崔志華,蔣麗媛,井磊,王亞珍

(保定市第一醫(yī)院腫瘤科,河北 保定 071000)

近年來肝癌發(fā)病率呈上升趨勢,晚期肝癌患者失去了根治性切除的機(jī)會(huì)[1-3],只能保守治療,部分患者即使行姑息性切除術(shù),但5年生存率僅為10%左右[4],所以尋找肝癌有效的治療方案可使廣大晚期肝癌患者獲益。血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ,AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要效應(yīng)介質(zhì),可通過其受體發(fā)揮作用[5-7]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)能夠抑制腫瘤新生血管生成,證明Ang II可能具有血管生成等生物學(xué)效應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)主要研究Ang II1型受體拮抗劑(AngiotensinⅡ type 1 recepeor,AT1 ) 坎地沙坦對肝癌小鼠新生血管生成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、H22肝癌細(xì)胞株及試劑

肝癌H22細(xì)胞株(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。雄性BALB/C小鼠(清潔級Ⅱ)鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。主要試劑:Ang II1型受體拮抗劑(AT1)坎地沙坦西酯片(日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社);兔抗小鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司);EnVision免疫組化試劑盒(美國Dako公司);氟尿嘧啶注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

1.2 建模及分組

1.2.1 腫瘤細(xì)胞懸液的制備及細(xì)胞活力計(jì)數(shù)檢測 將保種7 d的種鼠脫頸處死,抽取腹水至無菌離心管內(nèi),800 r/min離心3 min,按1∶5加生理鹽水稀釋混勻,制成腫瘤細(xì)胞懸液。取0.5 mL腫瘤細(xì)胞懸液于無菌管中,加入0.4% 0.5mL臺(tái)盼蘭染色鐘,光學(xué)顯微鏡下觀察活細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞不被臺(tái)盼蘭染色,呈無色透明狀)。計(jì)算細(xì)胞活力>90%(細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。同時(shí)檢測細(xì)胞計(jì)數(shù),并根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整腫瘤細(xì)胞懸液濃度至5×106個(gè)/mL。

1.2.2 造模及分組 110只BALB/C小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,注入約1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞懸液完成建模。選擇建模成功的BALB/C小鼠100只,采用數(shù)字表隨機(jī)法分為空白對照組(NEC組)、低劑量坎地沙坦組(LCA組)、中劑量坎地沙坦組(MCA組)、高劑量坎地沙坦組(HCA組)、氟尿嘧啶組(5-FU組) ,每組各20只。

1.3 方法

各組小鼠均常規(guī)相同的飼養(yǎng),環(huán)境溫度調(diào)節(jié)在(20±2)℃,實(shí)驗(yàn)過程中不控制飼料攝入量,不限制飼料成分。各組小組均在建模后24 h開始治療。NEC組:0.9%生理鹽水0.6 mL灌胃,1次/d,連續(xù)8 d。LCA組、MCA組、HCA組各50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg坎地沙坦灌胃,1次/d,連續(xù)8 d。5-FU:5-FU 25 mg/kg,腹腔注射,1次/d,連續(xù)6 d后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)體重及腫瘤生長情況:建模前、治療第2、4、6、8天給藥前先給小鼠秤重,觀察體重變化,記錄各小鼠建模至可見腫瘤時(shí)間。(2)治療后第9 天,每組小鼠各隨機(jī)選取10只脫頸處死,拔取完整腫瘤組織,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑和垂直徑,計(jì)算腫瘤體積并稱重,計(jì)算抑瘤率[抑瘤率=(NEC組瘤重-各實(shí)驗(yàn)組瘤重)/NEC組瘤重×100%]。將腫瘤體積等分切開,一份用4%戊二醛固定用透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡;另一份用10%福爾馬林固定,行HE染色作組織病理學(xué)檢查,觀察腫瘤組織Ang II1型受體陽性率,計(jì)算抑瘤率;應(yīng)用免疫組化法標(biāo)記VEGF;應(yīng)用EnVision免疫組化二步法檢測腫瘤組織微血管密度。(3)各組剩余的10只小鼠停藥后不處死,繼續(xù)飼養(yǎng),記錄存活時(shí)間。

1.5 結(jié)果判定

VEGF陽性判定標(biāo)準(zhǔn):以棕黃色染色的細(xì)胞漿或細(xì)胞膜為陽性,根據(jù)陽性細(xì)胞占比與強(qiáng)度計(jì)分,無陽性細(xì)胞和無染色計(jì)0分;陽性細(xì)胞占1%～25%,染色強(qiáng)度弱計(jì)1分;陽性細(xì)胞占26%～50%,染色強(qiáng)度中計(jì)2分;陽性細(xì)胞占51%～75%,染色強(qiáng)度強(qiáng)計(jì)3分;陽性細(xì)胞占76%～100%,計(jì)4 分。VEGF陽性分值=陽性細(xì)胞占比評分+染色強(qiáng)度評分。

微血管密度(MVD)判定:分別用低倍(100×)和高倍(400×)鏡在腫瘤組織微血管最豐富區(qū)域選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)微血管數(shù),取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重情況

各組小鼠建模前體重比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后4 d、6 d、8 d ,5-FU組小鼠體重低于建模前,其余4組均高于建模前(P<0.05)。組間兩兩比較:治療后4 d、6 d、8 d,5-FU組體重均低于其余4組;治療后8 d, MCA組、HCA組小鼠體重低于NEC組、LCA組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠建模前后體重比較

2.2 各組治療9 d后瘤體重量和抑瘤率比較

各組瘤體體積、瘤體質(zhì)量組間兩兩比較:NEC組>LCA組>MCA組>HCA組、5-FU組(P<0.05);抑瘤率組間兩兩比較:LCA組LCA、MCA組>HCA組(P<0.05)。見圖1。MVD組間兩兩比較:NEC組、5-FU組>LCA組>MCA組>HCA組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠治療9 d后瘤體重量和抑瘤率比較

2.3 透射電鏡結(jié)果

JEOL-1200EX透射電鏡(放大倍速數(shù)50萬倍)觀察顯示,NEC組小鼠腫瘤組織細(xì)胞核大深染,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,形態(tài)不規(guī)則,核質(zhì)比例增大,胞質(zhì)內(nèi)可見許多空泡,未見細(xì)胞凋亡征象;LCA、MCA、HCA、5-FU組小鼠腫瘤組織均可見不同階段的凋亡細(xì)胞;各組凋亡細(xì)胞數(shù)量由高到低排序?yàn)?HCA組、MCA組、LCA組和5-FU組。LCA組腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮,表面有微絨毛,胞膜完整,部分線粒體可見嵴和膜的融合、消失;MCA組腫瘤組織細(xì)胞核染色質(zhì)聚集,胞膜較完整,線粒體呈空泡狀,髓樣化;HCA組核染色質(zhì)高度濃縮,胞膜部分完整,線粒體髓樣化,呈囊泡狀或空泡狀,嵴雜亂無章,膜包裹內(nèi)可見胞核碎片凋亡小體。5-FU組腫瘤細(xì)胞排列較規(guī)則,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,細(xì)胞器較少,胞質(zhì)較多,膠原纖維增生明顯,核周隙寬。見圖2。

2.4 腫瘤進(jìn)展及生存情況比較

各組小鼠建模至可見腫瘤時(shí)間、平均存活時(shí)間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。建模至可見腫瘤時(shí)間組間兩兩比較:LCA、MCA、HCA、5-FU組均長于NEC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。平均存活時(shí)間組間兩兩比較:HCA組>MCA組、5-FU組>LCA組>NEC組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠建模至可見腫瘤時(shí)間和平均存活時(shí)間比較

3 討論

腫瘤形成初期主要靠彌散,當(dāng)體積≥2 mm3時(shí),其所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等就必須依靠血管供應(yīng),一旦腫瘤新生血管生成受到抑制,癌細(xì)胞所需的營養(yǎng)供應(yīng)減少或阻斷,會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡、壞死,繼而出現(xiàn)腫瘤退化、萎縮[9-11]。因此,抑制腫瘤新生血管的生成是治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn),也是腫瘤靶向治療的新途徑。目前有研究在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá),且AngⅡ受體主要是AT1[12-14]。新生血管生成是公認(rèn)的實(shí)體腫瘤預(yù)后評估的有價(jià)值的因素,同樣也可用于肝癌預(yù)后的評估。腫瘤誘導(dǎo)新生血管生成的過程十分復(fù)雜,多種細(xì)胞因子起著重要的作用,其中VEGF是介導(dǎo)血管生成最重要的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組VEGF陽性評分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEGF陽性評分組間比較:NEC組、5-FU組>LCA、MCA組>HCA組(P<0.05)。而5-FU組小鼠腫瘤組織VEGF陽性評分與NEC組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明AT1可抑制小鼠腫瘤組織VEGF表達(dá),且存在劑量依賴性,劑量越大,對腫瘤組織VEGF表達(dá)的抑制作用越強(qiáng)。而5-FU對小鼠腫瘤組織VEGF表達(dá)無明顯的抑制作用。

MVD是評價(jià)血管生成狀況的可靠指標(biāo),可反映血管生成程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MVD組間比較:NEC組、5-FU組>LCA>MCA組>HCA組(P<0.05)。提示AT1可能顯著抑制肝癌小鼠新生血管的生成,降低腫瘤組織的微血管密度,且呈劑量依賴性。臨床常用的化療藥物5-FU抑制新生血管生成的作用并不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組瘤體體積、瘤體重量組間兩兩比較:NEC組>LCA組>MCA組>HCA組、5-FU組(P<0.05)。抑瘤率組間兩兩比較:LCA組

延長肝癌的生存期,提高生活質(zhì)量也是肝癌治療的主要目的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠模型建立后在腫瘤生長期間,NEC、LCA、MCA、HCA組小鼠體重持續(xù)增加,但增加幅度隨著藥物劑量的增加呈下降趨勢。只有5-FU組小鼠體重持續(xù)減輕,通過觀察發(fā)現(xiàn),5-FU組小鼠治療期間所有小鼠均出現(xiàn)了不同程度的腹瀉,藥物的副反應(yīng)影響了該組小鼠的食欲,這就是5-FU組小鼠體重不增反降的可能原因。而觀察NEC、LCA、MCA、HCA各組小鼠,建模后進(jìn)食量較之前無明顯變化,未發(fā)現(xiàn)腹瀉及其它副反應(yīng),小鼠體重因劑量增加而減輕可能與腫瘤重量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組平均存活時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組平均存活時(shí)間組間比較,HCA組>MCA組、5-FU組>LCA組>NEC組(P<0.05)。說明AT1能顯著延長肝癌小鼠的生存時(shí)間,且隨著AT1劑量的增大,小鼠生存時(shí)間明顯增加,呈劑量依賴性。透射電鏡觀察顯示,NEC組小鼠腫瘤組織未見細(xì)胞凋亡征象;LCA、MCA、HCA、5-FU組小鼠腫瘤組織均可見不同階段的凋亡細(xì)胞;各組凋亡細(xì)胞數(shù)量由高到低排序?yàn)?HCA組、MCA組、LCA組和5-FU組。

綜上,AT1可抑制肝癌小鼠移植瘤的生長和新生血管生成,延長小鼠生存時(shí)間,其抑郁作用存在量效依賴性。提示AT1有可望成為肝癌治療的安全有效藥物。本實(shí)驗(yàn)初步探討了AT1在體內(nèi)對肝癌的抑制作用及機(jī)制,為肝癌分子發(fā)病機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ),為肝癌治療模式的改進(jìn)提供新途徑,但AT1的抗肝癌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。