蘇永東，萬(wàn)洪靜，陳沖，霍立文

1.重慶市合川區(qū)公安局刑警支隊(duì)，重慶 401520；

2.麗江市公安司法鑒定中心，云南 麗江 674100

人類遺傳多樣性是人類自50 萬(wàn)年前起源于非洲后，在不同的自然環(huán)境、疾病困難及生活方式改變的影響下不斷富集的遺傳信息的總和[1]。隨著人類基因組計(jì)劃、千人基因組計(jì)劃等全基因組測(cè)序計(jì)劃的完成[2]，遺傳學(xué)家對(duì)不同的遺傳標(biāo)記的遺傳多樣性有了更清楚的認(rèn)識(shí)，常見(jiàn)的遺傳標(biāo)記包括傳統(tǒng)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、短串聯(lián)重復(fù)序列、單核苷酸多態(tài)性、插入缺失遺傳多樣性及迷你單倍型、微單倍型[3-4]。法醫(yī)學(xué)短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STR)序列是一種以2～6 bp 為基本序列的具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，廣泛地存在于基因組的非編碼區(qū)域。作為目前法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別及親緣關(guān)系鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，STR 檢測(cè)具有技術(shù)成熟、檢測(cè)自動(dòng)快捷標(biāo)準(zhǔn)化、各種比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)建立趨于完善等優(yōu)點(diǎn)。

云南省是我國(guó)西南地區(qū)少數(shù)民族聚集比較密集的省份，近年來(lái)法醫(yī)學(xué)相關(guān)的STR遺傳標(biāo)記在少數(shù)民族群體中的遺傳多樣性及其法醫(yī)學(xué)特征先后被報(bào)道(云貴地區(qū)漢族[6]、云南白族[7]、云南壯族[8]、云南傣族[8]、云南哈尼族[8]、云南苗族[9]、云南彝族[10])，但相關(guān)研究在云南漢族群體較為缺乏。本研究擬采用AGCU EX22STR熒光檢測(cè)試劑盒(無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司)對(duì)云南地區(qū)大樣本漢族群體的常用STR遺傳多樣性及群體遺傳價(jià)值進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 1 418 名個(gè)體的血痕收集于云南昆明、麗江等地區(qū)的隨機(jī)個(gè)體，其中男性個(gè)體1 077名，女性個(gè)體341名。所有參與者都需是本地土著居民且在樣本采集之前都簽訂了樣本采集知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了重慶市合川區(qū)公安局物證鑒定所與云南省麗江市公安局司法鑒定中心相關(guān)的倫理審批。

1.2 DNA 提取、擴(kuò)增及電泳 納入研究樣本利用ΒSD600DUET 自動(dòng)打孔機(jī)(澳大利亞ΒSD Robotics公司)，打孔技術(shù)采取1.2 mm 大小的樣本。采用直接擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)。利用AGCU EX22 熒光檢測(cè)試劑盒(無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司)擴(kuò)增21個(gè)常染色體STR 基因座及性別基因座Amelogenin。DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物用3130xl 基因分析儀(美國(guó)AΒ 公司)進(jìn)行分型。等位基因命名采用Genemapper?ID軟件(美國(guó)AΒ 公司)分析。每批次實(shí)驗(yàn)(擴(kuò)增、電泳)都采用水作為陰性對(duì)照，9947A作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Power States V 1.2 軟件包(美國(guó)Promega公司)計(jì)算21個(gè)常染色體STR基因座等位基因頻率及相關(guān)的群體遺傳學(xué)參數(shù)，包括觀察值雜合度(observed heterozygosity，Ho)、個(gè)體識(shí)別率(power of discrimination，PD)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)和非父排除率(probability of exclusion，PE)。利用Arlequin 3.5 軟件[11]計(jì)算期望雜合度(expected heterozygosity，He)、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及連鎖分析。本研究納入地理位置相近的早期研究—21 個(gè)群體[12-22]的遺傳多樣性信息，基于不同檢測(cè)體系的19 個(gè)重疊基因座(D2S1338，D3S1358，D5S818，D6S1043，D7S820，D8S1179，D12S391，D13S317，D16S539，D18S51，D19S433，D21S11，CSF1PO，F(xiàn)GA，TH01，TPOX，vWA，Penta D和Penta E)的遺傳變異信息探索云南漢族群體和相關(guān)納入的參考群體的遺傳關(guān)系。納入群體包括兩個(gè)四川漢族[8，17]、重慶漢族[22]、湖南漢族[6]、湖北漢族[19]、江西漢族[6]、廣西漢族[6]、廣東漢族[18]、閩南漢族[20]、閩西漢族[6]、廈門(mén)漢族[7]、云貴地區(qū)漢族[12]、新疆維吾爾族[9]、云南白族[13]、云南越南群體[21]、云南苗族[14]、云南彝族[15]、云南壯族[16]、云南傣族[16]、云南哈尼族[16]、伊犁錫伯族[10]。利用Phylip3.695軟件計(jì)算群體間的Nei遺傳距離。使用SPSS21.0 軟件[23]進(jìn)行多維尺度分析、MVSP 軟件進(jìn)行主成分分析、Mega7.0 軟件[24]基于鄰近連接法(Neighboring-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結(jié)果

2.1 基因頻率分布 納入研究的1 418名無(wú)關(guān)個(gè)體在21 個(gè)常染色體STR 基因座上共檢測(cè)到277 個(gè)等位基因，其頻率分布為0.000 4 (D16S539)到0.528 6(vWA)。TPOX擁有最少等位基因個(gè)數(shù)7個(gè)，Penta E擁有最多等位基因個(gè)數(shù)28個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 云南地區(qū)漢族人群21 個(gè)STR 基因座等位基因頻率分布情況(n=1 418)Table 1 Frequency distribution of alleles of 21 STR loci in the Han population in Yunnan(n=1 418)

2.2 群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì) 經(jīng)多重檢驗(yàn)Βonferroni矯正，所有檢測(cè)的21 個(gè)位點(diǎn)都符合Hardy-Weinberg 平衡。對(duì)21個(gè)基因座進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡現(xiàn)象。如表2 所示，云南漢族群體中，He 為0.617 0～0.915 1，Ho為0.607 9～0.914 0，PIC為0.555 6～0.908 6，PD 為0.793 9～0.986 1，PE 為0.300 5～0.824 0，研究基因座在云南漢族群體中的累積匹配概率為7.335 4×10-26，累積非父排除率為0.999 999 993，累積個(gè)體識(shí)別能力為0.999 999 999 999 999 999 999 93。

表2 云南地區(qū)漢族群體21個(gè)常染色體STR遺傳標(biāo)記法醫(yī)學(xué)相關(guān)參數(shù)Table 2 Forensic parameters related to 21 autosomal STR genetic markers in Han population in Yunnan

2.3 Nei 遺傳距離及多維尺度分析 東亞地區(qū)群體起源、進(jìn)化、遷移及混雜歷史復(fù)雜，中國(guó)目前擁有56 個(gè)官方認(rèn)可的少數(shù)民族。本研究基于不同試劑盒之間重疊的19個(gè)STR基因座的遺傳多樣性信息，探索了云南漢族群體和21個(gè)周邊相關(guān)群體的遺傳關(guān)系。圖1 顯示，云南漢族與四川漢族(0.001 0 和0.004 9)、云南白族(0.004 7)、云貴地區(qū)漢族群體(0.001 9)有較小的Nei遺傳距離，但同云南苗族有較大的Nei遺傳距離(0.080 9)。圖2顯示，云南漢族群體和其他納入群體比較的漢族群體緊密聚集在一起位于正中央，新疆維吾爾族群體和伊利錫伯族群體位于左上角，越南苗族和云南越南群體位于右上角，云南的其他少數(shù)民族位于正下方。

圖1 云南漢族群體與21個(gè)周邊相關(guān)群體之間的Nei遺傳距離熱圖Figure 1 Heat map of Nei genetic distance between Yunnan Han population and 21 neighboring related populations

圖2 云南漢族群體與21個(gè)參考群體多維尺度分析Figure 2 Multidimensional scale analysis of Han population and 21 reference groups in Yunnan

2.4 主成分分析及系統(tǒng)發(fā)生重建 本研究提取了第一成分(50.153%)和第二成分(16.249%)探索云南漢族和其他21 個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)相似性(圖3)。如主成分分析結(jié)果顯示，第一成分明顯地將云南苗族和云南居住的越南群體與其他20 個(gè)群體區(qū)分開(kāi)。第二成分可以清楚地將新疆的維吾爾族群體和錫伯族群體與其他群體區(qū)分開(kāi)，同時(shí)也能將云南傣族及壯族群體與其他群體區(qū)分開(kāi)。云南漢族與鄰近漢族群體(如重慶漢族、四川漢族、云貴漢族)緊密聚集在一起。從圖4可知，云南苗族和云南越南群體聚成一支，其他20 個(gè)群體聚集在另一支。本研究群體首先同廈門(mén)漢族群體聚在一起，隨后相繼同四川漢族和云貴漢族群體聚集在一起。整體群體分布規(guī)律同上述多維尺度分析、主成分分析結(jié)果一致。

圖3 云南漢族群體與21個(gè)參考群體主成分分析Figure 3 Principal component analysis of Yunnan Han population and 21 reference populations

圖4 云南漢族群體與21個(gè)參考群體系統(tǒng)發(fā)生重建Figure 4 Systematic reconstruction of the Yunan Han population and 21 reference groups

3 討論

東亞地區(qū)人群起源遷移復(fù)雜，近年來(lái)一直是考古學(xué)、語(yǔ)言學(xué)、人類學(xué)及法醫(yī)學(xué)探索的熱點(diǎn)地區(qū)[25-29]，這里有適應(yīng)高原的藏族群體，也有人口數(shù)量超過(guò)13億的全球最大群體—漢族群體。本研究利用AGCU EX22試劑盒在1 418名云南地區(qū)無(wú)關(guān)漢族個(gè)體中共檢測(cè)出21個(gè)STR 基因座、277 個(gè)等位基因。21 個(gè)基因座均具有較高的雜合性和足夠的PD和PE。該復(fù)合擴(kuò)增體系可應(yīng)用于云南漢族人群進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和三聯(lián)體親子鑒定。

在云南漢族群體的21 個(gè)STR 基因座頻率分布同21個(gè)地理位置相近的群體比較中，Nei遺傳距離分布、多維尺度分析、主成分分析及系統(tǒng)發(fā)生重建揭露出云南漢族群體與周圍四川漢族、云貴地區(qū)漢族群體擁有較近的遺傳關(guān)系，與本地少數(shù)民族中的彝族亦擁有較近的遺傳關(guān)系，如同云南白族(0.004 7)。本研究基于常染色體遺傳標(biāo)記基因多樣性揭示了中國(guó)不同地區(qū)的漢族群體和少數(shù)名族群體的遺傳關(guān)系與其他基于性染色體遺傳標(biāo)記多態(tài)性研究的群體遺傳關(guān)系一致[30-33]。整體上中國(guó)不同地區(qū)的漢族群體具有極強(qiáng)的基因相似性，漢族群體同多數(shù)少數(shù)民族還存在極大的遺傳結(jié)構(gòu)差異，如苗族和維吾爾族群體，需要注重相關(guān)群體的群體數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。

本研究觀察了云南漢族群體21 個(gè)常染色體STR遺傳標(biāo)記的遺傳多樣性及群體遺傳關(guān)系，為建立云南地區(qū)漢族群體基礎(chǔ)數(shù)據(jù)提供依據(jù)。法醫(yī)學(xué)特征分析結(jié)構(gòu)顯示，21個(gè)STR基因座在云南地區(qū)表現(xiàn)出很高的多態(tài)信息含量和遺傳多樣性，研究位點(diǎn)適合該地區(qū)漢族群體的個(gè)體識(shí)別及親緣關(guān)系鑒定的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐需求。Nei遺傳距離、多維尺度分析、主成分分析及系統(tǒng)發(fā)生重建的結(jié)果顯示，云南漢族群體與四川漢族、云貴地區(qū)漢族群體有著較近的遺傳關(guān)系，同新疆維吾爾族群體有著相對(duì)較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系。