何燕芳，馬燕花，謝嬌嬌，梁建華

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；

2.平?jīng)鍪兄嗅t(yī)醫(yī)院，甘肅 平?jīng)?744000

胃癌(gastric cancer，GC)是惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，仍然是全球一個相當大的健康問題[1]。中國是胃癌的高發(fā)區(qū)。國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：2016 年我國胃癌新發(fā)及死亡病例數(shù)為39.7 萬及28.9萬，占全部惡性腫瘤的新發(fā)及死亡病例數(shù)的9.7%及12%，發(fā)病及死亡均居第3 位[2-3]。胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)約占所有GC病例的95%[4]，盡管近幾十年來臨床在STAD的診斷技術(shù)和治療方法上取得了巨大進步，但STAD 患者的預(yù)后仍然很差。大多數(shù)胃癌患者在確診時存在局部或遠處轉(zhuǎn)移，已無手術(shù)治愈的機會，只能通過姑息性化學(xué)治療和/或靶向藥物治療延長生存期，但該類療法的獲益較為有限，患者的中位生存期僅約1年[5]。由幽門螺桿菌感染引起的慢性炎癥與GC 相關(guān)[6]，GC 發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[7-8]，腫瘤免疫微環(huán)境不僅被認為是炎癥相關(guān)癌癥模型，而且在腫瘤進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，特別是腫瘤相關(guān)巨噬細胞[9]，越來越多的證據(jù)表明，巨噬細胞浸潤率高與STAD 的不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。

隨著高通量分子技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的免疫治療檢查點被發(fā)現(xiàn)，免疫治療方式是胃癌的新興研究方案。因此，基于預(yù)后生物標志物的探索，迫切需要一個預(yù)測患者的生存和個體化治療的標志物[11]。Stonins是一個進化保守的家族，介導(dǎo)神經(jīng)肌肉連接處小泡的恢復(fù)和循環(huán)，由Stonin1 (STON1)和Stonin2(STON2)[12]組成，人類STON1 蛋白由735 個氨基酸組成，預(yù)測分子質(zhì)量為83 kDa[13]，此外，STON1基因甲基化水平被證實是肥胖癥進展和個性化治療發(fā)展的一個預(yù)后標志[14]，STON1 在調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2 (NG2)的內(nèi)吞作用方面具有不可替代的作用，NG2 可能是膠質(zhì)母細胞瘤和黑色素瘤的癌基因[15]，但STON1在癌癥中介導(dǎo)特定分子機制的潛在功能仍然完全不清楚。

因此，本研究從UCSC XENA[16]下載TCGA 和GTEx 基因表達矩陣，對其預(yù)后價值進行評價，探討STON1 與其免疫應(yīng)答的關(guān)系，擬為STAD患者的個體化治療和預(yù)后評估帶來新切入點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和整理 從UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)經(jīng)Toil 流程[17]統(tǒng)一處理的TCGA 和GTEx 的TPM 格式的RNAseq 數(shù)據(jù)，并從中提取TCGA 的STAD 和GTEx 中對應(yīng)的正常組織及泛癌數(shù)據(jù)，最后將TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化以備后續(xù)進行分析。

1.2 差異表達基因(DEGs)分析 利用R(3.6.3版本)中R包ggplot2(3.3.3版本)進行STON1差異表達基因，繪制滿足|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05 的DEGs 火山圖；運用R包DESeq2[18](1.26.0版本)分析得出STON1高、低表達組的DEGs，為基因富集分析準備數(shù)據(jù)。

1.3 功能富集分析 包含基因本體(GO)[即生物過程(ΒP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)]和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析；通過org.Hs.eg.db 包(3.10.0 版本)用于ID 轉(zhuǎn)換；clusterProfiler 包[19](3.14.3版本)用于富集分析，將DEGs 的閾值定義為|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05得到富集結(jié)果。

1.4 基因集富集分析 用一個預(yù)先定義的基因集MSigDΒ 數(shù)據(jù)庫(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中的基因來探索STON1 高、低表達組DEGs 的功能和表型，將每次分析計算次數(shù)設(shè)置為1 000次，滿足FDR(qvalue)＜0.25且p.adjust＜0.05的數(shù)據(jù)集認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義[20]。

1.5 免疫浸潤和免疫檢查點分析 納入24種免疫細胞[21]通過GSVA包[22](1.34.0版本)對單樣本基因集富集分析(ssGSEA)進行免疫浸潤分析；進一步分析STON1與免疫檢查點之間的相關(guān)性，包括CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1、LAG3、CD274)[23-25]。

1.6 預(yù)測模型開發(fā) 單因素和多因素的Cox 回歸分析評估STON1能否作為一個獨立的預(yù)后因素，主要的臨床參數(shù)包括TNM 分期、年齡、主要治療結(jié)果以及病理分期，同時繪制1 年、3 年、5 年預(yù)測OS 的列線圖以及校準圖，通過觀察校準圖，以對角線作為最佳預(yù)測值，判斷模型對實際結(jié)果預(yù)測效果評估，使用一致性指數(shù)(C 指數(shù))評估列線圖的準確性；此過程主要通過rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)完成數(shù)據(jù)分析[26]。通過Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)識別生存生物標志物[27]的在線網(wǎng)站和基因表達譜交互分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancerpku.cn/#survival)[28]，分析STAD 患者中STON1表達的預(yù)后價值。

1.7 免疫組織化學(xué)驗證 利用HPA 數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas) (https://www.proteinatlas.org/)對胃的正常組織與腫瘤組織之間的STON1 蛋白質(zhì)表達水平進行免疫組織化學(xué)驗證，比較正常組織和胃癌組織中STON1基因蛋白質(zhì)的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計方法和圖表都使用R 編程語言(版本3.6.3)進行。分類資料滿足理論頻數(shù)＞5且總樣本量＞40的條件，選用χ2檢驗，不滿足理論頻數(shù)＞5或總樣本量＞40的條件，選用Fisher精確檢驗；數(shù)值變量滿足正態(tài)分布，選用t檢驗，不滿足正態(tài)分布，選用曼-惠特尼U檢驗(Mann-WhitneyUtest)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STON1 在STAD 和泛癌中的表達 利用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫確定STON1 在不同TCGA 腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平。共研究了61 種人類癌癥類型，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，STON1 mRNA 在STAD 表達量降低(圖1A)，在大多數(shù)癌癥，包括腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)和腎嫌色細胞癌(KICH)等癌癥中STON1 mRNA水平下降，而膽管癌(CHOL)、多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GΒM)和頭頸部鱗狀細胞癌(HNSN)STON1 mRNA水平上調(diào)(圖1Β)。

圖1 正常組織和STAD中STON1的表達Figure 1 STON1 expression in normal tissues and STAD

2.2 STON1 DEGs 分析 在STON1 的高、低表達組中共鑒定出2 519 個DEGs 滿足|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05，高表達的基因數(shù)目2 152 個，低表達的基因數(shù)目367個(圖2)。

2.3 STON1 功能富集分析 GO 和KEGG 富集分析的結(jié)果如下，在滿足p.adjust＜0.1&qvalue＜0.2 條件下，ΒP共有1 096條，CC共有153條，MF共有125條，KEGG共有53 條，其中ΒP主要包括細胞外基質(zhì)組織、細胞外結(jié)構(gòu)組織和肌肉收縮等，CC 包括含膠原蛋白的細胞外基質(zhì)、纖維部分收縮和收縮纖維等，MF包括細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合和肝素結(jié)合等；KEGG包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化吸收和鈣信號通路等(圖3和表1)。

表1 GO及KEGG通路分析結(jié)果Table 1 Results of GO and KEGG pathway analysis

圖3 GO和KEGG富集分析圈圖Figure 3 Circle diagram of GO and KEGG enrichment analysis

2.4 STON1 基因集富集分析 使用預(yù)先定義的基因集MSigDΒ 數(shù)據(jù)庫進行GSEA 分析，進一步鑒定STON1高低表達水平在STON1中所涉及的生物學(xué)功能，在滿足FDR(qvalue)＜0.25且p.adjust＜0.05情況下，STON1高表達的DEGs顯著富集于GO功能中的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)信號通路、淋巴細胞活化的調(diào)節(jié)、T 細胞激活、體液免疫應(yīng)答以及吞噬作用等(圖4A)；低表達組顯著富集于核糖體、線粒體基因表達、呼吸小體、氧化還原酶復(fù)合物和病毒基因表達等(圖4Β)；癌癥途徑以及WNT、MAPK 信號通路等KEGG 通路在高表達STON1的DEGs中顯著富集(圖4C)；核糖體、氧化磷?；?、DNA復(fù)制、RNA降解和嘧啶代謝等KEGG通路在低表達STON1 的DEGs中顯著富集(圖4D)；在標志性基因集中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、炎癥反映、細胞凋亡、KRAS信號傳導(dǎo)和TGF-β信號傳導(dǎo)顯著富集于STON1 的高表達組中(圖4E)；MYC、E2F 靶標、氧化磷?；2M檢查點以及DNA修復(fù)顯著富集于STON1低表達組中(圖4F)。這些結(jié)果提示STON1 在STAD 患者腫瘤微環(huán)境和免疫應(yīng)答中的潛在作用。

圖4 GSEA 的基因富集分析Figure 4 Gene enrichment analysis of GSEA

2.5 STON1 免疫浸潤和免疫檢查點分析 腫瘤免疫浸潤在預(yù)測OS發(fā)生率中起重要作用。觀察24個免疫細胞中STON1表達組之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)T細胞和細胞毒性T細胞(cytotoxic cell)均P＜0.05，Β細胞、CD8+T細胞、漿細胞樣DC(pDC)、嗜酸性粒細胞、未成熟樹突狀細胞(iDC)、巨噬細胞(macrophages)、肥大細胞(mast cell)、自然殺傷細胞(NK cell)、樹突狀細胞(DC)、中央型記憶T 細胞(Tcm)、效應(yīng)記憶T 細胞(Tem)、濾泡輔助性T 細胞(TFH)、Tgd 以及Th1 均在STON1 中高表達(P＜0.001)；Th17 細胞和Th2 均在STON1 中低表達(P＜0.001)，而中性粒細胞(neutrophlis)、調(diào)節(jié)性T 細胞(Treg)、aDC、NK CD56bright 細胞、NK CD56dim 細胞和輔助性T 細胞(T helper)與STON1 無相關(guān)性(圖5A)。進一步評估24 種免疫細胞與STON1 的相關(guān)性，結(jié)果表明STON1 與Th17 細胞(r=-0.113，P=0.029＜0.05)和Th2 細胞(r=-0.116，P=0.025＜0.05)呈負相關(guān)；中性粒細胞、Treg、aDC、NK CD56dimp細胞和T helper 細胞與STON1 無相關(guān)性，其余免疫細胞與STON1 呈正相關(guān)(圖5Β、5C)。此外，分析了STON1 表達與免疫檢查點之間的關(guān)聯(lián)，其中CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R 的P＜0.001，CTLA-4 的P＜0.01，PDCD1 的P＜0.05，說明STON1高表達組的CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1 的表達水平均高于低STON1 表達組(圖6A)，同時進行了8 個免疫檢查點之間相關(guān)性檢測，發(fā)現(xiàn)CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1 的P＜0.01、r＞0，LAG3、CD274 的P＞0.05，說明CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1與STON1 的表達呈正相關(guān)，而LAG3、CD274 與STON1 的表達無相關(guān)性(圖6Β)。

圖6 STON1表達與免疫檢查點的關(guān)系Figure 6 Relationship between STON1 expression and immune checkpoints

2.6 STON1 的表達與臨床特征的關(guān)聯(lián)性 單因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)TNM 分期、療效、年齡、殘余腫瘤、STON1 的表達水平以及病理分級與OS 相關(guān)(P＜0.05)，見表2；進一步行多因素Cox回歸分析并繪制森林圖，結(jié)果提示STON1 是一個獨立的預(yù)后因素(HR=2.063，95%CI=1.306～3.260，P=0.002)，見圖7。

表2 STAD中STON1表達與臨床基線數(shù)據(jù)的關(guān)系Table 2 Relationship between STON1 expression in STAD and clinical baseline data

圖7 多因素Cox回歸的森林圖Figure 7 Forest plot of multivariate Cox regression

2.7 構(gòu)建預(yù)測模型 將STON1 及臨床特征納入列線圖模型(圖8A)，分別預(yù)測1 年、3年、5年的生存概率，同時繪制校準圖(圖8Β)，C 指數(shù)為0.711(95%CI=0.687～0.735)；為了進一步分析STON1的預(yù)后價值，使用GEPIA2 和Kaplan-Meier plotter 腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)庫進行生存分析，結(jié)果表明在STAD 中，STON1 的表達水平與OS密切相關(guān)，STON1 高表達的患者比STON1 低表達的患者預(yù)后更差(P＜0.05)，見圖9A、9Β。

圖8 STAD中STON1基因的預(yù)后預(yù)測模型及校準圖Figure 8 Prognostic prediction model and calibration plot of STON1 gene in STAD

圖9 總生存率的Kaplan-Meier曲線Figure 9 Kaplan-Meier curves for overall survival

2.8 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 胃中STON1 表達水平在腫瘤組織高于正常組織，在正常組織中未檢測到(圖10)，進一步說明STON1 的高表達是胃癌預(yù)后不良的因素。

圖10 正常胃組織與胃癌組織中STON1的蛋白質(zhì)表達水平Figure 10 Protein expression level of STON1 in normal gastric tissues and gastric cancer tissues

3 討論

近年來，隨著免疫治療在肺癌、腎癌等多個實體瘤中取得了較好的治療效果[29-30]，也給胃癌患者的治療帶來了新的希望[31-32]?；贏TTRACTION-02 研究，納武利尤單抗(Nivolumab)已在日本、韓國等獲批胃癌三線治療適應(yīng)證[33]，而CHECKMATE-649研究也將胃癌化療聯(lián)合免疫治療正式進入一線治療行列[34]，在全球范圍內(nèi)，胃癌的新輔助免疫治療的臨床試驗(如KEYNOTE-585)正在進行[35]。基于腫瘤微環(huán)境目標的臨床個體化治療的快速進展給STAD 患者帶來了希望[36]，因此，進一步識別新的免疫治療藥物和生物標志物來指導(dǎo)臨床治療和預(yù)測STAD患者的生存仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究發(fā)現(xiàn)STON1 在包括STAD 在內(nèi)的大多數(shù)人類癌癥類型中均降低，并且與STAD 的分級、分期和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，STON1 過表達預(yù)示著預(yù)后不良并與免疫應(yīng)答相關(guān)。

根據(jù)富集分析的結(jié)果，本文探討了ssGSEA 的免疫浸潤水平，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)免疫細胞與STON1 mRNA表達呈正相關(guān)，包括調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、1型T輔助細胞(Th1)、濾泡輔助性T 細胞(TFH)和Tgd。產(chǎn)生干擾素-γ的Th1 細胞分泌TNF，導(dǎo)致腫瘤破壞，Th1 和Th2細胞不僅可以招募腫瘤部位附近的NK細胞和巨噬細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，還可以作為增強子促進腫瘤特異細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)反應(yīng)[37]。這些免疫細胞高表達STON1 在STAD中高度浸潤，在免疫細胞中，NK細胞與STON1表達的相關(guān)度最高(r=0.687，P＜0.001)，浸潤程度與預(yù)后有關(guān)。NK細胞是細胞毒性淋巴細胞，通過激活或抑制表面受體來調(diào)節(jié)腫瘤活性，能強化免疫治療的抗腫瘤效果，同時降低治療毒性反應(yīng)[38-39]。肥大細胞與STON1 表達呈正相關(guān)(r=0.556，P＜0.001)，目前已知多種實體瘤，例如甲狀腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和默克爾細胞癌，它們較差的預(yù)后及瘤組織血管密度與瘤組織中的肥大細胞數(shù)量密切相關(guān)，肥大細胞也是造成多種血液腫瘤，例如不同種類的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和漿細胞瘤較差預(yù)后的主要因素之一[40]。此外，本研究揭示了在STAD中STON1表達與免疫檢查點CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明STON1 可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境中的大部分免疫細胞來間接促進STAD的進展。

本文進一步分析了STON1在STAD患者預(yù)后中的作用。Cox 回歸分析顯示，除了常見的危險因素包括TNM 分期、病理分期、年齡、主要治療結(jié)果外，STON1也是STAD患者的獨立預(yù)后指標，并建立了基于STON1表達水平的列線圖預(yù)測模型，對STON1 的1 年、3 年、5年OS分別進行預(yù)測，CI指數(shù)為0.711(95%CI=0.687～0.735)，校準圖的預(yù)測概率與觀測結(jié)果基本一致，說明模型有較好的預(yù)測性。該模型可以為STAD患者的預(yù)后預(yù)測和個體化評估提供一個新的切入點。此外，為了進一步分析STON1 的預(yù)后價值，本研究使用2個腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)庫進行了生存分析，結(jié)果表明在STAD 中STON1 高表達的生存率更差。為了驗證STON1在胃癌中的表達情況，本研究借助HPA 數(shù)據(jù)庫對胃癌組織進行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示胃癌組織中STON1蛋白質(zhì)表達水平高于正常胃組織，進一步說明了STON1的高表達是胃癌患者預(yù)后不良的因素。

總的來說，本研究結(jié)果表明，STAD 中STON1 的高表達可能與腫瘤進展和較差的生存結(jié)果相關(guān)，且STON1 可能作為一種刺激因子來誘導(dǎo)腫瘤免疫系統(tǒng)的激活。該研究為了解STON1 在腫瘤微環(huán)境中的功能提供了新的見解。其次，本研究從STON1相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子的風(fēng)險評分和臨床參數(shù)中得出的綜合列線圖可用于預(yù)測STAD患者的生存。但本研究的局限性是缺少生存數(shù)據(jù)，缺乏外部驗證，接下來預(yù)備進行細胞學(xué)功能研究來進一步驗證STON1 在STAD 中的具體作用和分子機制。