王凡予，何偉偉*，李大婧，郭慶啟,*，羅 浩，陸義珠，包怡紅，張鐘元

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

玉米（Zea maysL.）是富含VA原的主要糧食作物[1]。除微量元素和膳食纖維外，黃色玉米籽粒還富含類胡蘿卜素，主要包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、葉黃素和玉米黃素等。胡蘿卜素類參與光合代謝，以防止高等植物氧化應(yīng)激引起的損害[2]，還可作為抗氧化劑[3]和必需營養(yǎng)素[4]，同時(shí)也是重要的VA原。其中α-胡蘿卜素在玉米光合組織捕獲光復(fù)合物時(shí)發(fā)揮功能，同時(shí)還可有效降低人類患心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[5]；β-胡蘿卜素不僅是最穩(wěn)定的天然色素，還可作為免疫調(diào)節(jié)因子增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。除了上述常見的胡蘿卜素外，自然界中還存在其他結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素如δ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素等，它們是合成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的中間物質(zhì)，但其功能研究較少。由于類胡蘿卜素只能通過食物攝取[7]，因此，目前諸多研究都關(guān)注于類胡蘿卜素的富集調(diào)控機(jī)制方面[8-9]。

番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopeneβ-cyclase，LCYb）和ε-環(huán)化酶（lycopeneε-cyclase，LCYe）是調(diào)控類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶[10]。α-胡蘿卜素源于番茄紅素兩端的非對(duì)稱環(huán)化，而β-胡蘿卜素是由番茄紅素分子兩端分別對(duì)稱環(huán)化β-紫羅蘭酮環(huán)而形成[11]。LCYb和LCYe催化番茄紅素的特性已在擬南芥[12]、小麥[13]、芹菜[14]、柑橘[15]、花椰菜[16]等植物中得到研究，但在每種植物中番茄紅素環(huán)化酶催化番茄紅素所生成的胡蘿卜素種類和含量卻并不相同，最常見的是含有ε-和β-環(huán)的α-胡蘿卜素及雙β-環(huán)的β-胡蘿卜素，而具有雙ε-環(huán)的胡蘿卜素卻很少存在。Cunningham等[17]發(fā)現(xiàn)萵苣LCYe能催化全反式番茄紅素的兩個(gè)末端形成有兩個(gè)ε-環(huán)的ε-胡蘿卜素，而擬南芥更傾向合成δ-胡蘿卜素。由此可見，植物中胡蘿卜素的種類和積累與番茄紅素環(huán)化酶的表達(dá)模式和功能特性具有一定的關(guān)系，Bai Ling等[18]研究發(fā)現(xiàn)在玉米不同組織中類胡蘿卜素的積累模式不同，同時(shí)將玉米LCYe基因引入大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，在沒有LCYb存在的情況下，玉米LCYe可催化番茄紅素生成δ-和ε-胡蘿卜素。而自然界植物體內(nèi)往往同時(shí)存在番茄紅素LCYb和LCYe，兩者共同催化番茄紅素的機(jī)制需進(jìn)一步探究。

本研究擬通過體外獲得玉米番茄紅素環(huán)化酶（ZmLCYb和ZmLCYe）全長，通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測其化學(xué)性質(zhì)；利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)番茄紅素環(huán)化酶進(jìn)行異源表達(dá)并純化蛋白；通過“顏色互補(bǔ)”及產(chǎn)物分析測定探究ZmLCYb和ZmLCYe的催化特性。旨在揭示LCYb和LCYe催化番茄紅素生成胡蘿卜素的功能特性，為開展玉米類胡蘿卜素分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L， 酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix試劑盒、DL 2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶NotI、BamH I、NdeI、BglII 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside，IPTG）、5×蛋白上樣緩沖液、卡那霉素、Seamless Cloning master mix、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、GST 4 FF 柱純化回收試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY88-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 新芝生物科技股份（寧波）有限公司；LBI-150生化培養(yǎng)箱 龍躍儀器設(shè)備（上海）有限公司；5424R臺(tái)式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；BS224S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽玉米總RNA提取

取新鮮黃色玉米籽粒（‘蘇玉29’）置于液氮中并在研缽中研磨成粉末，參照試劑盒說明書提取黃色玉米的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

LCYb和LCYe基因克?。焊鶕?jù)NCBI檢索結(jié)果，獲得LCYb序列（基因登錄號(hào)NP_001169155.1）和LCYe序列（基因登錄號(hào)NP_001146840.1），并利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異引物E-P1/E-P2、B-P3/B-P4、B-P5/B-P6、E-P7/E-P8、EB-P9/EB-P10、EB-P11/EB-P12（表1）。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增并回收目的基因片段。

表1 LCYe和LCYb基因的擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of LCYe and LCYb genes

線性化載體：質(zhì)粒pET-28a（＋）和pGEX-4T-1分別用BamH I和NotI進(jìn)行雙酶切，pCDFDuet-1質(zhì)粒用NdeI和BglII（LCYb插入位點(diǎn)）、BamH I和NotI（LCYe插入位點(diǎn)）進(jìn)行酶切，酶切片段經(jīng)純化回收。

重組質(zhì)粒的構(gòu)建：參照無縫克隆試劑盒說明書，將目的基因片段與線性化載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在相應(yīng)抗性平板，篩選轉(zhuǎn)化子并通過質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-B、pET-E、pCDF-BE、pGEX-B和pGEX-E（表2）。

表2 菌株和質(zhì)粒Table 2 Strains and plasmids used in this study

1.3.3 生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測利用ExPASy（https://web.expasy.org）的ProtParam和ProtScale工具，蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析采用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三維建模使用SWISSS MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）工具，氨基酸序列的同源性比對(duì)利用BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用MEGA 6.0的鄰接法。

粉彩花鳥瓷繪畫中粉彩清雅的釉色與瓷器瑩潤的玻璃白的結(jié)合與國畫中花鳥作品的線條和清雅的色彩有著異曲同工之妙。

1.3.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

1.3.4.1 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-B和pGEX-E重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21（D E 3）感受態(tài)中，涂布在L B 固體培養(yǎng)基上（含Amp 50 μg/mL）。37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基（含Amp 50 μg/mL）中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，在100 mL LB培養(yǎng)基中以1∶100（V/V）的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，相同條件下再培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～0.8時(shí)，向菌液中加入IPTG（終濃度1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4 h后將培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min離心收集菌體，緩沖液重懸菌體后超聲破碎，離心取上清液，得到ZmLCYe和ZmLCYb的蛋白粗酶液。

1.3.4.2 基于谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）標(biāo)簽親和層析純化

經(jīng)0.22 μm濾膜過濾粗酶液后，以0.5 mL/min的流速加入預(yù)平衡好的GST4 FF柱。加入Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0，含10 mmol/L還原型谷胱甘肽）以1 mL/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用12%分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定。

1.3.4.3 SDS-PAGE分析

將純化后的ZmLCYe和ZmLCYb蛋白液加入5×蛋白上樣緩沖液（1∶4，V/V），100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min后，分別收集上清液，檢測上清液中重組蛋白。

1.3.5ZmLCYb和ZmLCYe在大腸桿菌中的顏色互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

將pAC-LYC質(zhì)粒與pET-B、pET-E和pCDF-BE質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取固體培養(yǎng)基上的陽性單菌落，在30 ℃同樣條件下過夜培養(yǎng)，至OD600nm為0.6～0.8。然后加入終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)48 h，離心收集菌體，進(jìn)行顏色比對(duì)。

1.3.6 大腸桿菌中類胡蘿卜素的提取與測定

將收集的菌體加入85%丙酮溶液萃取，懸浮吹打至菌體無色，加入正己烷，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊螅眉状紡?fù)溶，有機(jī)濾膜（0.45 μm）過濾后進(jìn)高效液相色譜儀分析檢測[20]。

類胡蘿卜素檢測參考Liang Minghua等[21]的方法。通過甲醇、水和甲基叔丁基醚（tert-butyl mehyl ether，MTBE）三元梯度洗脫，檢測儀器型號(hào)為Agilent G7117A二極管陣列檢測器。色譜條件為：柱溫25 ℃，YMC Carotenoid C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相分為A相（97%甲醇）（含0.05 mol/L乙酸銨和0.1% BHT）和B相（100% MTBE）（含0.1% BHT），流速為1 mL/min，分析物的檢測采用二極管陣列檢測器（200～700 nm）進(jìn)行，進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫條件：0～10 min，100%～90% A、0%～10% B；1 0 ～2 0 m i n，9 0%～6 0% A、1 0%～4 0% B；2 0 ～2 5 m i n，6 0%～5 0% A、4 0%～5 0% B；2 5 ～2 9 m i n，5 0%～1 0% A、5 0%～9 0% B；29～29.5 min，10% A、90% B；29.5～40 min，10%～90% A、90%～10% B。一次洗脫，得到一個(gè)特征峰色譜圖，在對(duì)應(yīng)的最大吸收波長處都有類胡蘿卜素峰。番茄紅素、β-胡蘿卜素通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定，α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素等類胡蘿卜素的定性通過樣品保留時(shí)間與特征光譜值進(jìn)行鑒定[22-23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。使用Excel 2021、Origin 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmLCYb和ZmLCYe的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得兩條特異性條帶（圖1）。經(jīng)測序分別得到全長LCYb1 470 bp和LCYe1 611 bp的序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中LCYb基因和LCYe基因序列一致，結(jié)合雙酶切均有兩條目的條帶的結(jié)果，表明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-B、pET-E、pCDF-BE、pGEX-B和pGEX-E。

圖1 ZmLCYe和ZmLCYb基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR amplified ZmLCYe and ZmLCYb genes

2.2 ZmLCYb和ZmLCYe生物信息學(xué)分析

利用ExPASy的ProtParam工具推測LCYb和LCYe理化性質(zhì)結(jié)果如下：ZmLCYb和ZmLCYe氨基酸序列分別包含490 個(gè)氨基酸和537 個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量約為53.3 kDa和59.7 kDa，親水最大值分別為3.314和3.378，疏水最大值分別為2.678和3.044，表明ZmLCYb和ZmLCYe蛋白都為親水性蛋白。ZmLCYb和ZmLCYe等電點(diǎn)分別為6.87和6.25，呈中性，預(yù)測蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)分別為45.18%和41.44%，表明ZmLCYb蛋白和ZmLCYe蛋白都為不穩(wěn)定性蛋白。

首先利用NCBI BLAST對(duì)LCYb和LCYe的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，然后利用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建ZmLCYb和ZmLCYe與其他綠色植物、綠藻及微生物來源的番茄紅素環(huán)化酶同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2A和圖3A）。結(jié)果表明，玉米與高等植物在同一分支，發(fā)現(xiàn)玉米LCYb與高粱LCYb和小麥LCYb的氨基酸序列相似性分別為95.75%和83.94%，玉米LCYe與高粱LCYe和小米LCYe的氨基酸序列相似性分別為95.53%和91.48%，推測玉米番茄紅素環(huán)化酶的功能可能與高粱中的功能相似?？缒^(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)LCYb蛋白未跨膜，LCYe蛋白至少存在兩處跨膜區(qū)域（圖2B和圖3B）。利用SWISS-MODEL對(duì)玉米番茄紅素環(huán)化酶進(jìn)行同源建模（圖2C和圖3C），對(duì)所得蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果進(jìn)行Verify3D評(píng)價(jià)，超過80%的氨基酸序列符合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，表明這個(gè)三級(jí)建模的結(jié)果可以信任。

圖2 ZmLCYb進(jìn)化樹（A）、跨膜區(qū)預(yù)測（B）和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（C）Fig.2 ZmLCYb evolutionary tree (A), predicted transmembrane region (B) and predicted tertiary structure (C)

圖3 ZmLCYe進(jìn)化樹（A）、跨膜區(qū)預(yù)測（B）和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（C）Fig.3 ZmLCYe evolutionary tree (A), predicted transmembrane region (B) and predicted tertiary structure (C)

2.3 ZmLCYe和ZmLCYb的原核表達(dá)

重組大腸桿菌BL21/pGEX-B和BL21/pGEX-E，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在SDS-PAGE中73 kDa和79 kDa左右處可見兩條比較明顯的蛋白條帶（圖4）。由于GST標(biāo)簽本身由220 個(gè)氨基酸組成，大小約26 kDa，因此電泳圖中較粗的兩條帶與預(yù)期的GST-LCYe（約79 kDa）和GSTLCYb（約73 kDa）蛋白大小一致。綜上，通過與GST標(biāo)簽的融合，ZmLCYb和ZmLCYe成功在大腸桿菌中表達(dá)并純化。

圖4 GST-LCYe和GST-LCYb蛋白純化Fig.4 SDS-PAGE patterns of purified GST-LCYe and GST-LCYb proteins

2.4 玉米番茄紅素環(huán)化酶的顏色互補(bǔ)鑒定及功能分析

質(zhì)粒pAC-LYC攜帶crtE、crtB和crtI基因，可使含有pAC-LYC質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21（DE3）菌體呈現(xiàn)紅色，在此基礎(chǔ)上引入ZmLCYb和ZmLCYe外源基因后，由于番茄紅素會(huì)轉(zhuǎn)化生成不同種類的胡蘿卜素，從而導(dǎo)致菌體顏色發(fā)生變化，呈現(xiàn)黃色或橙黃色[24]。因此，pET-B、pET-E和pCDF-BE分別轉(zhuǎn)化至重組大腸桿菌BL21（DE3）/pAC-LYC中，通過觀察菌體的顏色變化驗(yàn)證ZmLCYb和ZmLCYe的功能（圖5A）。作為空白對(duì)照組BL21（DE3）/pAC-LYC的菌體呈現(xiàn)出番茄紅素特有的紅色。與空白對(duì)照相比，pET-B與pAC-LYC共轉(zhuǎn)化的菌體呈現(xiàn)黃色，而pET-E與pAC-LYC共轉(zhuǎn)化的菌體呈現(xiàn)橘黃色，此外，pCDF-BE與pAC-LYC共轉(zhuǎn)化的菌體顏色也發(fā)生變化。說明LCYb和LCYe基因成功在大腸桿菌中表達(dá)并存在一定活性，將番茄紅素催化生成不同種類的胡蘿卜素。

圖5 ZmLCYb和ZmLCYe的功能鑒定Fig.5 Functional identification of ZmLCYb and ZmLCYe

高效液相色譜結(jié)果表明，當(dāng)ZmLCYb與pAC-LYC共表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物主要是β-胡蘿卜素，但發(fā)現(xiàn)了少量的α-胡蘿卜素存在（圖5B）。說明ZmLCYb除了具有LCYb活性外，還具有少量LCYe活性。當(dāng)ZmLCYe與pAC-LYC在大腸桿菌共表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物中主要是單環(huán)的δ-胡蘿卜素，高效液相色譜并未檢測到ε-胡蘿卜素。當(dāng)pCDF-BE與pAC-LYC共轉(zhuǎn)化大腸桿菌中時(shí)，主要產(chǎn)物是α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和δ-胡蘿卜素，還有少量的γ-胡蘿卜素和ε-胡蘿卜素。說明番茄紅素第一步環(huán)化得到的單環(huán)δ-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素并不易在體內(nèi)存在，而是生成更多的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。此外還檢測到極少量的ε-胡蘿卜素，表明兩端都形成ε-環(huán)的ε-胡蘿卜素不易發(fā)生。在玉米番茄紅素LCYb和LCYe同時(shí)存在的情況下，α-胡蘿卜素/β-胡蘿卜素比例更高。

3 討 論

黃色玉米籽粒是類胡蘿卜素的良好來源，并且其中部分胡蘿卜素可在人體中轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩砘钚缘腣A。Liang Minghua等[25]已經(jīng)對(duì)藻類細(xì)菌和植物體內(nèi)類胡蘿卜素的合成與代謝途徑進(jìn)行總結(jié)。PSY1是類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵限速酶，在玉米胚乳中過表達(dá)可使胚乳總類胡蘿卜素含量增加50 倍[26]。Li Qunrui等[27]在玉米中分離出2 個(gè)類胡蘿卜素異構(gòu)酶（carotenoid isomerase，CRTISO）基因和2 個(gè)β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH）基因，并發(fā)現(xiàn)玉米BCH1基因可以使β-胡蘿卜素生成β-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)，而BCH2基因只轉(zhuǎn)化成β-隱黃質(zhì)；在玉米CRTISO 1存在的情況下，可形成全反式番茄紅素異構(gòu)體。α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素都是重要的VA的前體物質(zhì)，研究表明玉米LCYb和LCYe基因表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)弱決定了α-胡蘿卜素/β-胡蘿卜素的含量比例[28]，因此研究番茄紅素環(huán)化酶功能對(duì)深入解析番茄紅素環(huán)化機(jī)制具有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以黃色玉米為模板克隆了玉米番茄紅素環(huán)化酶ZmLCYe和ZmLCYb基因，通過多序列比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹分析了藻類番茄紅素環(huán)化酶（crtL）、番茄紅素環(huán)化酶（crtY）以及植物番茄紅素酶（LCY）的同源性。結(jié)果表明，不同物種間雖然氨基酸序列的保守模式各不相同，但crtY、crtL和LCY基因通常被認(rèn)為具有共同的系統(tǒng)起源（細(xì)菌crtY），且藻類crtL和植物L(fēng)CY在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)玉米與高粱在高等植物中有較為接近的親緣關(guān)系。這些單子葉植物之間的氨基酸是高度保守的，都具有共同特征“FLYAMP”序列和FAD/NAD（P）結(jié)合區(qū)[29]，它們所擁有的LCYe基因和LCYb基因可能是由共同的基因進(jìn)化而來，且在進(jìn)化過程中沒有改變，推測該保守區(qū)域?yàn)榉鸭t素環(huán)化酶的功能區(qū)，只能使番茄紅素的一端環(huán)化[30]。

類胡蘿卜素生物合成酶大多位于細(xì)胞質(zhì)膜上，存在體外表達(dá)不穩(wěn)定且蛋白表達(dá)量少的問題[11]。番茄紅素環(huán)化酶在大腸桿菌中異源表達(dá)時(shí)，通常會(huì)形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)，使LCYe和LCYb蛋白形成以包涵體形式存在的不溶性聚集體[31]。預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用組氨酸標(biāo)簽構(gòu)建融合表達(dá)蛋白發(fā)現(xiàn)純化后蛋白電泳條帶較淺，推測純化得到的蛋白較少。因此，本研究將目的蛋白與高可溶性GST標(biāo)簽融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在電泳膠上約79 kDa和73 kDa處有明顯清晰條帶，證明GST-LCYe和GST-LCYb蛋白表達(dá)并純化成功，但是含有少量雜帶，可能是由于雜蛋白與還原型谷胱甘肽相發(fā)生特異性結(jié)合。

番茄紅素的環(huán)化在植物中分成兩個(gè)分支，其中一個(gè)分支番茄紅素被催化生成α-胡蘿卜素，另一分支則生成β-胡蘿卜素。盡管LCYb和LCYe已在多種植物中得到表征，但關(guān)于玉米LCYb與LCYe在類胡蘿卜素生物合成中的功能信息較少，且目前研究主要集中在單獨(dú)番茄紅素環(huán)化酶功能。本研究發(fā)現(xiàn)玉米ZmLCYb具有β-環(huán)活性，可以分別催化番茄紅素、γ-胡蘿卜素和δ-胡蘿卜素生成γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。但是重組大腸桿菌BL21（DE3）/pAC-LYC＋pET-B產(chǎn)物中還檢測到少量的α-胡蘿卜素，因此，ZmLCYb同時(shí)也具有微弱番茄紅素LCYe活性，推測其可以催化γ-胡蘿卜素或番茄紅素的一端形成了ε-環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，桂花的OfLCYb具有β-環(huán)單環(huán)酶的功能，可以將番茄紅素全部轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素，產(chǎn)物中未檢測到單環(huán)γ-胡蘿卜素存在[32]。此外，盡管藻類與植物在基因序列存在相似，但是在單細(xì)胞紅藻中發(fā)現(xiàn)BfLCYb能夠?qū)⒎鸭t素的一端或兩端環(huán)化為β-環(huán)，但不具有ε-環(huán)活性[20]。

在植物中LCYe通常不接受單環(huán)胡蘿卜素作為底物，而是在番茄紅素的一端催化形成單個(gè)ε-環(huán)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)ZmLCYe能夠在大腸桿菌系統(tǒng)中具有雙ε-環(huán)活性，催化δ-胡蘿卜素形成雙環(huán)的ε-胡蘿卜素，與前期研究發(fā)現(xiàn)的玉米LCYe能催化番茄紅素的兩個(gè)末端形成ε-紫羅蘭酮環(huán)而生成ε-胡蘿卜素的結(jié)果一致[28]。此外，Bai Ling等[18]在LCYb基因突變失活的玉米中發(fā)現(xiàn)δ-胡蘿卜素和ε-胡蘿卜素為主要的胡蘿卜素，推測玉米LCYe具有單環(huán)和雙環(huán)ε-環(huán)活性。同樣地，地錢LCYe能夠催化番茄紅素生成單環(huán)的δ-胡蘿卜素，隨后繼續(xù)催化形成兩ε-環(huán)的ε-胡蘿卜素[34]。本研究通過體外克隆玉米番茄紅素環(huán)化酶基因ZmLCYe和ZmLCYb，并借助于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)探究了玉米番茄紅素環(huán)化酶的催化特性，進(jìn)一步解析了玉米中番茄紅素環(huán)化酶催化番茄紅素生成胡蘿卜素的機(jī)制。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)克隆了玉米LCYe和LCYb基因，發(fā)現(xiàn)其與高粱編碼LCYb和LCYe基因相似性分別達(dá)95.75%和95.53%。通過體外構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，成功在大腸桿菌表達(dá)并純化了玉米LCYe和LCYb蛋白。玉米LCYb和LCYe在大腸桿菌中表現(xiàn)出一定的活性，可以催化番茄紅素生成不同顏色的胡蘿卜素。ZmLCYb具有β-環(huán)催化活性，可以以番茄紅素、γ-胡蘿卜素和δ-胡蘿卜素作為底物，分別催化生成γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。同時(shí)ZmLCYb也具有微弱ε-環(huán)的活性，能夠催化番茄紅素和γ-胡蘿卜素，分別生成δ-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。ZmLCYe具有ε-環(huán)活性，能夠催化番茄紅素的兩端形成雙ε-環(huán)產(chǎn)生ε-胡蘿卜素。本研究不僅為深入解析玉米類胡蘿卜素合成調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為玉米番茄紅素環(huán)化酶的應(yīng)用提供了理論參考。