張玉婕, 張 奇, 張 萍, 梁 明

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

高血壓是心房顫動最主要的可改變的心血管危險(xiǎn)因素之一。高血壓不僅在心房顫動患者中非常普遍,也是新發(fā)心房顫動的重要因素[1]。高血壓引起心房顫動的病理生理學(xué)機(jī)制包括:心房電重構(gòu)、血流動力學(xué)變化、神經(jīng)激素的變化[2-4],但這些病理生理學(xué)機(jī)制的潛在遺傳和分子生物學(xué)過程仍不清楚。近年來,隨著對表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)一步深入,越來越多的研究者開始從基因水平探討疾病的相關(guān)靶點(diǎn)和機(jī)制。GEO數(shù)據(jù)庫是一個存儲多種生物信息的信息管理系統(tǒng),是一個在線的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,可以用于檢索各種物種來源的遺傳信息,通過提供基因表達(dá)測量數(shù)據(jù)信息平臺,使更多的研究者能夠進(jìn)行更深入的數(shù)據(jù)挖掘[5-6]。本研究采用GSE24752和GSE75092基因芯片,旨在探尋高血壓與心房顫動的共同基因,以揭示高血壓與心房顫動共同作用的潛在生物學(xué)過程,并從高血壓與心房顫動共同作用的基因中尋找關(guān)鍵基因,以尋找有前景的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載高血壓和心房顫動的基因芯片。高血壓數(shù)據(jù)集GSE24752包含3例高血壓患者和3例血壓正常對照者的外周血細(xì)胞差異基因表達(dá)譜。心房顫動數(shù)據(jù)集GSE75092包含3例心房顫動患者和3例正常對照者的外周血細(xì)胞差異基因表達(dá)譜。將高血壓和心房顫動患者的樣本分別定義為高血壓組和心房顫動組。將正常人的樣本定義為正常組。

1.2 數(shù)據(jù)分析與處理 使用R軟件包Limma(version 3.40.6)進(jìn)行差異分析[7],分析、篩選各數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),以|log2FC|≥1.5和P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出DEGs后,利用R語言,通過RStudio軟件繪制火山圖和熱圖。

1.3 重疊基因功能富集分析 采用在線工具Venny 2.1.0(https://bio Infogp.cnb.csic.es/Tools/venny/index.html)繪制韋恩圖[8],篩選出高血壓和心房顫動DEGs之間的重疊基因,為進(jìn)一步的功能富集分析做準(zhǔn)備。采用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[9],對高血壓和心房顫動之間的重疊基因進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG代謝通路分析,分析其主要的分子生物過程和信號通路,其中,GO基因富集和KEGG通路富集分析的結(jié)果均以圈圖的形式進(jìn)行展示。

1.4 重疊基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[10]構(gòu)建高血壓和心房顫動之間重疊基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),為更好地顯示重疊基因間的關(guān)系,將最大交互者的數(shù)量設(shè)置為≤10個交互者,將形成的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件3.7.2版進(jìn)行可視化[11]分析。將相互作用最大的基因稱為關(guān)鍵基因,其可能在疾病的共病中起核心作用。

2 結(jié)果

2.1 高血壓及心房顫動的DEGs篩選 Limma分析結(jié)果顯示,在GSE24752數(shù)據(jù)集中共篩選出74個DEGs,其中,上調(diào)的DEGs 43個,下調(diào)的DEGs 31個。在GSE75092數(shù)據(jù)集中共篩選出4 584個DEGs,其中,上調(diào)的DEGs 2 011個,下調(diào)的DEGs 2 573個。采用高血壓和心房顫動數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)和下調(diào)的基因各10個,繪制上述基因的熱圖。見圖1、2。

2.2 高血壓相關(guān)心房顫動基因的預(yù)測 對高血壓和心房顫動的重疊基因進(jìn)行可視化分析,可見重疊基因共11個,分別是原癌基因蛋白(MYC)、C4結(jié)合蛋白α(C4BPA)、天然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體3配體1(NCR3LG1)、補(bǔ)體因子D(CFD)、巖藻糖苷酶αL1(FUCA1)、跨膜內(nèi)耳表達(dá)蛋白(TMIE)、微管相關(guān)蛋白1A(SPMAP1)、過氧化還原酶6(PRDX6)、普列克底物蛋白同源物樣域家族A成員2(PLEKHF2)、人補(bǔ)體3A受體1(C3AR1)、頭蛋白(NOG)。見圖3。

圖3 高血壓和心房顫動11個重疊基因的韋恩圖

2.3 高血壓相關(guān)心房顫動基因的GO及KEGG分析 將11個重疊基因?qū)隡etascape系統(tǒng)進(jìn)行GO分析,富集前8位生物學(xué)過程的是白細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫(leukocyte mediated immunity)、補(bǔ)體激活(complement activation)、腎發(fā)育的調(diào)節(jié)(regulation of kidney development)、骨髓白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(myeloid leukocyte mediated immunity)、骨髓白細(xì)胞的活化(myeloid leukocyte activation)、間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生(mesenchyme morphogenesis)、免疫效應(yīng)過程(immune effector process)、參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞活化(cell activation involved in immune response)。這些基因主要集中在白細(xì)胞的活化、免疫的調(diào)節(jié)與免疫效應(yīng)的生物學(xué)過程中。見圖4。

圖4 高血壓和心房顫動重疊基因的GO富集分析 圖5 高血壓和心房顫動重疊基因的KEGG通路富集分析

對11個重疊基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析,并根據(jù)P<0.05的閾值篩選出前5條通路,分別是補(bǔ)體和凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)、TGF-β信號通路(TGF-beta signaling pathway)、金黃色葡萄球菌感染(staphylococcus aureus infection)、其他聚糖降解(other glycan degradation)、甲狀腺癌(thyroid cancer)。見圖5。

2.4 高血壓相關(guān)心房顫動的核心基因篩選 高血壓和心房顫動的重疊基因通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)表示基因,邊表示各基因間的相互作用。使用MCC算法分析整個PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),并根據(jù)每個節(jié)點(diǎn)的重要性進(jìn)行評分。確定了1個關(guān)鍵基因,即MYC。見圖6。

圖6 高血壓和心房顫動關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

高血壓是心房顫動的有力觸發(fā)因素,可增加心房顫動患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。有研究報(bào)道,即使是早期形式的高血壓(高血壓前期和主動脈僵硬)也與心房顫動發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[12]。高血壓也增加了心房顫動不良后果的風(fēng)險(xiǎn)。有研究報(bào)道,在未使用抗凝藥的心房顫動患者中,有高血壓病史的患者發(fā)生中風(fēng)或全身血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)是無高血壓病史患者的1.6倍[13]。嚴(yán)格地控制高血壓患者的血壓可以降低心房顫動的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[14]。盡管,高血壓是心房顫動發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素,但高血壓引起心房顫動的機(jī)制尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析,了解高血壓合并心房顫動的潛在靶點(diǎn)和機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),高血壓相關(guān)心房顫動基因的生物學(xué)功能主要富集在白細(xì)胞的活化、免疫的調(diào)節(jié)與免疫效應(yīng)等生物學(xué)過程中,這與既往研究[15]結(jié)果相一致,高血壓患者體內(nèi)的炎癥因子增多,如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17、IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α、IL-23,免疫系統(tǒng)激活促使抗原遞呈細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用,造成高血壓靶器官的損害[16],而炎癥也可引起心房間質(zhì)纖維化、膠原沉積,促使心房電、結(jié)構(gòu)和自主神經(jīng)的改變,導(dǎo)致心房顫動[17]。

有研究報(bào)道,高血壓可引起補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和補(bǔ)體因子的產(chǎn)生,進(jìn)而加速血管損傷,促進(jìn)高血壓的發(fā)展[18]。首先,補(bǔ)體因子通過其在效應(yīng)細(xì)胞中的特異性受體直接促進(jìn)血管細(xì)胞功能障礙。此外,補(bǔ)體激活介導(dǎo)免疫細(xì)胞募集,并誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。這些共同加重了高血壓引起的器官損傷[19]。與此同時,最近基于英國生物庫的一項(xiàng)隊(duì)列研究表明,自身免疫性疾病,如風(fēng)濕熱、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥,與較大的心房顫動風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[20]。這與本研究中,高血壓和心房顫動重疊基因所富集的通路相符合,即補(bǔ)體相關(guān)通路。

本研究篩選出了高血壓相關(guān)心房顫動的核心基因MYC。張靈等[21]研究發(fā)現(xiàn),高血壓患者的C-MYC表達(dá)升高,C-MYC的表達(dá)水平與血漿中血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素含量呈正相關(guān);原發(fā)性高血壓早中期左室收縮功能正常,但右室舒張功能降低,C-MYC的表達(dá)水平可能與心臟右室舒張功能損害程度一致。此外,升高的C-MYC可能與高血壓誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)相關(guān),即心肌肥大和纖維化[22],而左房的擴(kuò)大和纖維化是心房顫動的標(biāo)志,不僅引發(fā)了心房顫動,而且有助于心房顫動的維持和進(jìn)展[23]。因此,MYC很可能是高血壓和心房顫動的共病基礎(chǔ)。

綜上所述,炎癥、免疫、補(bǔ)體參與了高血壓合并心房顫動的發(fā)病過程,11個重疊基因也參與其中,而MYC作為關(guān)鍵基因,可能是高血壓和心房顫動的共病基礎(chǔ),為高血壓合并心房顫動的治療提供了新的靶點(diǎn)。