樊佳,鄭良建,袁夢(mèng)珍,詹庭亭,張榕珂,張軍

(成都市第三人民醫(yī)院腫瘤科,四川 成都 610000)

腎細(xì)胞癌是常見(jiàn)的泌尿道惡性腫瘤,大約15%的腎細(xì)胞癌患者診斷時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。隨著早癌篩查的不斷普及,腎細(xì)胞癌的死亡率有了很大改善[2]。但由于腫瘤的異質(zhì)性,腎細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)率仍較高[3]。因此,預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案,探索新的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。銅死亡是一種新型細(xì)胞程序性死亡方式[4]。銅在正常范圍內(nèi)是一種機(jī)體代謝必須的輔助因子,當(dāng)銅離子在細(xì)胞內(nèi)含量超過(guò)閾值時(shí)會(huì)與線粒體中的脂?；鞍捉Y(jié)合。脂?；鞍椎木奂丸F硫簇蛋白的丟失共同誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞銅死亡的發(fā)生[5]。本研究以免疫微環(huán)境相關(guān)性的角度出發(fā),發(fā)現(xiàn)SLC31A1與部分腎細(xì)胞癌免疫浸潤(rùn)細(xì)胞呈正相關(guān)。SLC31A1是一種存在于細(xì)胞膜上的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在以往的研究中被發(fā)現(xiàn)與順鉑的耐藥相關(guān)[6]。SCL31A1被認(rèn)為與乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌的預(yù)后相關(guān)[7-9]。但SCL31A1在腎細(xì)胞癌中的作用尚不清楚?；诖?本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的干濕結(jié)合方法共同探討SCL31A1在腎細(xì)胞癌的預(yù)后生存和細(xì)胞功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xena.ucsc.edu/)下載癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)[10]。

1.2 銅死亡相關(guān)基因在正常組織和腫瘤組織中表達(dá)差異分析

使用R語(yǔ)言中的“l(fā)imma”包完成銅死亡基因在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異分析[11]。

1.3 免疫組化圖像

銅死亡相關(guān)基因在正常腎組織和腎癌中的免疫組化圖像下載自The human protein atlas (HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)[12]。

1.4 腫瘤免疫浸潤(rùn)分析

使用ssGSEA計(jì)算腎癌患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)得分[13],使用Spearman相關(guān)性分析計(jì)算免疫細(xì)胞浸潤(rùn)得分與銅死亡相關(guān)基因表達(dá)之間的關(guān)系。

1.5 臨床分期相關(guān)性分析

使用R語(yǔ)言計(jì)算并比較不同臨床分期組之間SLC31A1的表達(dá)情況,使用ggplot包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.6 生存與獨(dú)立預(yù)后分析

使用Kaplan-Meier (KM)分析SLC31A1表達(dá)和預(yù)后之間的關(guān)系。獨(dú)立預(yù)后分析采用單因素與多因素COX分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)藥品及試劑盒

細(xì)胞培養(yǎng)基采用DMEM (Hyclone,USA);10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,USA);抗生素采用青-鏈霉素雙抗(索萊寶);胰酶(美國(guó) Gbico);RNA提取采用總RNA提取試劑盒(上海飛捷);RNA逆轉(zhuǎn)錄采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。RT-qPCR采用Takara熒光實(shí)時(shí)定量qPCR試劑盒;細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛);轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基opti-MEM(美國(guó) Gbico);轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選采用嘌呤霉素(索萊寶);克隆形成實(shí)驗(yàn)固定細(xì)胞采用4%多聚甲醛(索萊寶);克隆染色采用草酸銨結(jié)晶紫染色液(索萊寶)。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

將HK-293T細(xì)胞(Human embryonic kidney 293 cell)、786-O細(xì)胞(Renal cell carcinoma 786-O cell)、A498細(xì)胞(Human kidney carcinoma A498 cell)和769-P細(xì)胞(Renal cell carcinoma 769-P cell)置于5% CO2的37 ℃恒溫孵箱中采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。RNA提取:每例樣本胰酶消化約5×106個(gè)細(xì)胞,采用硅膠柱純化技術(shù)試劑盒提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用RT-qPCR技術(shù)將RNA提取物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系:2 μg總RNA提取物溶解于16 μL無(wú)酶水然后加4 μL ScriptTM Master Mix。實(shí)時(shí)熒光定量PCR:每組樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。PCR體系為:cDNA 5 μL、無(wú)酶水3.2 μL、TB II SYBR?Premix ExTaqTM1 μL、前引物與后引物各0.4 μL。

1.9 腎癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SLC31A1分子

SLC31A1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)買自吉?jiǎng)P基因(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)。采用6孔板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,在6孔板中細(xì)胞密度至70%～90%開(kāi)始轉(zhuǎn)染,主要體系為A:125 μL opti-MEM+5 μL lipo3000,B:125 μL opti-MEM+1～2.5 μg DNA+2～5μL P3000。將A和B輕柔混勻30 min后加入6孔板上清開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后采用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功并轉(zhuǎn)錄過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的769-P細(xì)胞。

1.10 克隆形成實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)

769-P野生型細(xì)胞株及SLC31A1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株消化后分別置于6孔板中用于克隆形成實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)。克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度1 000個(gè)/孔,培養(yǎng)7 d或肉眼發(fā)現(xiàn)明顯克隆形成后取出孵箱,棄培養(yǎng)基后PBS洗3遍,多聚甲醛固定后PBS洗3遍,隨后數(shù)清楚各孔中克隆個(gè)數(shù)并完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度1 000個(gè)/孔,待細(xì)胞貼壁后用槍頭于孔中央劃出劃痕,于劃痕后0 h和24 h觀察劃痕修復(fù)情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);臨床分期相關(guān)分析采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test);評(píng)估對(duì)腎細(xì)胞癌預(yù)后采用Kruskal-Meier分析,影響預(yù)后因素采用COX分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅死亡相關(guān)基因在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示除ATP7B在腫瘤組織中呈相對(duì)高表達(dá)外,FDX1、DLD、DBT、SLC31A1、ATP7A、GCSH、DLST、DLAT、PDHA1、PDHB在腫瘤組織中表達(dá)水平均低于正常組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),FDX1、DLD、DBT、SLC31A1、ATP7A、GCSH、DLST、DLAT、PDHA1、PDHB在腫瘤組織中的蛋白水平均低于正常組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 銅死亡相關(guān)基因在腎細(xì)胞癌中與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系

在腎細(xì)胞癌中LIPT1、LIAS、GCSH、PDHA1、ATP7B等銅死亡相關(guān)基因主要與浸潤(rùn)免疫細(xì)胞負(fù)相關(guān)。而SLC31A1主要與浸潤(rùn)免疫細(xì)胞呈正相關(guān),且正相關(guān)免疫細(xì)胞種類最多。SLC31A1與包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及B細(xì)胞等17種免疫細(xì)胞正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 SLC31A1與腎細(xì)胞癌的臨床分期相關(guān)性

鑒于SLC31A1在腎細(xì)胞癌中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞呈正相關(guān),通過(guò)TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息對(duì)SLC31A1與腎細(xì)胞癌患者臨床分期的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示在T分期中,SLC31A1在T3-4期中的表達(dá)水平低于T1期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在M分期中,SLC31A1在有轉(zhuǎn)移M1期中的表達(dá)水平低于無(wú)轉(zhuǎn)移M0期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SLC31A1在N分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在TNM分期中,SLC31A1在Ⅲ期及Ⅳ期的表達(dá)水平低于I期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 SLC31A1在腎細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值

為進(jìn)一步探索SLC31A1在腎細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值,通過(guò)對(duì)TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。生存分析顯示,SLC31A1高表達(dá)腎細(xì)胞癌患者的PFS優(yōu)于SLC31A1低表達(dá)的患者[HR:0.43(0.31～0.60),P<0.05]。SLC31A1高表達(dá)腎細(xì)胞癌患者的OS也同樣優(yōu)于SLC31A1低的患者[HR:0.51(0.38～0.70),P<0.05]。森林圖結(jié)果顯示SLC31A1在單因素和多因素COX分析中都是腎細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5 SLC31A1在腎正常細(xì)胞與腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)SLC31A1在腎正常細(xì)胞與腎癌細(xì)胞系的表達(dá)結(jié)果與免疫組化一致,SLC31A1在腎正常細(xì)胞HK293T的表達(dá)水平高于腎癌細(xì)胞系786-O、A498及769-P,其中SLC31A1在769-P細(xì)胞中的表達(dá)最低。故選用769-P細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖5。

2.6 腎癌細(xì)胞模型中過(guò)表達(dá)SLC31A1

對(duì)SLC31A1表達(dá)量最低的腎癌細(xì)胞769-P轉(zhuǎn)染SLC31A1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)SCL31A1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后769-P細(xì)胞中SLC31A1的表達(dá)高于野生型769-P細(xì)胞,成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)SLC31A1 769-P細(xì)胞株。見(jiàn)圖6。

2.7 過(guò)表達(dá)SLC31A1抑制腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力

采用克隆形成試驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較野生型769-P細(xì)胞株和過(guò)表達(dá)SLC31A1的769-P細(xì)胞株的細(xì)胞增殖和侵襲能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SLC31A1的769-P細(xì)胞克隆形成數(shù)量低于野生型的769-P細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示類似的趨勢(shì),過(guò)表達(dá)SLC31A1的769-P細(xì)胞株相對(duì)于野生型,其劃痕修復(fù)能力下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

腎細(xì)胞癌作為常見(jiàn)的泌尿道惡性腫瘤,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是主要的失敗模式[14]。細(xì)胞死亡一直是探索生物標(biāo)記物的主要研究領(lǐng)域,多種程序性細(xì)胞死亡被發(fā)現(xiàn)在腫瘤預(yù)后及免疫預(yù)測(cè)上具有重要價(jià)值,包括焦亡、鐵死亡等[15-16]。銅死亡作為新型細(xì)胞死亡方式,在作為生物標(biāo)記物的作用并不明確。

銅死亡相關(guān)基因已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的預(yù)后和免疫作用相關(guān),如Hu等[17]發(fā)現(xiàn)銅死亡基因與肺腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。Lv等[18]發(fā)現(xiàn)在銅死亡相關(guān)基因LIPT1、PDHA1和SLC31A1與黑色素瘤的預(yù)后顯著相關(guān),其中LIPT1與黑色素瘤的瘤內(nèi)免疫抑制細(xì)胞Treg呈負(fù)相關(guān)。Li等[19]通過(guò)對(duì)胃癌轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),銅死亡相關(guān)基因可用于將胃癌分為兩種不同的免疫微環(huán)境亞組,并建立預(yù)后模型準(zhǔn)確判斷胃癌的預(yù)后。

本研究全面分析SLC31A1在腎癌預(yù)后中的預(yù)測(cè)價(jià)值和腎癌細(xì)胞系的主要功能。我們發(fā)現(xiàn)在mRNA表達(dá)水平上,除了LIPT1,LIAS和ATP7B外的銅死亡相關(guān)基因在腎細(xì)胞癌中相對(duì)于正常組織呈低表達(dá)。來(lái)自HPA的數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一點(diǎn)。這說(shuō)明腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展可能抑制了銅死亡相關(guān)基因的表達(dá)。我們?cè)陔S后的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn),SLC31A1與多達(dá)17種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞正相關(guān),包括了固有免疫中的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞,也包括適應(yīng)性免疫中的CD4+T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞及B細(xì)胞等腫瘤殺傷細(xì)胞。這可能是由于SLC31A1誘導(dǎo)銅死亡后產(chǎn)生免疫源性細(xì)胞死亡導(dǎo)致的。因此,本研究將重點(diǎn)研究SLC31A1在腎細(xì)胞癌中的作用。

臨床特征相關(guān)性分析顯示,SLC31A1表達(dá)水平與T分期、M分期和TNM分期負(fù)相關(guān),說(shuō)明SLC31A1可能在一定程度上具有抑制腎細(xì)胞癌侵襲或轉(zhuǎn)移的能力。這種抑制能力可能實(shí)現(xiàn)了對(duì)生存分析的獲益,隨后的生存分析顯示,SLC31A1高表達(dá)的患者無(wú)論是PFS還是OS都顯著優(yōu)于SLC31A1低表達(dá)的患者。單因素和多因素的COX分析森林圖也顯示SLC31A1是腎細(xì)胞癌預(yù)后獨(dú)立保護(hù)因素。

為進(jìn)一步驗(yàn)證SLC31A1對(duì)腎細(xì)胞癌侵襲增殖的抑制作用,本研究在腎細(xì)胞癌細(xì)胞系中對(duì)SLC31A1的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。由于SLC31A1在腎細(xì)胞癌中呈低表達(dá)且可能的抑制癌細(xì)胞增殖功能,故上調(diào)了SLC31A1在腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的表達(dá)水平,并觀察其侵襲增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC31A1過(guò)表達(dá)的腎癌細(xì)胞相對(duì)于野生型細(xì)胞的克隆形成和劃痕修復(fù)能力出現(xiàn)了被抑制的現(xiàn)象。這從體外實(shí)驗(yàn)層面證實(shí)了SLC31A1具有抑制腎細(xì)胞癌增殖侵襲的功能。

SLC31A1是一種存在于細(xì)胞膜上的高親和力銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,SLC31A1的上調(diào)可以正向調(diào)整銅離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而導(dǎo)致銅死亡的發(fā)生[20]。因此,SLC31A1對(duì)腎細(xì)胞癌的抑制作用的機(jī)制可能與銅死亡的發(fā)生相關(guān),這種抗原性細(xì)胞死亡模式同時(shí)可能也是SLC31A1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)正相關(guān)的主要原因。

綜上,SLC31A1可能具有對(duì)腎細(xì)胞癌侵襲增殖的抑制作用。另一方面,SLC31A1同樣為作為一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)后生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后,有助于腎細(xì)胞癌的臨床決策。