支敏，江孟曉，童有華，鄭旭東，支慧

1.鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450066；

2.鄭州市人民檢察院，河南 鄭州 450846；

3.皖南醫(yī)學院病理解剖教研室，安徽 蕪湖 241002

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TΒI)是腦組織受外部機械力作用引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1-2]。TΒI的病情評估與傷情鑒定目前主要依賴于明確的臨床癥狀(致死、致殘)和頭部CT 掃描。然而部分輕型TΒI(mild traumatic brain injury，mTΒI)患者CT掃描結(jié)果呈陰性且損傷發(fā)生24 h 內(nèi)無明顯的癥狀[3]，但因二次損傷的持續(xù)進行，多數(shù)患者會出現(xiàn)十分復雜的遲發(fā)性神經(jīng)功能狀態(tài)改變[4-5]，這給mTΒI的病情診斷、評估及司法鑒定工作均帶來困難。因此，尋找方便可靠的診斷、評估指標用于CT 掃描呈陰性的mTΒI 患者，已成為亟待解決的問題。

外泌體是由細胞分泌的細胞外囊泡，不僅在外周血穩(wěn)定存在[6]，且可雙向穿越血腦屏障[7]，參與腦損傷后的修復。相較于常用的蛋白標志物，外周血中神經(jīng)源性的外泌體被認為可有效彌補CT及常用標記物的不足[8]，對頭部CT 掃描為陰性的mTΒI 患者的病情診斷與評估意義重大。研究證實在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中外泌體的物理特性會發(fā)生改變。如Goetzl 等[9]發(fā)現(xiàn)在mTΒI的急性期血漿中神經(jīng)元來源的外泌體生成量可以下降45%。外泌體的粒徑是其重要的物理學特性，Caponnetto 等[10]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對外泌體的攝入與外泌體的粒徑呈負相關(guān)，即小粒徑的外泌體顆粒更易被細胞攝取。但既往研究對mTΒI發(fā)生后外周血外泌體粒徑的變化研究尚少。

mTΒI 發(fā)生后外泌體不僅可以出現(xiàn)物理特性的改變，其攜帶的蛋白、基因等成分亦會發(fā)生改變。研究證實在mTΒI損傷發(fā)生后外泌體攜帶的微小核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)的表達水平有明顯變化[11]。miR-21-5p 在腦微血管內(nèi)皮細胞(ΒMVECs)中表達，是血腦屏障(ΒΒΒ)的主要細胞成分[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)TΒI發(fā)生后大腦皮質(zhì)中的miR-21-5p表達量顯著升高[14]，研究人員認為TΒI 后升高的miR-21-5p 可刺激p-tau 的生成，促進神經(jīng)元發(fā)生凋亡，進而導致神經(jīng)功能狀態(tài)的進一步改變[15]。然而，mTΒI發(fā)生后外泌體內(nèi)的miR-21-5p 表達水平的持續(xù)性變化少見報到。本研究采用Feency 法制作mTΒI 小鼠模型，通過納米顆粒跟蹤技術(shù)NTA(Nanosight Tracking Analysis)檢測、real-time PCR等方法分析mTΒI 后血清外泌體的物理性質(zhì)及不同時間點外泌體miR-21-5p 的表達，探索其對mTΒI后腦損傷的診斷及評估的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8 周齡雄性C57小鼠12 只，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃。相對濕度(44±5)%，試驗期間自由攝食飲水。各種手術(shù)器械購買自廣州市瀚程實驗器材有限公司；水合氯醛購自上海譜振生物科技有限公司。Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，血清外泌體提取試劑盒購自廣州吉賽生物科技股份有限公司，CD63抗體購自Abcam。

1.2 mTΒI 模型構(gòu)建 將小鼠按隨機數(shù)表法分為mTΒI 組與Sham 組，每組6 只。各組小鼠以10%水合氯醛麻醉(3.0 mL/kg)，將小鼠放置在立體定位設備中，沿中線頭皮切口后，在右頂骨中央開放約為3.0 mm的骨窗，放置墊片后對mTΒI 組小鼠以20 g 法碼自35 cm 沿長管進行自由落體撞擊造模，撞擊后縫合頭皮[16]。Sham組小鼠打開骨窗后僅縫合，不進行自由落體打擊。

1.3 神經(jīng)損傷評估 采用神經(jīng)損傷評分(mNSS)對mTΒI 造模后第1 天、第7 天、第14 天、第28 天各組小鼠的行為進行評估。

1.4 外泌體提取 于造模后1天、第7天、第14天、第28天分別摘眼6只mTΒI組和Sham組小鼠眼球，取血1 mL，室溫下3 000×g 離心5 min 后收集血清樣本后，再以2 000×g離心10 min以去除殘留細胞及碎片，收集上清。根據(jù)外泌體提取試劑說明書，在上清中加入試劑A，13 000×g 離心10 min，棄去上清，在沉淀物中加入試劑Β，再次離心收集外泌體。將提取的外泌體以200μL磷酸鹽緩沖液(PΒS)重懸。

1.5 外泌體檢測 納米顆粒跟蹤分析儀Zeta View設定測試參數(shù)，沖洗檢測樣品池后，以100 nm 納米微球調(diào)試儀器后，將用PΒS稀釋10倍后的外泌體標本用1 mL無菌注射器勻速推入樣品室，檢測外泌體的粒徑和濃度。

1.6 外泌體鑒定 提取的外泌體RIPA裂解后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后按1∶1 000 比例加入CD63抗體，4℃孵育過夜，沖洗后，按1∶5 000比例稀釋HPR 標記二抗，室溫下孵育1 h，洗膜后用ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，顯影。實驗均重復3次。

1.7 miR-21-5p 表達水平檢測 Trizol 提取各組外泌體總RNA，real-time-PCR 檢測miR-21-5p。miR-21-5p 正向引物：5'-GAGATGCAGGGACACACGAT-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGATGTGCAATGCG-3'反應條件為：90℃30 s、90℃10 s、55℃30 s，進行40 個循環(huán)。miRNA 表達水平以管家基因U6 為內(nèi)參，RT-PCR 的結(jié)果用2-△△CT法分析，每個樣品進行3次重復。

1.8 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用OringinPro 8.0統(tǒng)計軟件分析及繪圖，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mTΒI 小鼠神經(jīng)行為學變化 相較于Sham組，mTΒI 組小鼠在損傷后的第1 天、第7 天、第14 天、第28天，mNSS 評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1A，說明造模成功。同時，mTΒI 組小鼠損傷后的mNSS 分數(shù)呈遞減趨勢，即神經(jīng)行為學的變化出現(xiàn)時間依賴性減弱，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但其mNSS評分依然高于Sham組(圖1Β)。

圖1 mTBI損傷對小鼠行為的影響Figure 1 Effect of mTBI on the behavior of mice

2.2 mTΒI 發(fā)生后小鼠血清外泌體的鑒定結(jié)果 透射電鏡結(jié)果表明提取的囊泡為外泌體(圖2A)，納米顆粒跟蹤儀檢測結(jié)果顯示，提取的血清外泌體分散度較好(圖2Β)，外泌體標志蛋白CD63 高表達(圖2C)。

圖2 血清外泌體鑒定Figure 2 Detection of plasma exosome

2.3 外泌體的物理特性 Sham組小鼠外周血外泌體粒徑分布峰值為(114.6±6.01)nm，明顯低于mTΒI組小鼠腦損傷1 d后的(131.1±2.27)nm，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3A。同時，mTΒI組小鼠腦損傷1 d后血清外泌體濃度為(0.84±0.24)×107particals/mL，明顯低于同時期Sham組的(10.83±0.7)×107particals/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3Β。

圖3 血清外泌體檢測Figure 3 Analysis of exosome

2.4 小鼠血清外泌體發(fā)展趨勢 比較術(shù)后不同時間組的mTΒI小鼠外周血外泌體，發(fā)現(xiàn)隨著損傷時間的持續(xù)，mTΒI組小鼠血清外泌體的生成量雖然依然低于sham 組小鼠，但是呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(圖4A)；然而外泌體的粒徑卻沒有減小的趨勢，依然顯著大于Sham組小鼠，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4Β。

圖4 小鼠血清外泌體發(fā)展趨勢分析Figure 4 Analysis of developmental trends of plasma exosome

2.5 外泌體miR-21-5p的表達 定量PCR檢測結(jié)果表明，與sham組小鼠相比，mTΒI組小鼠在損傷1 d后miR-21-5p在外周血外泌體內(nèi)的表達量即明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖5A，提示創(chuàng)傷引發(fā)的腦損傷可導致外泌體內(nèi)miR-21-5p的表達水平升高。比較mTΒI組不同時間點小鼠的外泌體miR-21-5p 表達水平，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21-5p的表達量在mTΒI損傷后第7天達到高峰，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。伴隨著損傷時間的繼續(xù)，外泌體miR-21-5p表達有輕度下降，但依然高于Sham 組小鼠外泌體中的miR-21-5p 的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖5Β。

圖5 血清外泌體miR-21-5p表達Figure 5 Expression level of miR-21-5 in the serum exosome

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成細胞(如神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、腦血管內(nèi)皮細胞)釋放的外泌體被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控mTΒI 二次損傷的發(fā)生發(fā)展，受到廣泛關(guān)注[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)mTΒI患者腦脊液中的外泌體不僅在量、粒徑、表面結(jié)構(gòu)方面出現(xiàn)變化，其攜帶的蛋白、mRNA等的表達水平也出現(xiàn)顯著改變[18]，這些改變被證實與mTΒI損傷發(fā)生后出現(xiàn)的認識功能障礙有關(guān)[19]。然而受到患者對于腦脊液抽取的配合度及腦脊液抽取量的限制，腦脊液外泌體檢測在臨床的應用推廣有一定的困難。新近研究結(jié)果表明外周血外泌體攜帶的生物標志物同樣可顯示創(chuàng)傷性腦損傷的嚴重程度，有望成為反映腦損傷的有效指標[20-22]。但是在mTΒI 的發(fā)生發(fā)展過程中，患者外周血外泌體是否與腦脊液外泌體一樣出現(xiàn)量、粒徑等物理學特性的變化，目前研究尚少。本研究借助mTΒI 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)mTΒI 損傷發(fā)生24 h后小鼠外周血外泌體的生成量明顯下降，粒徑顯著增大；在mTΒI 持續(xù)期間，mTΒI 小鼠外周血外泌體生成量自第14 天開始有所增加，而外周血外泌體的粒徑至mTΒI 損傷發(fā)生第28 天依然未出現(xiàn)明顯減小。

納米顆粒的大小被證實可影響細胞對顆粒物的攝取效率及內(nèi)化機制[23]，即細胞對小粒徑粒子的攝取率遠高于大粒徑粒子。Caponnetto等[10]發(fā)現(xiàn)小粒徑的外泌體更易被膠質(zhì)瘤細胞攝取，且攝取了小粒徑外泌體的膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力明顯高于攝取大粒徑外泌體的膠質(zhì)瘤細胞。這一研究結(jié)果表明，大粒徑的外泌體在調(diào)控細胞功能方便要弱于小粒徑外泌體。Jiang等[25]的研究結(jié)果進一步證實小粒徑的外泌體顆?？梢杂行⑴c腦部疾病發(fā)生后的神經(jīng)修復，改善認知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)mTΒI損傷可導致大粒徑外泌體的持續(xù)性出現(xiàn)。這些大粒徑的外泌體可通過影響神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等細胞對其的攝取，影響mTΒI后的神經(jīng)修復，進而促進mTΒI 二次損傷的發(fā)生發(fā)展?？梢姍z測外周血外泌體的粒徑對于評估CT掃描為陰性且損傷24 h內(nèi)無明顯神經(jīng)系統(tǒng)體征的mTΒI患者的神經(jīng)功能損傷具有一定的價值。

miRNAs 是一類非編碼小片段核糖核酸，通過結(jié)合非編碼區(qū)mRNA，調(diào)節(jié)基因的表達及蛋白合成，參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、創(chuàng)傷修復、腫瘤發(fā)生等病理生理進程[26]。被裝入外泌體的miRNA 可借助外泌體轉(zhuǎn)移至目標細胞，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)活動，如調(diào)節(jié)神經(jīng)元的調(diào)亡、影響海馬突觸可塑性。miR-21-5p 被認為在神經(jīng)退型性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)腦損傷發(fā)生后，miR-21-5p 不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，神經(jīng)元細胞內(nèi)表達有明顯的升高[28]，在神經(jīng)元生成的外泌體中亦有高水平的表達[29]。Ge 等[30]認為神經(jīng)元細胞可以通過外泌體將miR-21-5p 轉(zhuǎn)入小神經(jīng)膠質(zhì)細胞，而高表達的miR-21-5p 可促進小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的極化，增強神經(jīng)炎性反應、抑制神經(jīng)軸突的生長、促進神經(jīng)元的調(diào)亡，最終加劇了TΒI 的二次損傷。但是miR-21-5p在mTΒI 患者外周血外泌體中的表達變化尚未見報道。本研究結(jié)果表明，mTΒI 組小鼠外周血外泌體中的miR-21-5p表達水平明顯增高。深入分析發(fā)現(xiàn)mTΒI損傷發(fā)生后miR-21-5p 的表達持續(xù)性增高，在損傷的第7天達到峰值，在隨后的第14天和第28天雖然出現(xiàn)下降，但表達水平依然穩(wěn)定高于sham組。該結(jié)果提示：高度警惕患者外周血外泌體miR-21-5p 的表達水平，對頭部CT掃描陰性的mTΒI患者的損傷評估及司法鑒定有重要意義。

綜上所述，本研究通過對mTΒI 小鼠外周血外泌體的粒徑與生成量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)mTΒI 損傷后小鼠外周血外泌體濃度明顯降低，但粒徑卻明顯增大。伴隨mTΒI損傷的持續(xù)，mTΒI小鼠外周血外泌體的濃度出現(xiàn)輕度增加，但外泌體粒徑無明顯改變，始終保持在大粒徑的狀態(tài)。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，mTΒI損傷發(fā)生后，mTΒI小鼠外周血外泌體內(nèi)的miR-12-5p的表達量顯著提高，且可以持續(xù)至損傷發(fā)生28天。以上結(jié)果提示外周血外泌體濃度、粒徑及外泌體miR-21-5p 表達水平對頭部CT 為陰性的mTΒI 患者的臨床風險評估及司法鑒定具有較高價值，可被視為新的輔助檢查指標。