秦紅剛,韓 興,秦 偉,李晶梅,熊 亮,余繼欽,謝紅玲,漆世華,李凌峰,石寶蘭

(國藥集團動物保健股份有限公司,武漢 430075)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬,根據特異性抗原的不同,分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個群,其中Ⅰ群主要分為5個種(A～E),包含12個血清型[1]。近年來,Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FAdV-4)持續(xù)流行,給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重經濟損失[2]。FAdV-4感染主要引起發(fā)病雞的心包積液、包涵體肝炎等癥狀[1-2],疫苗免疫可有效防控FAdV-4感染[3]。制備疫苗用到的FAdV-4抗原,可通過雞胚、原代雞胚肝細胞或雞肝癌細胞系(LMH)培養(yǎng)FAdV-4獲得[1],有研究顯示FAdV-4在LMH細胞上增殖效果較好[4-5]。LMH細胞是1981年由T Kawaguchi等,利用患肝細胞癌的白萊航雞肝細胞經二乙基亞硝胺致突變培育而成[6]。LMH為貼壁依賴性細胞,大規(guī)模培養(yǎng)常采用轉瓶、細胞工廠或者微載體懸浮培養(yǎng),限制了生產規(guī)?？焖俜糯?。將貼壁生長的ST[7]、BHK-21[8]等細胞馴化為可以全懸浮培養(yǎng)的細胞用于疫苗生產能顯著提高生產效率。本研究成功將LMH細胞馴化為全懸浮培養(yǎng)的細胞,并研究了培養(yǎng)FAdV-4的工藝參數,為FAdV-4疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產提供依據。

1 材料和方法

1.1 細胞、病毒和培養(yǎng)基 LMH細胞、FAdV-4 CPHB03株、FAdV-4瓊擴抗原為國藥集團動物保健股份有限公司保存;DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產品;103B培養(yǎng)基為深圳壹生科生物科技公司產品;新生牛血清(NBS)為內蒙古金源康公司產品。

1.2 主要儀器和耗材 搖瓶為康寧公司產品;搖床CO-06型為美國精騏公司產品;3L、10L、100L生物反應器為廣州齊志生物工程設備有限公司產品。

1.3 LMH細胞全懸浮培養(yǎng)的馴化 將貼壁生長的LMH細胞從DMEM培養(yǎng)基逐步更換至103B培養(yǎng)基,同時降低牛血清的比例,讓其適應103B培養(yǎng)。

1.3.1 培養(yǎng)液的配制 按表1配制培養(yǎng)液。

表1 培養(yǎng)液配制表Tab 1 Preparation of culture medium

1.3.2 細胞馴化 取T75方瓶貼壁培養(yǎng)的LMH細胞,胰酶消化分散后接種于搖瓶并加入培養(yǎng)液2,使細胞密度為1.5×106/mL,置于37 ℃,5% CO2130 r/min搖床培養(yǎng)2日,取樣觀察細胞形態(tài)和計數細胞密度;1000 r/min,離心5 min,棄上清,加入培養(yǎng)液2重懸細胞,使細胞密度為1.5×106/mL,繼續(xù)培養(yǎng)數代,待細胞生長穩(wěn)定后,采用相同的方法適應培養(yǎng)液3～培養(yǎng)液7。待細胞完全適應懸浮培養(yǎng)后,擴大培養(yǎng)并凍存細胞,將其命名為LMH-S。將LMH-S細胞連續(xù)傳代25代,觀察細胞狀態(tài)、計數細胞密度和細胞活率,確定細胞傳代穩(wěn)定性。

1.4 LMH-S細胞接種密度的確定及生物反應器培養(yǎng) 將LMH-S細胞分別以0.2×106/mL、0.5×106/mL和1.0×106/mL的初始密度接種于搖瓶,進行懸浮培養(yǎng)。取樣計數細胞密度和活性,確定細胞的最佳接種密度。按確定的細胞最佳初始密度接種3個3 L生物反應器,分別設置攪拌轉速為50 r/min、75 r/min、100 r/min,其他培養(yǎng)參數均為:37 ℃、pH7.0和DO 50%,每天取樣計數細胞密度和活性,確定生物反應器懸浮培養(yǎng)LMH-S細胞的可行性和最適攪拌轉速。

1.5 LMH-S細胞懸浮培養(yǎng)FAdV-4

1.5.1 接毒時最佳細胞密度、接毒量和收獲時間將對數生長中后期的LMH-S細胞分別稀釋成2.0×106/mL、3.0×106/mL和4.0×106/mL,每種密度的細胞分別接種3個125 mL搖瓶,20 mL/瓶,然后每個密度的細胞分別按0.01 MOI、0.1 MOI、1 MOI接種FAdV-4。將細胞置于37 ℃,5% CO2130 r/min搖床培養(yǎng),每12 h取樣一次,測定樣品的病毒含量。根據病毒含量確定接毒時細胞最佳密度、接毒量和培養(yǎng)時間。

1.5.2 生物反應器懸浮培養(yǎng)FAdV-4 用 100L生物反應器及1.5.1項確定的工藝參數培養(yǎng)FAdV-4。將搖瓶培養(yǎng)的LMH-S細胞接種到10L生物反應器,待細胞密度達到4.5×106/mL時,接種到100L生物反應器,接種FAdV-4病毒,適時收獲細胞培養(yǎng)物,測定病毒含量。

1.6 懸浮培養(yǎng)的FAdV-4免疫原性研究 將懸浮培養(yǎng)的FAdV-4病毒液滅活后,制備成油乳劑滅活疫苗,將疫苗頸部皮下接種3 周齡SPF雞,每只接種劑量分別為0.3 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.02 mL,每個劑量接種10 只。免疫后21 日,每組雞分別采血,測定血清的瓊擴效價。同時連同對照組雞10只,每只雞經肌肉注射FAdV-4 CPHB03株強毒,每只0.5 mL(含5×105.0TCID50)。攻毒后觀察7 d,記錄雞的臨床癥狀和死亡情況,觀察期結束后剖檢存活雞,觀察是否有心包積液、肝臟壞死等病變,以此確定疫苗的有效性。

2 結果與分析

2.1 LMH細胞全懸浮培養(yǎng)的馴化 轉入搖瓶懸浮培養(yǎng)的LMH細胞,F1～F3代有結團,結團細胞占總細胞數的比例高(圖1A),活率60%～75%;F6～F9代以單個細胞為主,結團細胞占總細胞數的比例低(圖1B),活率70%～85%;F12代細胞均為單個細胞(圖1C),密度4.1×106/mL,活率92%。說明通過逐步降低牛血清含量并更換懸浮培養(yǎng)基,已將LMH細胞馴化為適應無血清懸浮培養(yǎng)的細胞,命名為LMH-S細胞。將LMH-S連續(xù)傳代培養(yǎng)25代,各代次細胞大小均一、飽滿,培養(yǎng)3～4 d,細胞密度穩(wěn)定在4×106～6×106/mL,活率90%以上(圖2),細胞傳代穩(wěn)定性良好。

圖2 LMH-S細胞傳代生長穩(wěn)定性Fig 2 The stability of LMH-S cells through passage

2.2 LMH-S細胞接種密度的確定及生物反應器培養(yǎng) 將LMH-S以不同的初始細胞密度接種搖瓶進行懸浮培養(yǎng),初始細胞密度為0.2×106/mL時,細胞生產緩慢,活率下降較快;初始細胞密度為0.5×106/mL和1×106/mL,培養(yǎng)3～4 d細胞密度5×106/mL～6×106/mL(圖3)。以0.5×106/mL的密度接種3 L生物反應器,攪拌轉速100 r/min,細胞生長慢、活率低;攪拌轉速50 r/min,部分細胞結團影響細胞的生長和活率;攪拌轉速75 r/min,96 h～144 h細胞密度為6.0×106/mL以上,活率90%以上(圖4)。確定生物反應器懸浮培養(yǎng)LMH-S細胞最佳條件為:初始細胞密度0.5×106/mL～1×106/mL,攪拌轉速75 r/min。

圖3 不同初始密度接種時LMH-S細胞增殖曲線Fig 3 Growth curves of LMH-S cells inoculated with different cell densities

圖4 生物反應器懸浮培養(yǎng)攪拌速度對LMH-S細胞生長的影響Fig 4 Effect of stirring rate in suspension culture of bioreactor on growth of LMH-S cells

2.3 FAdV-4懸浮培養(yǎng)工藝研究 以病毒含量為最優(yōu)參數的篩選標準,接毒量0.1MOI和1MOI優(yōu)于0.01MOI;細胞密度2.0×106/mL和3.0×106/mL優(yōu)于4.0×106/mL。細胞密度2.0×106/mL和3.0×106/mL、接毒量0.1MOI和1MOI培養(yǎng)抗原,所獲病毒含量均不低于109.5TCID50/mL。接毒后隨著培養(yǎng)時間的延長,病毒含量逐漸升高,至60 h達到高峰,隨后降低(表2)。因此確定接毒時細胞密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL,接毒量為0.1～1 MOI,接毒后48～72 h收獲。

表2 接毒時不同細胞密度和接毒量對病毒增殖的影響Tab 2 Effects of different cell density and MOI on virus proliferation

2.4 生物反應器培養(yǎng)FAdV-4 用100L生物反應器及2.2項確定的工藝參數懸浮培養(yǎng)FAdV-4。結果顯示,接毒后60 h病毒含量均不低于109.25TCID50/mL,最高達到1010TCID50/mL(圖5)。

圖5 生物反應器培養(yǎng)病毒增殖曲線Fig 5 Virus proliferation curve in bioreactor culture

2.5 FAdV-4疫苗的有效性研究 血清檢測結果顯示,免疫后21日0.02 mL組 8/10抗體陽性,其他三組均10/10抗體陽性;攻毒結果顯示,0.02 mL組9/10保護,其他三組均10/10保護,攻毒對照全部發(fā)病且8/10死亡(表3)。說明懸浮培養(yǎng)制備的FAdV-4抗原具有良好的免疫原性。

表3 FAdV-4疫苗免疫雞攻毒保護情況Tab 3 FAdV-4 vaccine challenge protection of chickens

3 討論與結論

目前FAdV-4的防控主要是滅活疫苗免疫,其抗原生產多采用轉瓶和紙片載體懸浮培養(yǎng)LMH細胞[9]擴繁FAdV-4,這是基于LMH細胞的貼壁特性,培養(yǎng)過程中需要為細胞的生長提供有效的貼附表面。LMH細胞的傳代和擴大培養(yǎng)采用胰酶消化分散細胞,操作繁瑣,制約了生產規(guī)模的快速放大。單細胞全懸浮培養(yǎng)以其無需載體、操作簡單、易于放大,成為當前懸浮培養(yǎng)的主流技術[10]。將LMH細胞馴化成單細胞全懸浮培養(yǎng)細胞,建立簡單、高效的FAdV-4滅活疫苗抗原生產工藝,意義重大。

將貼壁培養(yǎng)的細胞馴化為全懸浮培養(yǎng)的細胞,常用方法是逐步降低培養(yǎng)液中的血清含量,使細胞適應無血清貼壁培養(yǎng),再用搖瓶懸浮培養(yǎng)并優(yōu)化培養(yǎng)條件,實現(xiàn)細胞懸浮培養(yǎng)[11-12]。本研究嘗試將降低血清含量和懸浮培養(yǎng)馴化同步進行,此方法能否成功的關鍵是LMH細胞經胰酶分散后能否直接適應搖瓶懸浮培養(yǎng)。結果顯示,未適應無血清貼壁培養(yǎng)LMH細胞可直接轉入搖瓶中懸浮培養(yǎng),雖然細胞有結團但活率可達60%～75%。分析是培養(yǎng)液中添加的用于細胞懸浮培養(yǎng)的103B培養(yǎng)基對LMH細胞在懸浮狀態(tài)下生長提供了營養(yǎng)和支撐。后續(xù)逐步增加103B培養(yǎng)基比例并降低血清和DMEM比例,經過12代的傳代培養(yǎng)馴化,獲得一株可在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的LMH細胞(命名為LMH-S)。相對常規(guī)馴化方法,本研究通過將適應無血清和懸浮培養(yǎng)馴化同步進行的方式,縮短了細胞傳代馴化的時間。貼壁培養(yǎng)的LMH細胞密度一般為1.3×106/mL～2.2×106/mL[13],而LMH-S細胞經過細胞接種密度的優(yōu)化,懸浮培養(yǎng)3 d～4 d細胞密度5×106/mL～6×106/mL,比貼壁細胞有顯著提升;連續(xù)傳代25代,細胞生長穩(wěn)定;且可在生物反應器中高密度懸浮培養(yǎng)。

在滅活疫苗研制中,抗原效價的高低不僅影響免疫效果,而且直接影響疫苗成本。本研究對LMH-S全懸浮培養(yǎng)FAdV-4的工藝進行優(yōu)化,確定接毒時細胞的密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL,接毒量為0.1～1MOI,接毒后培養(yǎng)48～72 h收獲,病毒含量最高可達109.75TCID50/mL,相對于紙片載體懸浮培養(yǎng),病毒含量提高10倍以上[9],為高效FAdV-4滅活疫苗的研制奠定了基礎。在懸浮培養(yǎng)放大工藝研究中,采用10 L和100 L生物反應器逐級放大培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)3批,接毒后60 h,病毒含量均不低于109.25TCID50/mL,最高達到1010TCID50/mL,工藝穩(wěn)定,且可放大。將懸浮培養(yǎng)的FAdV-4病毒液滅活后,制備疫苗,免疫0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL疫苗的試驗雞的攻毒保護率分別為9/10、10/10、10/10、10/10,達到良好的免疫保護效果。

綜上所述,建立了LMH全懸浮培養(yǎng)細胞株,確定了FAdV-4抗原的生物反應器懸浮培養(yǎng)工藝,生物反應器懸浮培養(yǎng)制備的FAdV-4滅活疫苗有效性良好。本研究確定的生產工藝培養(yǎng)的抗原病毒含量高,全懸浮培養(yǎng)無需載體,生產放大無需胰酶,操作簡潔,生產效率高生產成本低。以上研究為高效FAdV-4滅活疫苗的研制奠定了基礎。另外,建立的LMH全懸浮培養(yǎng)細胞株也可嘗試應用于其他禽用疫苗抗原培養(yǎng)研究。