胡志萍，甘 寧，李 嫚，付皓云，胡齊欣

（湖北省腫瘤醫(yī)院，湖北 武漢 430079）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是全球健康的重大威脅之一，雖然目前人類已經(jīng)在肝癌預(yù)防方面取得了巨大的進(jìn)展，但是肝癌的總發(fā)病率和死亡率仍在持續(xù)上升［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮因子生長(zhǎng)受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR） 可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 （mesenchymalepithelial transition factor，MET） 與癌細(xì)胞的惡性表型密切相關(guān)［2］。黃芩具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用［3-4］，黃芩苷是其主要成分之一。有較多研究表明，黃芩苷能通過各種信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡產(chǎn)生影響［5-7］，但其對(duì)MET/EGFR 通路的作用機(jī)制以及其生物學(xué)功能尚不明確。本研究以黃芩苷、MET 抑制劑克唑替尼和EGFR 抑制劑吉非替尼處理人肝癌HepG-2 細(xì)胞，通過檢測(cè)MET/EGFR 信號(hào)通路相關(guān)的通路蛋白表達(dá)探討黃芩苷對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG-2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)B110209）。MET 抑制劑克唑替尼、EGFR 抑制劑吉非替尼（美國(guó)MedChemExpress 公司，批號(hào)HY-50878、HY-50895）。MEM 培養(yǎng)基（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號(hào)TBD32561）； 胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)164210）； 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)BL-O003、SBJ-L0045）； CCK8 試劑、MET、EGFR、β-actin（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)C1706、PAB36425、PAB30672、PAB36265）； AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)FS-79505）； PI/Rnase Staining Buffer Solution （上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)GOY-K14070）； p-MET、p-EGFR （英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab5662、ab40815）。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡（東莞市瑞顯光學(xué)儀器有限公司）； SpectraMax 酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海） 有限公司］；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Agilent 公司）； 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

1.4 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時(shí)間篩選 HepG-2 細(xì)胞以每孔3.0×103個(gè)的密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，分別加入含0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 黃芩苷的培養(yǎng)基［6］，每組3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度，設(shè)置調(diào)零孔（僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 分組與給藥 HepG-2 細(xì)胞以每孔3×103個(gè)的密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組、黃芩苷組（12.5 μg/mL）、克唑替尼組 （1 μmol/L）、黃芩苷＋克唑替尼組 （12.5 μg/mL＋1 μmol/L）、吉非替尼組（1 μmol/L）、黃芩苷＋吉非替尼組（12.5 μg/mL＋1 μmol/L）、克唑替尼＋吉非替尼組（1 μmol/L＋1 μmol/L）、黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組（12.5 μg/mL＋1 μmol/L＋1 μmol/L），棄舊培養(yǎng)基，加入含相應(yīng)劑量藥物的新培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞按“1.5” 項(xiàng)下方法處理，48 h 后每孔加入10 μL CCK8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，設(shè)置調(diào)零孔（僅加培養(yǎng)基和CCK8 溶液），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，每組約1×106個(gè)，4 ℃、400×g離心5 min，重懸于200 μL PBS 中，加入10 μL Annexin V-FITC、10 μL 碘化丙啶（propidium，PI），混勻后4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 上機(jī)檢測(cè)，通過NovoExpress 軟件進(jìn)行分析。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集各組細(xì)胞，每組約1×107個(gè)，4 ℃、400×g離心5 min，重懸于300 μL PBS 中，加入700 μL 無水乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定24 h 以上，4 ℃、700×g離心5 min，100 μL 1 mg/mL RNase A 溶液重懸細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞RNA 30 min，加入400 μL 50 μg/mL PI 溶液，4 ℃避光孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)，通過NovoExpress 軟件進(jìn)行分析。

1.9 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞MET、EGFR 蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，裂解提取蛋白，離心后取上清液，蛋白定量后進(jìn)行變性，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉過夜，加一抗室溫孵育1 h，PBST 洗滌3次，加HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶10 000） 室溫孵育1 h，PBST洗滌3 次，加入ECL 發(fā)光液，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影，通過TANON GIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值，以βactin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷最適質(zhì)量濃度、作用時(shí)間篩選 如表1 所示，除12.5 μg/mL 外，其他質(zhì)量濃度黃芩苷在干預(yù)12、24、48 h 后均對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率無明顯影響 （P＞0.05）； 12.5 μg/mL 黃芩苷干預(yù)12、24、48 h 后，HepG-2細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05），以48 h 最顯著，因此選擇12.5 μg/mL 黃芩苷作用48 h。

表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時(shí)間對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n＝3）

表1 不同質(zhì)量濃度黃芩苷作用不同時(shí)間對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n＝3）

注： 與同一作用時(shí)間其他質(zhì)量濃度比較，*P＜0.05。

黃芩苷/（μg·mL-1）時(shí)間12 h24 h48 h 2.5-0.17±4.42-0.71±1.25-0.39±2.60 5-2.05±4.051.58±1.950.74±2.13 7.51.07±2.22-1.57±1.982.92±2.68 10-0.92±1.50-1.33±0.654.86±1.87 12.56.66±2.48*9.75±1.03*23.26±1.37*

2.2 黃芩苷和MET、EGFR 信號(hào)通路抑制劑對(duì)HepG-2 細(xì)胞凋亡、增殖的影響 與對(duì)照組比較，其余組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例高于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見圖1～2、表2。

圖1 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡情況

圖2 各組HepG-2 細(xì)胞周期變化

表2 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比較（±s，n＝3）

表2 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比較（±s，n＝3）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05；與吉非替尼組比較，△P ＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別凋亡率/%G1 期細(xì)胞比例/%對(duì)照組2.34±1.3036.05±0.52黃芩苷組34.48±0.20*49.74±0.29*克唑替尼組18.16±0.8844.65±1.34黃芩苷＋克唑替尼組43.17±0.64＃53.02±0.60＃吉非替尼組23.03±0.7345.88±0.39黃芩苷＋吉非替尼組47.22±1.08△54.60±0.59△克唑替尼＋吉非替尼組38.06±1.1249.44±0.73黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組 52.51±0.18▲59.86±0.55▲

2.3 黃芩苷和MET、EGFR 信號(hào)通路抑制劑對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率的影響 與對(duì)照組比較，其余組細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細(xì)胞增殖抑制率高于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見表3。

表3 各組HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s，n＝3）

表3 各組HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s，n＝3）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05；與吉非替尼組比較，△P ＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別增殖抑制率/%對(duì)照組0.00±0.93黃芩苷組29.35±0.54*克唑替尼組13.90±1.33黃芩苷＋克唑替尼組37.29±0.41＃吉非替尼組17.22±0.04黃芩苷＋吉非替尼組39.94±0.41△克唑替尼＋吉非替尼組31.87±0.46黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組45.95±0.33▲

2.4 黃芩苷和MET、EGFR 信號(hào)通路抑制劑對(duì)MET/EGFR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，其余組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），黃芩苷＋吉非替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于吉非替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于克唑替尼組（P＜0.05），黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組細(xì)胞p-MET、p-EGFR 蛋白表達(dá)低于克唑替尼＋吉非替尼組（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 通路蛋白條帶

表4 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）

表4 各組HepG-2 細(xì)胞MET/EGFR 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較（±s，n＝3）

注： 與對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與克唑替尼組比較，＃P＜0.05； 與吉非替尼組比較，△P＜0.05； 與克唑替尼＋吉非替尼組比較，▲P＜0.05。

組別METp-METEGFRp-EGFR對(duì)照組1 412.33±38.891 183.67±50.611 424.67±32.02932.67±28.50黃芩苷組1 467.00±23.261 067.00±39.15*1 399.33±35.70770.00±31.80*克唑替尼組1 429.00±41.15836.00±26.511 409.67±39.21690.33±27.10黃芩苷＋克唑替尼組1 426.00±36.04755.33±30.57＃1 400.00±33.60652.33±24.34＃吉非替尼組1 462.67±28.291 046.67±23.031 452.67±38.07555.67±20.40黃芩苷＋吉非替尼組1 382.00±46.00900.67±24.13△1 454.33±28.02467.67±21.13△克唑替尼＋吉非替尼組1 382.00±44.03614.00±16.521 441.00±39.61378.00±21.28黃芩苷＋克唑替尼＋吉非替尼組1 360.33±47.75496.33±25.77▲1 460.67±34.59261.00±22.91▲

3 討論

黃芩是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，主產(chǎn)于河北、山東等地，具有解熱、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用［8-9］。Oh 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，從甘草中提取的甘草查爾酮可以通過抑制EGFR和MET 來抑制肺癌細(xì)胞活性。傳統(tǒng)中藥在治療癌細(xì)胞中的價(jià)值越來越高。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞增殖抑制率升高，與MET、EGFR 信號(hào)通路抑制劑單獨(dú)干預(yù)的效果相似； 黃芩苷與MET、EGFR 信號(hào)通路抑制劑同時(shí)干預(yù)，能夠達(dá)到更好的HepG-2 細(xì)胞增殖抑制效果，與先前大鼠膽汁中黃芩苷的代謝物黃芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的研究相類似［11］。

細(xì)胞凋亡作為程序性細(xì)胞死亡，在正常組織的發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，不正常的凋亡可能表現(xiàn)為癌癥或自身免疫疾病［12-13］。細(xì)胞凋亡減少和細(xì)胞周期縮短都是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期也有一定的關(guān)系，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活會(huì)終止細(xì)胞周期進(jìn)程［14］。目前已有研究指出，黃芩苷能夠通過PI3K/Akt/mTOR 途徑和線粒體功能障礙來抑制人軟骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。黃芩苷與信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期密切相關(guān)［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例升高，與MET、EGFR信號(hào)通路抑制劑單獨(dú)干預(yù)的效果相似，且聯(lián)合干預(yù)也能獲得更好效果。這與黃芩苷可能通過JNK/FoxO1/BIM 信號(hào)通路抑制胰腺癌SW1990 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡的研究［18］及黃芩苷能夠抑制慢性糜爛性胃炎濁毒患者體內(nèi)的Met 信號(hào)來減少炎癥并恢復(fù)細(xì)胞周期的研究相一致［19］。

MET/EGFR 信號(hào)通路與肝臟發(fā)育、增殖和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)［20］。該通路的研究已經(jīng)成為了癌癥治療的一大突破口。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷干預(yù)后HepG-2 細(xì)胞中p-MET 和p-EGFR 蛋白表達(dá)均降低，表明黃芩苷具有抑制MET 和EGFR 信號(hào)通路的效果； 且黃芩苷和MET、EGFR信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合干預(yù)后，MET、EGFR 通路蛋白表達(dá)降低更顯著，提示黃芩苷能單獨(dú)作為MET 和EGFR 信號(hào)通路的蛋白抑制劑，同時(shí)也能夠增強(qiáng)這2 條信號(hào)通路蛋白抑制劑的抑制作用。MET/EGFR 信號(hào)通路可作為多種中藥發(fā)揮藥效的信號(hào)通路，例如白藜蘆醇能夠靶向EGFR 和c-Met 信號(hào)通路來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖［21］。

綜上所述，黃芩苷對(duì)人肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，對(duì)其凋亡和細(xì)胞周期較大影響，并且可能通過抑制MET/EGFR 信號(hào)通路來調(diào)控其細(xì)胞增殖和凋亡，提示黃芩苷有治療肝癌的潛力。