xì)胞感染RSV后共計(jì)2 415個lncRNA發(fā)生差異表達(dá),包括1 453個上調(diào)lncRNA和962個下調(diào)lncRNA,其中,上調(diào)和下調(diào)最多的lncRNA分別為ENST00000607613.1(FC=165.687)和ENST00000520156.1(FC=23.562);進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果證實(shí),上述差異表達(dá)的lncRNA主要調(diào)控干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、免疫及炎癥等信號通路,且上述結(jié)果經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證得以證實(shí);GO和KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn),差異化表達(dá)的lncRNA主要富集在宿主抗病毒反應(yīng)、干擾素(Ⅰ型)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控等免疫反應(yīng)生物學(xué)過程。這提示,在RSV感染A549細(xì)胞后,免疫反應(yīng)相關(guān)基因在病毒感染及拮抗反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于lncRNA在細(xì)胞中功能的發(fā)揮,邵冰等[11]研究發(fā)現(xiàn),mRNA和lncRNA均可作為競爭性內(nèi)源性RNA,與miRNA位點(diǎn)結(jié)合,從而相互調(diào)節(jié),進(jìn)而推測lncRNA也可能通過內(nèi)源競爭性方式調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。多項(xiàng)研究證實(shí),RSV NS1和NS2能夠通過降低腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3蛋白表達(dá)量發(fā)揮Ⅰ型干擾素分泌抑制作用[12-13]。劉美琴等[14]通過采用互補(bǔ)siRNA對A549細(xì)胞中的lncRNA P3377和P8610進(jìn)行敲低研究發(fā)現(xiàn),RSV感染的A549細(xì)胞中的BST2和OAS2靶基因表達(dá)量明顯降低,表明lncRNA P3377對靶基因OAS2和BST2存在明顯正向調(diào)節(jié)功能,進(jìn)而抑制RSV復(fù)制,發(fā)揮宿主抗病毒抑制作用。

綜上所述,RSV感染A549細(xì)胞后,lncRNA表達(dá)譜產(chǎn)生顯著變化,差異化表達(dá)的lncRNA主要通過炎癥反應(yīng)和干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)調(diào)控過程。