李文君, 王成章, 雷建都, 周 昊
(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心,江蘇 南京210042; 2.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083; 3.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)
羥基酪醇(HT),化學(xué)名為3,4-二羥基苯乙醇,廣泛存在于橄欖科橄欖屬植物的枝葉和果實中[1],也是油橄欖中重要的多酚類物質(zhì),具有較好的抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[1]、抗炎[4]活性,并對心血管疾病有預(yù)防和治療的作用[5]。但是HT的半衰期很短,生物利用度較低[6-7],從而極大地限制了其進一步的應(yīng)用。因而,本課題組利用薄膜蒸發(fā)法制備得到HT納米脂質(zhì)體脂懸液,使其生物利用度得到顯著提高[8]。但是,由于HT納米脂質(zhì)體脂懸液以液態(tài)形式存在,脂質(zhì)顆粒間易發(fā)生團聚,磷脂層也較易水解、氧化,導(dǎo)致其粒徑變大及HT泄露等[9],且在低溫下,脂懸液也僅能穩(wěn)定存放幾周,穩(wěn)定性較差。為了使HT納米脂質(zhì)體在常溫下也能長期穩(wěn)定的貯存,可以利用真空冷凍干燥技術(shù)將液態(tài)的HT納米脂質(zhì)體脂懸液制備成凍干粉,由于除去了95%以上的水分,因此在室溫下可以長期保存,并能夠在復(fù)溶后迅速還原成原來的狀態(tài)[10]。本研究將從預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間、凍干時間、冷凍保護劑種類及溶液質(zhì)量分數(shù)、穩(wěn)定性等方面考察冷凍干燥技術(shù)對HT脂質(zhì)體凍干粉外觀、再分散性、粒徑和包封率等的影響,篩選得到最佳的凍干條件,并對HT納米脂質(zhì)體凍干粉的貯藏穩(wěn)定性進行評價。
1.1 原料、試劑與儀器
羥基酪醇(HT)標準品(純度≥98%)、氫化卵磷脂、卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;三氯甲烷、甲酸、乙醇,均為分析純;甲醇、乙腈、水,均為HPLC級。
LC-20T高效液相色譜儀,日本島津公司;Nano ZS激光粒度分析儀,英國馬爾文公司;JY92-IIN超聲波細胞粉碎機,上海精其儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;DFY-5/30低溫恒溫反應(yīng)浴,南京沃中儀器設(shè)備有限公司;FD-1C-50+冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;H-7650透射電子顯微鏡,日本日立公司。
1.2 HT分析方法的建立
1.2.1HPLC色譜條件 色譜柱為SUPELCOSILTMLC-18(250 mm×21.2 mm,5 μm),流動相A為1%甲酸溶液,流動相B為含5%甲醇和1%甲酸的乙腈溶液,流速0.8 mL/min,進樣量5 μL,梯度洗脫,以80%A和20%B開始洗脫,7 min內(nèi)流動相B調(diào)整為30%并保持18 min,之后10 min內(nèi)增加流動相B到95%,并保持5 min,最后調(diào)節(jié)流動相B至20%并保持5 min,總運行時間45 min。
1.2.2HPLC標準曲線的繪制 精密稱取HT標準品,分別配制成質(zhì)量濃度為2、 1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.02、 0.01和0.005 g/L的標準溶液,甲醇溶解定容、搖勻,經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后,依次進樣5 μL檢測(進樣3次),以峰面積積分值的平均值為縱坐標(y),標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線并擬合回歸方程。得到HT標準曲線回歸方程為:y=5 366 853x-41 226,R2=0.993 0。
1.3 HT納米脂質(zhì)體脂懸液的制備
根據(jù)先前的實驗方法采用薄膜蒸發(fā)法制備HT納米脂質(zhì)體[8]。準確稱取30 mg的氫化卵磷脂和1.5 mg 的HT,分別溶解在4 mL的三氯甲烷和3 mL的甲醇中,兩者混合后,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在42 ℃下濃縮去除溶劑,待圓底燒瓶內(nèi)部形成白色均勻的涂層即可。然后,加入3 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的蔗糖水溶液(凍干保護劑)[11-12],在65 ℃下水化1 h(20 r/min),再將所得乳液通過細胞破碎儀進行2次超聲波處理,每次5 min,形成均勻的HT納米脂質(zhì)體脂懸液。
1.4 HT納米脂質(zhì)體凍干粉的制備工藝優(yōu)化
1.4.1凍干工藝的考察 將制備好的HT納米脂質(zhì)體脂懸液置于低溫恒溫反應(yīng)浴中進行預(yù)凍后,置于冷凍干燥機進行凍干,考察不同凍干工藝如預(yù)凍溫度(-18、-50 ℃)、預(yù)凍時間(4、 8、 12 h)、凍干溫度-50 ℃下凍干時間(24、 48、 72 h),對樣品的外觀和再分散性的影響,篩選最佳的凍干工藝條件。
1.4.2凍干保護劑的考察 根據(jù)1.3節(jié)的制備條件,首先考察不同種類的單一凍干保護劑(D-海藻糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇)對凍干產(chǎn)品的影響,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,篩選對HT納米脂質(zhì)體凍干粉較為有利的3種凍干保護劑,進行3因素3水平的正交試驗,并通過方差分析確定凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù),篩選最佳的凍干保護劑。
1.5 HT納米脂質(zhì)體包封率
1.5.1脂懸液包封率 脂質(zhì)體制劑的包封率是一個重要的定量評估指標,由添加的藥物總量與脂質(zhì)體中包埋的藥物量計算得出。取0.5 mL的0.5 g/L HT納米脂質(zhì)體脂懸液,加入1 mL甲醇溶液,超聲波處理2 min,12 000 r/min離心10 min。移取上清液用水定容至5 mL,通過HPLC法測定溶液中HT的質(zhì)量濃度,根據(jù)下式計算包封率(η):
η=(C0V0-CV)/C0V0×100%
式中:η—HT納米脂質(zhì)體脂懸液的包封率,%;C0—HT納米脂質(zhì)體脂懸液的質(zhì)量濃度,g/L;V0—HT納米脂質(zhì)體脂懸液的體積,L;C—HPLC法測得的溶液中HT的質(zhì)量濃度,g/L;V—溶液體積,L。
1.5.2凍干粉包封率 測定HT納米脂質(zhì)體凍干粉的包封率時,首先需要將HT納米脂質(zhì)體凍干粉進行復(fù)溶,即已知HT納米脂質(zhì)體凍干粉的實際質(zhì)量及其脂懸液的體積和初始質(zhì)量濃度,取一定質(zhì)量的凍干粉,通過計算得到需加入水的對應(yīng)體積,混合振蕩待其溶解完全后,得復(fù)溶后的HT納米脂質(zhì)體脂懸液,再利用1.5.1節(jié)方法,測定HT納米脂質(zhì)體凍干粉的包封率。
1.6 HT納米脂質(zhì)體凍干粉性能評價
1.6.1外觀 以基本保持原HT納米脂質(zhì)體脂懸液體積、飽滿、不皺縮、不塌陷、可整塊脫落但不散碎為佳,具體以“+++”表示松散、光滑、平整飽滿;以“++”表示輕微的皺縮、塌陷;以“+”表示嚴重皺縮、塌陷;“--”表示不能成型[13]。
1.6.2再分散性 將HT納米脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶,振蕩分散,以能夠快速分散成均勻懸浮液且無不溶顆?;驁F塊為佳,具體以“+++”表示振蕩1 min內(nèi)能復(fù)溶成均勻懸浮液且無不溶顆?;驁F塊;“++”表示振蕩1~3 min內(nèi)能復(fù)溶成均勻懸浮液,但有少量不溶顆粒;“+”表示振蕩5 min內(nèi)仍不能復(fù)溶成均勻懸浮液,樣品黏壁或有部分不溶顆粒(團塊)[14]。
1.6.3粒徑 按優(yōu)化工藝條件制備HT納米脂質(zhì)體凍干粉,按原質(zhì)量濃度復(fù)溶,稀釋一定倍數(shù)后,在25 ℃、散射角90°條件下,采用激光粒度儀測定HT納米脂質(zhì)體的粒徑。
1.6.4微觀結(jié)構(gòu) 首先取一滴樣品脂懸液滴在干燥的載玻片上,把帶有支持膜的銅網(wǎng)放在懸浮液的液珠上漂浮以蘸取樣品,然后用濾紙吸干銅網(wǎng)上多余懸液,再將銅網(wǎng)放在染液(2%的磷鎢酸)滴珠上漂浮,時間約1.5 min,最后用濾紙將染液吸干即可在80 kV的加速電壓下通過透射電鏡觀察脂質(zhì)體樣品的微觀形態(tài)。
1.6.5穩(wěn)定性 按優(yōu)化工藝條件制備HT納米脂質(zhì)體凍干粉,按原質(zhì)量濃度復(fù)溶后,分別在第0 個月、第3個月、第6個月、第9個月、第12個月時再次按照上述方法分別測定其包封率、外觀、再分散性和粒徑。
2.1 凍干工藝篩選結(jié)果分析
2.1.1預(yù)凍結(jié)果分析 根據(jù)預(yù)凍溫度不同,可將預(yù)凍方式分為慢凍(-18 ℃)和速凍(-50 ℃),區(qū)別在于產(chǎn)生冰晶的形態(tài)和大小,這會影響后續(xù)的干燥速率和凍干粉的質(zhì)量[14]。由于物體傳熱是由外向內(nèi),而樣品內(nèi)外存在一定的溫度差,因此需要維持一定的預(yù)凍時間才能消除,使樣品內(nèi)外層溫度一致,使得樣品凍實,避免干燥過程中噴瓶[15]。另外,樣品預(yù)凍的最低溫度至少要低于樣品共熔點10 ℃才能達到較為理想的預(yù)凍效果[16]。不同預(yù)凍方式的試驗結(jié)果(預(yù)凍后再在-50 ℃下冷凍干燥72 h)見表1。由表1可知,-50 ℃下速凍的樣品整體狀態(tài)優(yōu)于-18 ℃下的慢凍樣品,并呈現(xiàn)出較好的外觀,且預(yù)凍溫度越低,預(yù)凍時間越長,外觀越平整飽滿,振蕩1 min內(nèi)能復(fù)溶成均勻懸浮液。但是,為了避免預(yù)凍過程增加不必要的能耗,選擇速凍8 h為宜。
表1 預(yù)凍結(jié)果分析1)
2.1.2凍干時間 凍干主要分為升華和解吸兩個過程,升華的溫度一般要低于共熔點,否則樣品會融化,易出現(xiàn)干縮現(xiàn)象,約90%以上的游離水分將在升華過程中除去;解吸可使樣品溫度快速升高至許可的最高溫度并保持到干燥結(jié)束,此階段主要以結(jié)晶水、吸附于晶格間隙中的水及以氫鍵結(jié)合的水的除去為主,由于這些水吸附能量高,所以此過程需要足夠的時間[17]。先在-50 ℃下預(yù)凍8 h,然后在-50 ℃下冷凍干燥24、 48和72 h,干燥結(jié)果如表2所示。凍干時間分別為48和72 h時,樣品在外觀和再分散性上基本沒有區(qū)別,在含水率方面72 h時的樣品稍低于48 h的。因此,為了達到最好的實驗效果,凍干時間選擇72 h。
表2 干燥結(jié)果分析
2.2 凍干保護劑篩選結(jié)果分析
2.2.1單一凍干保護劑種類 以外觀、再分散性、平均粒徑、包封率等參數(shù)為指標,對樣品凍干保護劑進行篩選。在2.1節(jié)優(yōu)化的凍干工藝條件下,以不加任何凍干保護劑所制得的HT納米脂質(zhì)體凍干粉為空白對照,考察分別添加質(zhì)量分數(shù)為10%的不同種類單一凍干保護劑(D-海藻糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇)對凍干產(chǎn)品的影響,結(jié)果見表3。
表3 單一凍干保護劑種類的篩選
由表3可知,不同種類凍干保護劑對HT納米脂質(zhì)體的外觀、再分散性和凍干前后的平均粒徑、包封率均有不同的影響;相比于凍干前,整體上有凍干保護劑的樣品凍干并復(fù)溶后平均粒徑會有所增加,其原因可能是在凍干過程中由于脂懸液失水導(dǎo)致納米脂質(zhì)體顆粒之間發(fā)生了融合或聚集[18],并在復(fù)溶時補液使脂質(zhì)體發(fā)生了雙層膨脹導(dǎo)致粒徑的增加[19];另外,在冷凍和干燥過程中由于凍干保護劑為了保護脂質(zhì)體脂懸液的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生各種應(yīng)力,這些應(yīng)力往往也會產(chǎn)生團聚現(xiàn)象而導(dǎo)致粒徑增加[20]。同時,從表3也可以看出,復(fù)溶后再分散性較好的凍干保護劑為D-海藻糖和蔗糖,其凍干粉進行復(fù)溶后平均粒徑的增加較少[21-22],可能是團聚現(xiàn)象不明顯的結(jié)果。但是,單一的凍干保護劑并不能達到理想的凍干效果,綜合考慮,以D-海藻糖、蔗糖、甘露醇的不同配比作為復(fù)合凍干保護劑,可能達到更好的效果。
2.2.2正交試驗優(yōu)化 在凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù)為10%的條件下,以D-海藻糖(A)、蔗糖(B)、甘露醇(C)3種凍干保護劑的質(zhì)量比為因素,按L9(34)表設(shè)計正交試驗,正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表4,方差分析結(jié)果見表5。分析可知,D-海藻糖(A)、蔗糖(B)、甘露醇(C)對HT納米脂質(zhì)體凍干粉包封率均有顯著影響,且影響大小為RC>RB>RA,但對平均粒徑的影響不顯著,因此正交試驗的最優(yōu)因素組合應(yīng)為A3B2C1,即m(D-海藻糖)∶m(蔗糖)∶m(甘露醇)=4∶2∶1。
表4 正交試驗設(shè)計與結(jié)果1)
表5 方差分析結(jié)果
2.2.3凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù) 在m(D-海藻糖)∶m(蔗糖)∶m(甘露醇)=4∶2∶1條件下,考察凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù)(2.5%、 5%、 10%、 15%)對凍干粉外觀、含水率、再分散性及凍干后包封率、粒徑的影響,結(jié)果見表6。
由表6可知,復(fù)合凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù)為10%和15%時,凍干粉外觀、含水率、再分散性良好,相比表3中使用單一凍干保護劑D-海藻糖、蔗糖、甘露醇時,平均粒徑變化不大,但包封率有所提高。而溶液質(zhì)量分數(shù)為15%時,可能由于糖含量較高,且其本身屬于無定形保護劑,凍干時結(jié)晶產(chǎn)生了少量的大顆粒,復(fù)溶時出現(xiàn)渾濁,導(dǎo)致再分散時效果不好[13,23-24]。因此,綜合考慮,選擇凍干保護劑溶液質(zhì)量分數(shù)為10%。
2.2.4驗證實驗 按照1.3節(jié)工藝制備HT納米脂質(zhì)體脂懸液,-50 ℃下速凍8 h,凍干72 h,凍干保護劑為m(D-海藻糖)∶m(蔗糖)∶m(甘露醇)=4∶2∶1,溶液質(zhì)量分數(shù)為10%,制備3份HT納米脂質(zhì)體凍干粉,結(jié)果表明:凍干粉外觀松散、光滑、平整飽滿(外觀+++),振蕩1 min內(nèi)能復(fù)溶成均勻懸浮液且無不溶顆?;驁F塊(再分散性+++),含水率3.28%±0.23%,平均粒徑(125.24±1.58) nm,包封率69.74%±0.94%,RSD值分別為2.15%、 1.94%、 2.21%,均小于5%,表明該工藝較為穩(wěn)定可靠。
2.2.5微觀結(jié)構(gòu)分析 由HT納米脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶后用透射電鏡(TEM)觀察其微觀結(jié)構(gòu),結(jié)果見圖1。由圖可知,凍干粉復(fù)溶后納米粒子外觀圓整、表面光滑、大小均一,可清晰觀察到磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),說明HT納米脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶后脂質(zhì)體形態(tài)未發(fā)生明顯改變,利用冷凍干燥工藝延長HT納米脂質(zhì)體的貯藏期效果是可靠的。
a.1μm; b.200 nm; c.100 nm
2.3 貯藏穩(wěn)定性評價
在上述優(yōu)化工藝條件下制備HT納米脂質(zhì)體凍干粉,分別在不同溫度(4、 25 ℃)下、貯藏不同時間(0、 3、 6、 9和12個月)后,考察其外觀、含水率、顏色、再分散性、平均粒徑和包封率的變化,結(jié)果見表7。
表7 貯藏溫度和貯藏時間對HT納米脂質(zhì)體凍干粉穩(wěn)定性的影響
由表可知,低溫下凍干粉的貯藏效果均優(yōu)于同等條件時室溫下的貯藏效果,但隨著貯藏時間的延長,凍干粉的外觀逐漸顯現(xiàn)出塌陷的現(xiàn)象,且略微變紅,這可能是由于HT泄露或者未被包埋的HT經(jīng)過長時間的貯藏而被氧化所致;隨著貯藏時間的延長,凍干粉的再分散性也受到了影響,這可能是由于貯藏過程中難以避免的輕微吸水、受潮導(dǎo)致的;由于再分散性的影響,導(dǎo)致粒徑也隨著貯藏時間的延長逐漸變大;此外,由于HT的氧化和泄露問題導(dǎo)致包封率也逐漸減小。分析可知,4 ℃下貯藏6個月時,HT納米脂質(zhì)體凍干粉穩(wěn)定性較好,性能沒有明顯變化。
3.1考察了HT納米脂質(zhì)體脂懸液的冷凍干燥工藝,試驗結(jié)果表明:-50 ℃下速凍8 h,冷凍干燥72 h,所得的凍干粉外觀、再分散性較好。
3.2通過正交試驗對凍干保護劑進行篩選,結(jié)果表明:當(dāng)m(D-海藻糖)∶m(蔗糖)∶m(甘露醇)=4∶2∶1且溶液質(zhì)量分數(shù)為10%時,所制備的HT納米脂質(zhì)體凍干粉的外觀、含水率、再分散性良好,粒徑和包封率均可達到較好的效果。復(fù)溶后觀察其TEM微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):該納米粒子外觀圓整、表面光滑、大小均一,可清晰觀察到磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),即利用冷凍干燥工藝延長HT納米脂質(zhì)體的貯藏期效果是可靠的。
3.3將HT納米脂質(zhì)體凍干粉在低溫和室溫下貯藏不同時間,通過外觀、含水率、顏色、再分散性、平均粒徑和包封率的變化考察其穩(wěn)定性,結(jié)果表明:低溫更利于HT納米脂質(zhì)體凍干粉的穩(wěn)定貯藏。