鄧葉俊, 黃立新, 張彩虹, 謝普軍

(中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042)

鋅是人體所需的必需微量元素之一,具有重要的生理功能[1]。鋅在機體內(nèi)參與多種生物酶活性中心的組成,直接參與酶的催化與共催化,控制多種生理過程,包括大腦發(fā)育、行為反應、骨骼形成和傷口愈合等,是生長發(fā)育、性腺功能和調(diào)節(jié)新陳代謝必不可少的微量元素[2-3]。此外,鋅對細胞的增殖分化、細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等方面具有重要意義?？梢婁\在人體多種基本生理功能中扮演重要角色,缺鋅可導致一系列疾病的發(fā)生,如免疫功能喪失、發(fā)育不良、代謝紊亂等,嚴重危害人體的生命健康[4-6]。據(jù)統(tǒng)計,目前我國居民缺鋅現(xiàn)狀依然嚴峻,兒童缺鋅問題尤為突出[7]。造成人體缺鋅主要有兩方面原因:一是日常飲食中鋅含量低,二是鋅的吸收不足。膳食中的鋅在消化系統(tǒng)中主要以鋅離子的形式存在,膳食纖維等非消化性碳水化合物的吸附效應可降低鋅在消化系統(tǒng)中的利用度。目前常見的鋅補劑多以有機弱酸為配體,與無機鋅相比,有機鋅增補劑的口感有所改善,對胃腸道的刺激性降低,口服利用率稍有提升[8-9]。但有機鋅增補劑存在合成工藝復雜、吸收率不高等局限性。因此,迫切需要研究開發(fā)穩(wěn)定性強、吸收率高的鋅補劑。

肽和鋅離子構(gòu)建的螯合物具有化學穩(wěn)定性好、生物利用度高、安全無毒等特點[10],引起科研人員的廣泛關注。肽-鋅離子螯合物在消化道各pH值條件下溶解性良好,不僅能減少植酸等抑制劑與其結(jié)合形成不溶性復合物,還能降低膳食纖維對鋅離子的吸附效應,從而有效增加鋅的吸收率[11]。在前期工作中發(fā)現(xiàn),木瓜籽蛋白含量豐富,水解后獲得的小分子肽生物活性強[12],極具應用前景,但目前鮮見木瓜籽肽-鋅離子螯合物相關的報道。本研究構(gòu)建了高螯合率的木瓜籽蛋白水解肽-鋅離子螯合物,同時對其結(jié)構(gòu)進行表征,并評價肽-鋅離子螯合物的穩(wěn)定性,以期為木瓜籽肽的利用和新一代鋅補劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

皺皮木瓜籽,購買于安國大藥房(產(chǎn)地為四川北川);硫酸鋅七水合物、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶,美國Sigma-Aldrich公司;胰蛋白酶及菠蘿蛋白酶,上海麥克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、鉻黑T試劑,上海阿拉丁試劑公司;其他所用試劑均為分析純,實驗中使用的水均為蒸餾水。

電熱恒溫鼓風干燥箱;iS50型紅外光譜(FT-IR)儀,美國Thermo Fisher公司;SpectraMax?i3x酶標儀,美國美谷分子公司;Wizard 2.0冷凍干燥機,美國Virtis公司;L-8800氨基酸自動分析儀,日本日立公司;TU-6紫外-可見(UV-Vis)分光光度計,德國耶拿儀器公司;AA300原子吸收分光光度計,美國PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1木瓜籽肽的制備 干燥的木瓜籽粉碎后采用索氏提取法脫脂,脫脂木瓜籽粕采用堿溶解(pH值10.0)酸沉淀(pH值4.2)法制備分離蛋白。取一定量木瓜籽分離蛋白加入蒸餾水中使其質(zhì)量分數(shù)為10%,攪拌均勻后分別加入1%(以分離蛋白質(zhì)量計)的不同種類蛋白酶,充分混合后在各蛋白酶最適溫度和pH值下水解4 h,水解過程中使用1 mol/L的NaOH或HCl維持體系的酸堿度。水解反應完成后,將反應液置于95 ℃下水浴10 min滅活。冷卻至室溫,水解液于8 000 r/min離心10 min除去不溶物,上清液凍干后獲得不同酶水解木瓜籽肽(CQSP)。

1.2.2木瓜籽肽的超濾 將凍干得到的木瓜籽肽均勻分散于蒸餾水中,使其最終質(zhì)量分數(shù)為8%。于8 000 r/min下離心10 min以除去不溶物,上清液依次通過截留分子質(zhì)量為1 000、 3 000、 5 000和10 000 u的超濾膜后,凍干獲得≤1 000 u、 >1 000～3 000 u、 >3 000～5 000 u、 >5 000～10 000 u和>10 000 u這5個不同分子質(zhì)量范圍的多肽組分。

1.2.3木瓜籽肽-鋅螯合物的制備 參考Sun等[13]報道的方法,調(diào)節(jié)木瓜籽肽溶液(10 g/L)的pH值至6.0后,加入一定量硫酸鋅七水合物,使硫酸鋅濃度為9 mmol/L,充分混勻后于60 ℃下反應1 h。反應完成后,向溶液中加入3倍體積無水乙醇,4 ℃過夜,混合液于8 000 r/min下離心10 min,沉淀物使用50%乙醇洗滌3次后凍干,獲得木瓜籽肽-鋅螯合物(CQSP-Zn)。

1.3 分析方法

1.3.1鋅離子螯合率測定 采用原子吸收分光光度計法測定。準確稱取0.5 g的CQSP-Zn或CQSP于消解管中,加入10 mL硝酸靜置過夜后,于電熱板上加熱(120 ℃)消解1 h,加熱消解期間溶液變?yōu)辄S棕色時適當加硝酸,至溶液透明樣品完全消解,冷卻后加蒸餾水定容至25 mL容量瓶中。利用原子吸收分光光度計進行檢測,同時使用鋅標準溶液建立標準曲線,得回歸方程:y=0.135 1x+0.191 6,R2=0.999 4(質(zhì)量濃度范圍0.8～2.0 μg/L)。對螯合物中的鋅進行定量分析,螯合率通過式(1)計算:

Y=(m1-m2)/m×100%

(1)

式中:Y—鋅離子的螯合率,%;m1—CQSP-Zn中鋅離子質(zhì)量,g;m2—CQSP中鋅離子質(zhì)量,g;m—鋅離子的使用量,g。

1.3.2氨基酸組成分析 CQSP及CQSP-Zn氨基酸組成的測定參考Rezig等[14]的方法加以調(diào)整。稱取20 mg樣品于干燥的試管中,加入4 mL的HCl溶液(6 mol/L),通入氮氣趕走空氣后封管,于110 ℃下水解24 h。水解完成后,冷卻至室溫,以蒸餾水定容至10 mL容量瓶。取2 mL水解液,旋蒸干燥,再以水溶解、旋蒸干燥,重復3次后,加入2 mL檸檬酸鹽緩沖液(pH值2.2,0.55 mol/L)溶解樣品,離心后上清液過0.22 μm濾膜。濾液上氨基酸自動分析儀進行檢測,通過建立標準曲線,對樣品中的氨基酸進行定量。

1.3.3紫外掃描分析 參考劉晶晶等[15]的方法,用蒸餾水配置質(zhì)量濃度為0.1 g/L的木瓜籽肽溶液,向溶液中加入硫酸鋅。以蒸餾水為空白,使用紫外分光光度計測定紫外光譜特征圖譜,掃描范圍為190～500 nm。

1.3.4紅外光譜分析 取2 mg干燥的CQSP或CQSP-Zn粉末樣品,與100 mg干燥的KBr于瑪瑙研缽中研磨均勻(紅外燈下進行)后,放入壓片模具,抽氣加壓獲得透明樣品片,放入測定室內(nèi)采用傅里葉變換紅外光譜儀進行檢測,掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.5熒光光譜分析 參考Fang等[16]的方法略作調(diào)整。用蒸餾水配置質(zhì)量濃度為0.05 g/L的木瓜籽肽溶液,向溶液中加入硫酸鋅。設定激發(fā)波長為280 nm,于300～500 nm范圍的發(fā)射波長內(nèi)記錄熒光強度變化。

1.4 酸堿度對鋅溶解度影響分析

硫酸鋅和CQSP-Zn在不同pH值下溶解性參考Eckert等[17]的方法測定。將50 mg硫酸鋅和50 mg的CQSP-Zn充分溶于25 mL蒸餾水后,分別調(diào)節(jié)體系的pH值為2.0～8.0,搖床振蕩(600 r/min)30 min后,于8 000 r/min離心10 min。上清液消解后,采用原子吸收分光光度計測定上清液中鋅離子含量,通過式(2)計算鋅離子溶解度:

S=m1/m0×100%

(2)

式中:S—鋅離子的溶解度,%;m1—上清液中鋅離子質(zhì)量,g;m0—總的鋅離子質(zhì)量,g。

1.5 模擬胃腸道消化鋅溶解度

硫酸鋅和CQSP-Zn溶解度在模擬胃腸道消化的測定參照O’Loughlin等[18]的方法。將一定量胃蛋白酶加入到150 mmol/L的NaCl溶液中,使其質(zhì)量濃度為4 g/L,作為模擬胃液。取0.45 g胰蛋白酶、 6.25 g NaHCO3及3 g膽鹽溶于100 mL蒸餾水中,作為模擬腸液。稱取2.00 g CQSP-Zn或硫酸鋅于100 mL蒸餾水中攪拌均勻,于37 ℃孵育0.5 h。使用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系pH值至3.5后,加入5 mL模擬胃液后將體系pH值調(diào)節(jié)至2.0,模擬樣品在胃部的消化(37 ℃消化90 min),分別在消化第0、 30、 60和 90 min 時移取5 mL消化液。隨后,使用0.6 mol/L的Na2HPO4調(diào)節(jié)消化液pH值至7.5,按樣品液與模擬胰液體積比10∶1加入模擬胰液,開始模擬樣品在腸道中的消化過程,分別在該過程的第0、 30、 60、 90和150 min移取5 mL消化液。收集的消化液于100 ℃處理10 min滅活,于8 000 r/min下離心10 min,收集上清液消解后測定鋅離子含量,鋅離子溶解度按照式(2)計算。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以3次試驗結(jié)果的平均值±標準誤差(mean±SD)表示,使用Excel軟件進行顯著性差異分析,當P<0.05時差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對Zn2+螯合率的影響

水解蛋白酶的種類及其水解物的分子質(zhì)量是影響Zn2+螯合率的重要因素[19]。為提高CQSP對Zn2+的螯合率,分別對水解木瓜籽分離蛋白酶的種類及構(gòu)建Zn2+螯合物較佳分子質(zhì)量肽段進行了篩選,結(jié)果見表1。由表1可知,5種蛋白酶水解的木瓜籽肽均具有Zn2+螯合能力,但不同酶水解的多肽對Zn2+的螯合能力存在差異。其中風味蛋白酶水解肽Zn2+螯合率最低為24.01%,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解肽Zn2+螯合率相似,堿性蛋白酶水解肽Zn2+螯合率最高為70.84%。這可能是酶的專一性導致的,不同酶在同一蛋白上的酶切位點不同,導致水解釋放出肽段的N端和C端氨基酸組成不同、肽段的長度有差異和氨基酸序列有區(qū)別等,都會影響肽對Zn2+的螯合[20]。由上述分析可知,堿性蛋白酶水解肽的Zn2+螯合率最高,因此選擇堿性蛋白酶為較佳水解酶。

表1 不同條件對Zn2+螯合率的影響

進一步將堿性蛋白酶水解的CQSP根據(jù)分子質(zhì)量大小分為≤1 000 u、>1 000～3 000 u、>3 000～5 000 u、 >5 000～10 000 u及>10 000 u這5種不同分子質(zhì)量的組分,各組分對Zn2+的螯合率見表1。由表可知,分子質(zhì)量對CQSP螯合Zn2+能力有重要影響,分子質(zhì)量越小的肽段對Zn2+螯合率越高,其中分子質(zhì)量≤1 000 u的CQSP對Zn2+螯合率達到83.26%,顯著高于其他組分,這與O’Loughlin等[18]的研究結(jié)果相同。因此選擇分子質(zhì)量≤1 000 u的CQSP構(gòu)建Zn2+螯合物進行深入研究。綜上所述,選擇堿性蛋白酶水解得到的CQSP,以及分子質(zhì)量≤1 000 u的CQSP構(gòu)建CQSP-Zn進行后續(xù)研究。

2.2 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1氨基酸組成分析 經(jīng)堿性蛋白酶水解得到的分子質(zhì)量≤1 000 u木瓜籽肽的氨基酸組成見表2。

表2 CQSP和CQSP-Zn的氨基酸組成

由表可知,CQSP氨基酸含量豐富、種類全面,包含人體所需的全部必需氨基酸,營養(yǎng)價值高。其中,谷氨酸(21.88%)和天冬氨酸(10.46%)為主要氨基酸。根據(jù)Sun等的報道[13],富含谷氨酸和天冬氨酸的多肽往往具有較強的金屬離子螯合能力,因此CQSP對Zn2+的螯合率高可能與其谷氨酸、天冬氨酸含量高有關。當CQSP對Zn2+產(chǎn)生螯合時,由于肽段上氨基酸的極性、親水或疏水性及側(cè)鏈基團的差異,對Zn2+的親和能力會有所區(qū)別,Zn2+會與具有較強親和能力氨基酸上氨基的N原子和羧基的O原子形成配位鍵。單位空間中的氨基酸與Zn2+配位后,氨基酸組成會發(fā)生變化。CQSP螯合Zn2+后的氨基酸組成見表2,CQSP-Zn的谷氨酸及天冬氨酸的量上升,分別由21.88%和10.46%上升至23.45%和12.37%,表明這兩種氨基酸可能參與了對Zn2+的螯合。此外,CQSP-Zn中組氨酸、賴氨酸、精氨酸的量增加明顯,這與之前的研究結(jié)果相似,配位肽中組氨酸、賴氨酸和精氨酸對金屬離子的螯合具有重要作用[13,21]。

圖1 CQSP和CQSP-Zn的紅外光譜

2.2.3紫外光譜分析 多肽中的生色基團具有紫外吸光能力,當這些含有生色基團或助色基團的多肽作為配體與金屬離子發(fā)生鍵合時,其構(gòu)象發(fā)生變化,進而造成配體在光吸收時電子躍遷所需的能量有所差異,因此多肽及其金屬離子螯合物的光學性能存在差異[13]。采用紫外光譜掃描的方法對CQSP及其Zn2+螯合物的特征吸收峰強度和位移進行分析,以確認是否發(fā)生了螯合反應,結(jié)果見圖2。

圖2 CQSP和CQSP-Zn的紫外吸收光譜

2.2.4熒光光譜分析 熒光光譜能有效反映蛋白或多肽與其他分子間的相互作用。蛋白質(zhì)或多肽中含有的芳香型氨基酸,如酪氨酸及苯丙氨酸,在一定激發(fā)波長下可產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。對氨基酸組成的分析發(fā)現(xiàn)CQSP中含有酪氨酸(2.55%)和苯丙氨酸(4.40%),因此可通過觀察熒光強度的變化,探究Zn2+與CQSP間的相互作用。圖3為CQSP及加入不同量Zn2+后CQSP的熒光光譜,如圖所示所有測試樣品在350 nm附近出現(xiàn)最大吸收峰,這與Sun等[13]研究結(jié)果相似,可能是CQSP中芳香型氨基酸在280 nm激發(fā)波長下,于350 nm發(fā)射波長有最大吸收。隨著Zn2+用量逐漸增加,CQSP的熒光強度呈逐漸降低趨勢。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)金屬離子與多肽發(fā)生螯合時,金屬離子可作用于多肽中的芳香型氨基酸,導致熒光強度改變。CQSP熒光強度的降低,表明Zn2+可能與CQSP發(fā)生螯合,形成了CQSP-Zn復合物,發(fā)生熒光猝滅。Beyer等[30]認為金屬離子與多肽螯合時,可形成配位鍵造成氨基酸結(jié)構(gòu)的折疊與聚集,最終引起內(nèi)源性熒光猝滅,熒光強度降低。因此,可推斷CQSP能與Zn2+間發(fā)生配合反應,形成CQSP-Zn螯合物。

圖3 CQSP和CQSP-Zn的熒光光譜

2.3 pH值對鋅離子溶解度的影響

溶解度是影響Zn2+在機體內(nèi)有效性和生物利用度的關鍵因素,而體系的酸堿度對Zn2+溶解度有重要影響。人體胃、腸消化道的pH值存在明顯差異,胃液的pH值一般為2.0,而腸液的pH值則偏弱堿性(7.0～8.0)。因此,研究了無機ZnSO4和CQSP-Zn在不同pH值(2.0～8.0)下Zn2+的溶解度,結(jié)果見圖4。

圖4 pH值對Zn2+溶解度的影響

由圖可知,當pH值為2.0～6.0時,ZnSO4和CQSP-Zn的Zn2+溶解度均較高,這與Eckert等[17]結(jié)果一致,表明Zn2+在酸性條件下能穩(wěn)定存在,有利于其轉(zhuǎn)移至吸收部位(小腸)。當pH值進一步上升至7.0～8.0時,ZnSO4和CQSP-Zn的Zn2+溶解度均出現(xiàn)顯著降低,尤其是ZnSO4在pH值為8.0時溶解度降低至6.60%。這是由于Zn2+在弱堿性條件下可與OH-結(jié)合形成沉淀物,導致溶解度的下降[10]。然而,CQSP-Zn在弱堿性條件下的Zn2+溶解度顯著(P<0.05)高于ZnSO4,當pH值為8時溶解度為73.85%,是ZnSO4的11.19倍。Wang等[22]報道了相似的結(jié)果,牦牛酪蛋白水解物-鐵離子螯合物在堿性條件下具有較高的溶解度,這可能是多肽的螯合作用提高了金屬離子的穩(wěn)定性,避免鋅的沉淀。由于Zn2+的吸收主要集中在小腸,pH值接近8.0,溶解度越高越有利于其吸收,因此CQSP-Zn可能具有更高的生物利用度。

2.4 體外消化模擬結(jié)果分析

除pH值外,胃腸道的消化環(huán)境包括各種蛋白酶和肽酶等,也會使口服鋅補充劑中的Zn2+暴露,影響其溶解度和生物利用度。因此,進一步研究了ZnSO4和CQSP-Zn在模擬胃腸道消化過程中Zn2+的溶解度,結(jié)果見圖5。由圖可知,在模擬胃消化階段(0～90 min),Zn2+溶解度維持在較高水平,這與2.3節(jié)的結(jié)果一致。然而進入模擬腸道消化階段(95～245 min)后,ZnSO4和CQSP-Zn的Zn2+溶解度均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05),特別是ZnSO4的Zn2+溶解度在模擬腸道消化的第0 min時下降至16.24%,顯著低于CQSP-Zn的65.86%。這可能是因為模擬腸液的pH值為弱堿性(7.5),ZnSO4中的Zn2+易形成沉淀物導致溶解度降低,而CQSP-Zn的穩(wěn)定性相對更高,因此溶解度更高。值得注意的是在模擬腸道消化的第30 min,CQSP-Zn中Zn2+溶解度出現(xiàn)上升趨勢,推測可能是胰蛋白酶進一步對分子質(zhì)量≤1 000 u的CQSP發(fā)生了水解作用,產(chǎn)生了分子質(zhì)量更低的小肽,這些小肽對Zn2+的螯合作用更強,因此提高了Zn2+的穩(wěn)定性[31]。綜上可知,CQSP-Zn中Zn2+的溶解度更高,增加了可溶性Zn2+的數(shù)量,有利于Zn2+穿過腸道黏膜,提高Zn2+的生物利用率,強化補鋅功效。

圖5 模擬胃腸道消化對Zn2+溶解度的影響Fig.5 Effect of simulated gastrointestinal digestion on the Zn2+ solubility

3 結(jié) 論

3.1以皺皮木瓜籽為原料,通過蛋白酶水解制備木瓜籽肽,經(jīng)超濾獲得5個不同分子質(zhì)量范圍的多肽組分,并制備CQSP-Zn螯合物,考察了蛋白酶種類和多肽分子質(zhì)量對Zn2+螯合率的影響。結(jié)果表明:利用堿性蛋白酶水解木瓜籽分離蛋白,經(jīng)超濾獲得分子質(zhì)量≤1 000 u的CQSP對Zn2+的螯合能力較強,螯合率可達83.26%。

3.3與無機ZnSO4相比,CQSP-Zn在pH值2.0～8.0范圍以及模擬胃腸道消化各階段中的溶解度更高,具有更好的穩(wěn)定性,因此能提高Zn2+的生物利用度。本研究制備的CQSP-Zn極具作為高效Zn2+增補劑的應用前景。