相 歡，崔 春*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 500360；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

近年來肥胖癥患者數(shù)量明顯上升，預(yù)計(jì)2030年將超過33億[1]。造成肥胖的原因是體內(nèi)脂肪過多堆積、脂質(zhì)代謝異常。胰脂肪酶（EC3.1.1.3）是人類脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，可作為抗肥胖藥物的特定靶點(diǎn)。奧利司他作為一種胰脂肪酶抑制劑，可抑制30%的胰脂肪酶發(fā)揮酶解功效，降低脂肪吸收，但因其副作用較大而不被廣泛接受[2]。食品來源的胰脂肪酶抑制劑，如多酚[3]、多糖[4]、多肽[5]等不僅有效抑制胰脂肪酶的活性，而且安全性更高，是目前食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)。其中多肽作為胰脂肪酶抑制劑的研究逐漸增加，Stefanucci等[6]采用化學(xué)合成含精氨酸的堿性多肽（FRN、WRN、NRN、KRM），發(fā)現(xiàn)以上多肽可與胰脂肪酶活性位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮抑制活性；Mudgil等[7]采用堿性蛋白酶酶解9 h制備駱駝奶蛋白肽，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制胰脂肪酶活性，IC50值為0.029 mg/mL；Fan Xiaodan等[8]采用胃蛋白酶酶解制備螺旋藻蛋白肽，研究表明3～5 kDa組分對(duì)胰脂肪酶有較好的抑制作用（72%）。沙棘籽粕作為加工副產(chǎn)物，具有蛋白含量高和氨基酸組成完全（精氨酸含量高）的特點(diǎn)，目前主要用于單胃動(dòng)物的飼料補(bǔ)充，以改善單胃動(dòng)物健康狀態(tài)和生長(zhǎng)效率[9]。目前關(guān)于沙棘籽粕蛋白肽的研究主要涉及抗氧化[10]、抑菌[11]、降血糖[12]、醒酒[13]等活性，王文娟[14]報(bào)道了沙棘籽粕蛋白可以有效降低糖尿病小鼠的體質(zhì)量和體內(nèi)甘油三酯的含量，因此，開發(fā)沙棘籽粕蛋白抗肥胖肽具有極大的市場(chǎng)前景。

活性肽是一類具有特殊生理功能的蛋白質(zhì)片段，受到外界影響時(shí)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其性質(zhì)發(fā)生改變[15]。高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、金屬離子及光照等眾多因素都會(huì)對(duì)多肽的活性產(chǎn)生影響。例如，張麗娜[16]研究發(fā)現(xiàn)核桃肽在高溫（120 ℃）、強(qiáng)酸（pH 1.0）或強(qiáng)堿（pH 11.0）條件活性降低；彭金秀[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，銅離子可顯著提高抗菌肽（HMPI）對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性；Xiao Chuqiao等[18]報(bào)道來源于雞胸蛋白的乙醇脫氫酶激活肽能夠在低濃度的金屬離子下保持活性；Liu Kunlun等[19]報(bào)道不同光照會(huì)影響來源于硒化糙米水解蛋白中抗氧化肽SeMet-Pro-Ser的活性。

由于在多肽混合物中存在拮抗或協(xié)同作用，存在于蛋白質(zhì)水解物中的單個(gè)多肽的生物活性可能與分離時(shí)差異明顯，因此需要進(jìn)行濃縮純化驗(yàn)證生理活性。根據(jù)肽的電荷、大小、溶解度和親水性（即化合物的疏水性和親水性）的不同，可采用以下分離手段：沉淀、超濾、大孔樹脂吸附、固相萃取、活性炭吸附等[20-21]。經(jīng)過分離純化之后的樣品采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）進(jìn)行鑒定，往往會(huì)得到數(shù)目較多的多肽序列，會(huì)因樣品數(shù)目過多而增加實(shí)驗(yàn)成本。近年來，研究者們利用計(jì)算機(jī)模擬分析食物蛋白水解后釋放的活性肽，進(jìn)而利用生物信息學(xué)進(jìn)行篩選，采用定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系和分子對(duì)接手段預(yù)測(cè)目標(biāo)分子的活性，該方式的可信度已被多個(gè)研究證明[22-23]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)首先探究了溫度、pH值、金屬離子、光照及氧氣對(duì)沙棘籽粕蛋白胰脂肪酶肽抑制活性的影響。在此基礎(chǔ)上，為獲得具有更高活性的沙棘籽粕蛋白肽（seabuckthorn seed peptides from alcalase hydrolysates，SSPA），以豬胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL）抑制率為指標(biāo)，將沙棘籽粕蛋白酶解液依次通過超濾、大孔樹脂進(jìn)行分離，篩選出具有較強(qiáng)活性的多肽，利用分子對(duì)接分析活性肽與PPL之間的作用，化學(xué)合成活性肽對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沙棘籽粕胰脂肪酶抑制肽提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘籽粕蛋白由實(shí)驗(yàn)室自制；PPL（30 000 U/g）Sigma上海生物科技有限公司；堿性蛋白酶（8 000 U/mL）諾維信中國(guó)有限公司；超濾膜包（10、3 kDa） 密理博中國(guó)有限公司；DA201C大孔樹脂、D101大孔樹脂、XAD16大孔樹脂、HPD826大孔樹脂 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT100-1恒流泵 保定齊力恒流泵有限公司；U-3000液相色譜儀、Multiskan Sky酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛科技有限公司；1290超高壓液相色譜-質(zhì)譜儀 德國(guó)布魯克科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘籽粕蛋白及SSPA的制備

稱取100 g沙棘籽粕粉末，加入9 倍質(zhì)量的水，調(diào)節(jié)pH值至11.0，37 ℃提取40 min，重復(fù)提取3 次，8 000×g離心25 min，收集上清液，將上清液的pH值調(diào)節(jié)至5.0，植酸酶添加量為0.2%（m/m），50 ℃反應(yīng)3 h，8 000×g離心，收集沉淀，沉淀加水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH值至7.0，冷凍干燥后得到蛋白純度為70.21%的沙棘籽粕蛋白。

稱取沙棘籽粕蛋白（SSP，4 g）分散于100 mL蒸餾水中，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，堿性蛋白酶添加量為0.25%（m/m，以蛋白質(zhì)量計(jì)），50 ℃振蕩酶解8 h后沸水浴滅酶處理10 min，用普通濾紙進(jìn)行過濾得到上清液進(jìn)行凍干，將其命名為SSPA。

1.3.2 PPL抑制率測(cè)定

參考周麗麗[24]的方法測(cè)定PPL抑制率。底物A：稱取聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）20 g，加入800 mL蒸餾水，在沸水中加熱攪拌至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL，得2% PVA溶液，過濾備用。底物B：量取底物A溶液150 mL與50 mL橄欖油混合均勻，采用高速剪切機(jī)以10 000 r/min剪切處理9 min，得到乳白色PVA溶液。在25 mL比色管中加入2 mL底物B及2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.2），混勻后于恒溫水浴鍋（40 ℃）中反應(yīng)20 min，迅速加入6 mL乙醇溶液（95%）和1 mL鹽酸溶液（6 mol/L）中止反應(yīng)，再加入3 mL異辛烷旋渦振蕩90 s后，于60 ℃水浴鍋中靜置分層，室溫冷卻后取上層溶液1 mL于10 mL離心管中，再加入4 mL異辛烷及1 mL醋酸銅顯色劑旋渦振蕩90 s，靜置分層后取上層有機(jī)相，在波長(zhǎng)714 nm處測(cè)定吸光度。其中，空白實(shí)驗(yàn)不添加SSPA，其他操作相同。PPL抑制率按式（1）計(jì)算：

式中：Aa為不添加SSPA的吸光度；Ab為添加SSPA的吸光度。

1.3.3 SSPA穩(wěn)定性分析

1.3.3.1 SSPA溫度穩(wěn)定性測(cè)定

稱取1.3.1節(jié)中的SSPA（200 mg）溶解于100 mL超純水中，溶液配制5 組，置于25～100 ℃恒溫水浴鍋中保溫2 h，將溶液冷卻至室溫后，測(cè)定各組SSPA的PPL抑制率，將25 ℃時(shí)的PPL抑制率設(shè)為對(duì)照組（100%），其他組與之相比，得出PPL抑制活性保留率。

1.3.3.2 SSPA pH值穩(wěn)定性測(cè)定

按照1.3.3.1 節(jié)的方法配制7 組S S P A，調(diào)節(jié)pH 3.0～12.0。室溫保持2 h，之后將pH值調(diào)節(jié)為7.0，測(cè)定各組SSPA的PPL抑制率，以pH 7.0的PPL抑制率為對(duì)照組（100%），其他組與之相比，計(jì)算得出PPL抑制活性保留率。

1.3.3.3 SSPA金屬離子穩(wěn)定性測(cè)定

按照1.3.3.1節(jié)的方法配制8 組SSPA（其中一組為對(duì)照組），室溫條件下（25 ℃），分別加入不同的金屬離子（Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋、Al3＋、Cu2＋），金屬離子最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%。2 h之后測(cè)定各組SSPA的PPL抑制率，以不加金屬離子的PPL抑制率為對(duì)照（100%），其他組與之相比，計(jì)算PPL抑制活性保留率。

1.3.3.4 SSPA光照穩(wěn)定性測(cè)定

按照1.3.3.1節(jié)方法配制3 組SSPA，室溫條件下（25 ℃），分別將其放置于日光燈、紫外燈和黑暗環(huán)境中30 min，測(cè)定各組SSPA的PPL抑制率。

1.3.3.5 SSPA氧氣條件穩(wěn)定性測(cè)定

按照1.3.3.1節(jié)方法配制2 組SSPA，室溫條件下（25 ℃），分別置于有氧和無氧條件下，放置24 h后測(cè)定各組SSPA的PPL抑制率。

1.3.4 SSPA的分離純化

1.3.4.1 超濾分離SSPA

分別采用分子質(zhì)量為10 kDa和3 kDa的超濾膜包對(duì)SSPA進(jìn)行分離，收集各組分，分別定義為SSPAH（＞10 kDa）、SSPAM（10～3 kDa）、SSPAL（＜3 kDa），冷凍干燥后，測(cè)定蛋白含量、PPL抑制率，選出活性較高的組分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.4.2 大孔樹脂分離SSPA

大孔樹脂預(yù)處理：參考賀磊[25]的方法：將4 種樹脂分別用過量乙醇溶液（95%）浸泡24 h，使其充分溶脹，之后用乙醇溶液（95%）繼續(xù)清洗，至洗出液加等量的蒸餾水無白色渾濁為止，再用蒸餾水洗至澄清且沒有乙醇味；浸泡過的樹脂先用2～3 倍體積的稀鹽酸（1 mol/L）處理3～5 h，再用蒸餾水洗脫至pH值為中性；最后用2～3 倍體積的NaOH溶液（1 mol/L）浸泡3～5 h，用蒸餾水洗脫至pH值為中性，烘干備用。

大孔樹脂靜態(tài)吸附：稱取10 g樹脂（記為m0）與50 mL SSPAL（C0）（15 mg/mL記為ρ0）混合，25 ℃、200 r/min振蕩4 h。不同時(shí)間點(diǎn)（Vt）收集樣品記為ρt，過濾得到吸附液（Ct），采用BCA試劑盒測(cè)定吸附液的蛋白質(zhì)量濃度，吸附量和吸附率按式（2）、（3）計(jì)算：

大孔樹脂解吸：將不同樹脂（0.50 g，記為m0）與5 mL（15 mg/mL，記為ρ0）SSPAL混合，150 r/min振蕩4 h（25 ℃）。過濾的吸附液測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度記為ρ1，將5 mL不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%）與樹脂混合，25 ℃處理24 h，收集解吸液，記錄體積（V2）和測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度（ρ2）解吸率按式（4）計(jì)算：

SSPAL的動(dòng)態(tài)吸附研究：將SSPAL（50 mg/mL）與經(jīng)過預(yù)處理的HPD826混合，裝柱（2.5 cm×60 cm），靜置吸附一段時(shí)間，40%乙醇溶液以5 mL/min的流速通過柱子，收集洗脫組分記為SSPAL-E，冷凍干燥測(cè)定其蛋白含量和PPL抑制率。

1.3.5 SSPA的鑒定

選擇上述經(jīng)分離純化之后的組分SSPAL-E凍干備用。配制5%固形物含量的樣品，使用UPLC-MS/MS鑒定SSPA，進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相條件如表1所示。MS（一級(jí)質(zhì)譜）和MS/MS（二級(jí)質(zhì)譜）的掃描范圍均為m/z50～3 000，使用Mascot軟件搜索比對(duì)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合手動(dòng)從頭測(cè)序（de novo）的方法鑒定SSPA段。利用Peptide Ranker計(jì)算沙棘籽粕蛋白肽的生物活性概率。

表1 流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions

1.3.6 SSPA的篩選

首先采用ToxinPred分析SSPA的毒性，其次采用PepSite2計(jì)算SSPA與PPL的結(jié)合概率（以P值表示，P＜0.05為有效值）。篩選之后，采用Auto-Dock進(jìn)行對(duì)接分析，利用RCSB下載豬胰脂肪酶（PPL，1ETH）的X射線晶體結(jié)構(gòu)，利用ChemBio3D繪制SSPA的結(jié)構(gòu)，并將其進(jìn)行能量最小化處理。在Pymol中去除PPL的所有水分子，在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中加入極性氫原子進(jìn)行對(duì)接，定義了一個(gè)尺寸為72 ?×29 ?×144 ?的網(wǎng)格盒，以0.375 ?的網(wǎng)格間距包圍活性位點(diǎn)。采用Discovery Studio 2021 Client進(jìn)行繪圖分析。

1.3.7 SSPA的合成

基于UPLC-MS/MS鑒定篩選得到SSPA，委托試劑公司進(jìn)行SSPA的定向合成，配制不同質(zhì)量濃度的SSPA，測(cè)定其PPL抑制率，計(jì)算IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SSPA穩(wěn)定性分析

如圖1所示，外界環(huán)境會(huì)影響SSPA的PPL抑制活性。熱處理是食品加工中的一種重要方法，在60～90℃過程中，蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變性或聚集[26]。與常溫條件下的SSPA相比，適當(dāng)升高溫度（45、65 ℃）對(duì)SSPA的PPL抑制活性不會(huì)產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05），當(dāng)溫度升高到85 ℃，其PPL抑制活性顯著降低，但仍保持在90%以上（圖1A）。張麗娜[16]報(bào)道關(guān)于溫度對(duì)核桃肽的影響與本研究結(jié)果相近。但Tao Mengliang等[27]研究發(fā)現(xiàn)來源于蠶蛹蛋白的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽GNPWM在40～80 ℃處理過程中，其ACE抑制活性無明顯變化。

圖1 不同因素對(duì)SSPA的PPL抑制率的影響Fig.1 Effects of different factors on PPL inhibitory activity of SSPA

SSPA對(duì)PPL抑制活性的保留率隨pH值的變化呈現(xiàn)中間高兩端低的特點(diǎn)，pH值過高或過低可能會(huì)對(duì)SSPA的結(jié)構(gòu)造成影響從而影響其活性。但是整體而言，在整個(gè)pH值范圍內(nèi)（3.0～12.0）PPL抑制活性保持在80%左右，表明SSPA具有較廣的應(yīng)用范圍（圖1B）。Fu Yu等[28]報(bào)道來源于牛結(jié)締組織的多肽在強(qiáng)堿性（pH 10.0）條件下，ACE抑制活性顯著降低，在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)，ACE抑制活性有輕微波動(dòng)。Wu Wei等[29]報(bào)道了牛酪蛋白衍生肽的ACE抑制活性在強(qiáng)堿性條件下顯著降低，其原因可能是部分活性肽在強(qiáng)堿性加熱作用下被進(jìn)一步降解為非活性片段。

金屬離子是食品配方中常見成分，因此測(cè)定其對(duì)SSPA活性的影響十分必要。與未添加金屬離子的SSPA相比，加入適量的Na＋和Mg2＋有助于提高SSPA的PPL抑制活性（圖1C），而Ca2＋的加入對(duì)于SSPA的PPL抑制活性無顯著影響（P＞0.05），其余幾種離子（Na＋、Mn2＋、Al3＋、Cu2＋）的加入使SSPA的PPL抑制活性有所降低，但影響不顯著（P＞0.05）。

而對(duì)于其他因素如光照和氧氣對(duì)SSPA活性的影響如圖1D所示，在日光燈和紫外燈照射條件下，SSPA的PPL抑制率無顯著變化（P＞0.05），表明該產(chǎn)品在實(shí)際生產(chǎn)中可采用紫外滅菌。Liu Yuanyuan等[30]報(bào)道雄蠶絲多肽的抗氧化活性受光照的影響，高強(qiáng)度射線會(huì)影響多肽結(jié)構(gòu)和生物活性。SSPA的PPL抑制活性在有氧和無氧條件下無顯著差異，說明SSPA在短期貯藏的過程中不會(huì)因暴露于空氣而影響其生物活性。

2.2 SSPA的分離純化

2.2.1 超濾分離SSPA

如表2所示，SSPA及其超濾組分對(duì)PPL的IC50值不同，其中SSPA的IC50值最高（1 198 μg/mL），而經(jīng)過超濾后其抑制效果明顯增強(qiáng)，并且隨著分子質(zhì)量的降低呈現(xiàn)抑制增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中分子質(zhì)量小于3 kDa的組分IC50為309.8 μg/mL，收集該組分并進(jìn)行后續(xù)的分離鑒定。

表2 超濾分離SSPA對(duì)PPL的IC50值Table 2 IC50 values of SSPA and its ultrafiltration fractions

2.2.2 大孔樹脂分離SSPAL

2.2.2.1 不同種樹脂對(duì)SSPAL吸附、解吸特性的影響

4 種樹脂對(duì)SSPAL吸附量和吸附率的影響如圖2A、B所示，二者隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著增加，且最終達(dá)到吸附平衡（3～4 h），其中HPD826吸附效果最佳，其次是XAD16、DA201C、D101。最終達(dá)到吸附平衡時(shí)，其吸附量分別為89.66（HPD826）、71.17（XAD16）、61.82（D101）、54.32 mg/g（DA201C），吸附率分別為60.31%（HPD826）、47.88%（XAD16）、41.58%（D101）、36.54%（DA201C）。

圖2 不同樹脂對(duì)SSPAL吸附和解吸特性的影響Fig.2 Adsorption and desorption capacity of different resins for SSPAL

如圖2C所示，4 種樹脂的解吸率顯著不同，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，4 種樹脂的解吸率較高，HPD826（98.36%）＞D101（95.58%）＞XAD16（87.09%）＞DA201C（79.16%），隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%時(shí)，解吸率無顯著變化，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到80%時(shí)，其解吸率明顯下降，其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)較高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。因此最終選擇體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液進(jìn)行洗脫。以上結(jié)果表明這4 種樹脂的吸附和解吸速率完全不同，需要采用動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)一步計(jì)算并分析樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)。

如圖2D所示，HPD826在0～4 min內(nèi)快速擴(kuò)散，之后從4～150 min緩慢吸附，最終在150～240 min內(nèi)吸附飽和呈現(xiàn)平衡狀態(tài)；其余3 種樹脂同樣保持3 個(gè)階段的吸附，第1階段為表面吸附（0～5 min），第2階段為快速吸附擴(kuò)散階段（5～180 min），最后階段為吸附緩慢最終飽和（180～240 min）。說明4 種樹脂對(duì)SSPAL的吸附不同，且表現(xiàn)多重性質(zhì)。

2.2.2.2 SSPAL的HPD826樹脂分離結(jié)果

樹脂的結(jié)構(gòu)和材料對(duì)于大孔樹脂的吸附和解吸具有顯著影響。HPD826樹脂在整個(gè)吸附過程中效果最佳。HPD826樹脂具有相對(duì)理想的表面積（500～600 cm2），并且可以通過氫鍵與SSPAL中的側(cè)鏈氨基酸相互作用，從而發(fā)揮更好的吸附和解吸能力，這與前人研究[31]一致。如表3所示，經(jīng)HPD826大孔樹脂分離之后，SSPAL的胰脂肪酶抑制率顯著提高，IC50顯著降低。

表3 SSPAL經(jīng)HPD826分離前后對(duì)PPL的IC50Table 3 Decrease in IC50 of SSPAL after purification with resin HPD826

2.3 UPLC-MS/MS鑒定SSPA

利用UPLC-MS/MS對(duì)SSPAL-E組分進(jìn)行檢測(cè)。一級(jí)質(zhì)譜圖中得到多個(gè)母離子，進(jìn)行分析后得到二級(jí)離子碎片的信息（表4）。SSPA中鑒定得到31 種多肽，其中含有2 個(gè)氨基酸的肽段有11 個(gè)，約占35.48%；含有3 個(gè)氨基酸的肽段有15 個(gè)。鑒定得到較多含精氨酸的多肽（19 個(gè)）。以Hippophae rhamnoides為關(guān)鍵詞，在UniProt中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肽段來源于Protein TIC 214，包括NN、VR、LR/IR、DR、TR、FD、EF、FR、PSP、ELR/EIR、EER和NLLHR。另外還有部分肽段來源于Protein Ycf2，包括EDS、QLF、FL(I)R和WRN。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（峰面積）計(jì)算得到分離組分中多肽總量為28.08%，其中VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR的肽含量較高，分別為2.90%、7.40%、1.10%、1.50%、1.40%和1.10%。VR、FR和NLLHR均源于Protein TIC 214，RDR來源于Ribulose bisphosphate carboxylase large chain，APYR來源于30S ribosomal protein S2, chloroplastic，EEAASLR來源于Photosystem I P700 chlorophylla apoprotein A2。使用Peptide Ranker可計(jì)算出多肽的生物活性潛力，SSPA的理論得分范圍為0.036 7～0.997 1，說明其生物活性存在較大差異。據(jù)報(bào)道，預(yù)測(cè)得分超過0.5的多肽被認(rèn)為具有較強(qiáng)的生理活性[32-33]，表4中有20 個(gè)多肽得分大于0.5，可認(rèn)為具有較高生物活性，根據(jù)ToxinPred分析，這20 種多肽均沒有毒性，將對(duì)其進(jìn)行后續(xù)分析。

表4 UPLC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 4 Results of peptide identification by UPLC-MS/MS

2.4 SSPA的活性分析

2.4.1 分子模擬分析SSPA的活性

PepSite2通過P值分析多肽與受體的結(jié)合位點(diǎn)、多肽的反應(yīng)殘基及相互作用的受體殘基，該方法被廣泛應(yīng)用于分析生物活性肽的結(jié)合機(jī)制[34-35]。采用PepSite2對(duì)Peptide Ranker大于0.5的SSPA進(jìn)行初步分析，繼續(xù)篩選出P＜0.05的肽，分別是VR、FR、APYR、EEAASLR、RDR、NLLHR、QLF、ALPMDW、MLA和PSP。

分子對(duì)接被認(rèn)為是探索配體與受體之間結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算輔助。采用Auto-Dock進(jìn)行分子對(duì)接，使用帶有MGL Tools 1.5.6軟件包的AutoDock 4.2程序，對(duì)以上這些肽進(jìn)行對(duì)接分析。結(jié)合質(zhì)譜圖（圖3）中強(qiáng)度評(píng)分最終篩選出多肽序列。除PSP和MLA外，其余8 個(gè)肽的強(qiáng)度均高于500，多肽強(qiáng)度變化為：EEAASLR（16 000）＞FR（8 000）＞NLLHR（5 000）＞APYR（2 000）=ALPMDW（2 000）＞RDR（1 600）＞QLF（1 000）＞VR（600）。分子對(duì)接結(jié)合能順序?yàn)椋篍EAASLR=QLF＞FR=RDR＞VR＞APYR＞ALPMDW＞NLLHR，結(jié)合能越小說明抑制能力越強(qiáng)（表5）。據(jù)報(bào)道，含有精氨酸殘基的多肽在3T3-L1、HepG2細(xì)胞和小鼠體內(nèi)均有抗肥胖作用[36-37]。結(jié)合以上分析結(jié)果及多肽含量，選擇VR（2.90%）、FR（7.40%）、RDR（1.10%）、APYR（1.50%）、NLLHR（1.40%）和EEAASLR（1.10%）進(jìn)行合成分析。

圖3 分離肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of the peptides

表5 分子對(duì)接結(jié)果Table 5 Results of molecular docking

2.4.2 SSPA與PPL結(jié)合位點(diǎn)分析

分子對(duì)接結(jié)果表明多肽與PPL之間至少有一種相互作用，這些相互作用（親水作用、氫鍵、疏水作用、π-π相互作用/堆疊作用和范德華力）可以穩(wěn)定肽-PPL復(fù)合物，并影響或改變PPL構(gòu)象（圖4）。氫鍵是抑制PPL的主要因素，以上肽段均提供了Arg（R）殘基，精氨酸包含一個(gè)α-氨基、α-羧基和一個(gè)側(cè)鏈胍基，因此能夠通過氫鍵與帶電殘基相互作用，并通過其亞甲基與疏水殘基相互作用。VR通過離子鍵（Asp 80）、氫鍵（Ser 153、Phe 78）、π-π共軛（Phe 216、Tyr 115）和疏水相互作用（Phe 216、Tyr 115）與PPL結(jié)合。FR主要通過氫鍵和π-π堆疊與PPL結(jié)合，其中氫鍵作用主要表現(xiàn)為NH：Phe 78（2.58 ?）、Arg 257（2.42 ?）；OH：Gly 77（3.03 ?）、His 152（2.62 ?）。π-π堆疊主要表現(xiàn)為Phe的苯環(huán)與PPL中的Tyr 115、Phe 216和Pro 181殘基的相互作用。RDR主要通過氫鍵與PPL結(jié)合，PPL中的His 152、Gly 77和Arg 257與RDR中的氧原子結(jié)合，形成OH鍵。另外PPL中的Phe 78和His 264通過CH鍵與RDR結(jié)合。PPL中的Phe 78與APYR中的R基團(tuán)上的N原子形成氫鍵，而APYR中的Tyr上的苯環(huán)與PPL中Phe 216和Phe 78中的苯環(huán)形成π-π相互作用。NLLHR與PPL的結(jié)合位點(diǎn)較多，主要表現(xiàn)為與PPL上的Phe 78（2.58 ?）、Arg 257（2.42 ?）、His 152（2.62 ?）形成氫鍵，此外NLLHR與PPL上的ALA 179、Pro 181、Phe 216 和Ile 79通過烷基或π-烷基作用結(jié)合。EEAASLR與PPL中的Arg 257和Phe 78形成氫鍵，與Phe216形成π-π相互作用。

圖4 SSPA與PPL相互作用分析Fig.4 Analysis of interaction between SSP and PPL

2.4.3 SSPA活性驗(yàn)證

如表6 所示，P P L 抑制效果最好的是N L L H R（220.70 μg/mL），其次是FR（243.07 μg/mL）、RDR（250.50 μg/mL）、VR（371.07 μg/mL）、APYR（350.41 μg/mL）和EEAASLR（510.55 μg/mL）。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，分子對(duì)接結(jié)合能大小與SSPA胰脂肪酶抑制率強(qiáng)弱之間存在正相關(guān)（r=0.865，P＜0.05）。但是該結(jié)果與分離前相比，部分肽的活性反而低于分離前的混合物，表明混合物中可能含有其他影響PPL活性的物質(zhì)。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果可知，F(xiàn)R、RDR和NLLHR與PPL之間具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)揮相應(yīng)的功能活性。Stefanucci等[6]采用化學(xué)合成含精氨酸的堿性多肽（FRN、WRN、NRN、KRM），發(fā)現(xiàn)以上多肽可與胰脂肪酶活性位點(diǎn)相結(jié)合，發(fā)揮抑制活性，與本文研究結(jié)果相近，其共同點(diǎn)為肽段中含有精氨酸基團(tuán)，精氨酸含有一個(gè)α-氨基、一個(gè)α-羧酸基和一個(gè)含胍基的側(cè)鏈，能夠通過氫鍵與兩個(gè)帶電殘基相互作用，通過亞甲基疏水與疏水殘基相互作用。

表6 合成肽的PPL抑制率Table 6 PPL inhibition rates of the synthesized peptides

3 結(jié) 論

研究影響SSPA活性穩(wěn)定性的因素，采用系列分離步驟逐步純化SSPA，在此基礎(chǔ)上采用UPLC-MS/MS鑒定活性肽的氨基酸序列，篩選高活性肽段，結(jié)合分子對(duì)接手段分析抑制作用位點(diǎn)，具體結(jié)果如下：SSPA具有熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，適量Na＋和Mg2＋可顯著提高SSPA的PPL抑制活性，SSPA在短期貯藏過程中不會(huì)因暴露于空氣而影響PPL抑制活性。超濾分離結(jié)果表明分子質(zhì)量小于3 kDa的組分PPL抑制效果最好；在4 種大孔樹脂中，HPD826效果最佳，其吸附量、吸附率和解吸率分別可以達(dá)到89.66 mg/g、60.31%和98.36%。UPLCMS/MS鑒定結(jié)合分子對(duì)接篩選得到6 個(gè)肽，IC50值分別為NLLHR（220.70 μg/mL）、FR（243.07 μg/mL）、RDR（250.50 μg/mL）、VR（371.07 μg/mL）、APYR（350.41 μg/mL）和EEAASLR（510.55 μg/mL）。以上6 個(gè)多肽通過氫鍵、π-π堆積與PPL結(jié)合。Pearson相關(guān)性分析表明，分子對(duì)接結(jié)合能高低與SSPA的PPL抑制率強(qiáng)弱之間存在正相關(guān)（R2=0.865，P＜0.05）。