田浩杰，李豆南,2,*，邱樹毅，周劍麗，龍則河，王珂佳,4，劉茂強(qiáng)，陳 杰，程 度，潘鳳爽

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；3.貴州省仁懷市天邦釀酒有限公司，貴州 仁懷 564500；4.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工系，貴州 貴陽 550025）

“曲乃酒之骨”，醬香型高溫大曲在發(fā)酵條件下富集了豐富的功能微生物，在生產(chǎn)過程中為整個(gè)醬酒釀造體系提供了微生物、酶系、風(fēng)味及其前體物[1-3]。其獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)醬香型白酒的酒體風(fēng)味形成有重要影響。研究表明，細(xì)菌類群在醬香大曲中具有舉足輕重的作用[4]，諸如厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為醬香大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群[5-6]，其中，芽孢桿菌已經(jīng)被證實(shí)與醬香風(fēng)味產(chǎn)生密切相關(guān)，是乙酸乙酯、異戊醇、糠醇及吡嗪類物質(zhì)等的重要來源[7-9]。

高溫放線菌是一類革蘭氏陽性、化能異養(yǎng)的微生物類群，能夠在極端環(huán)境下生存和繁殖[10]，能代謝產(chǎn)生酯化酶、淀粉酶、磷酸酶等多種酶和風(fēng)味及其前體物[8]。該菌在醬香型白酒釀造體系中屬于一類具有重要應(yīng)用潛力的微生物資源，其在白酒釀造體系中的功能尚不清楚，有待進(jìn)一步研究確定。近年來，隨著微生物多樣性分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明高溫放線菌為高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群[6,11-12]，這也說明高溫放線菌在醬香型白酒釀造體系中具有重要的潛在功能。

隨著可培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，針對(duì)釀造體系內(nèi)高溫放線菌未培養(yǎng)菌種資源的開發(fā)也逐步開展。王芙蓉[13]和白成松[14]等分別從醬香大曲和酒糟中分離鑒定了高溫放線菌，并對(duì)其功能特性進(jìn)行了初步研究，證實(shí)其與淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)的降解存在關(guān)聯(lián)。本課題組在前期研究中也成功建立了一種從醬香大曲中分離、篩選高溫放線菌的方法，從醬香型大曲中分離鑒定了多株高溫放線菌，證實(shí)這些菌株具有良好的產(chǎn)吡嗪風(fēng)味組分能力，并對(duì)其代謝產(chǎn)吡嗪的途徑及機(jī)理進(jìn)行解析[15-16]。這些工作的開展有助于發(fā)掘醬香大曲中高溫放線菌的功能和應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)高溫放線菌功能特性的確定與挖掘奠定了基礎(chǔ)。

基于課題組前期的工作，本研究對(duì)醬香型高溫大曲中的高溫放線菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)合多相分類學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌株鑒定，并利用第二代Illumina和第三代PacBio結(jié)合的測(cè)序技術(shù)對(duì)所篩選菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，從基因組層面解析其潛在的代謝功能特性，分析該菌株代謝典型風(fēng)味組分的潛在機(jī)理，旨在為今后繼續(xù)深入解析高溫放線菌類群微生物產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)，特別是四甲基吡嗪的生物合成代謝途徑及機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香大曲來源于貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某釀酒企業(yè)。為保證樣品的代表性，所有樣品均在白酒釀造車間取粉碎后待投料的陳曲粉，并于曲堆中隨機(jī)取20 個(gè)樣品混勻包裝，保存于4 ℃冰箱備用。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)Biomiga公司；制霉菌素、新生霉素、瓊脂糖、Tris、EDTA-2Na北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海派森諾生物科技有限公司；D4030A dNTP、DRR20AM LATaqTM聚合酶 寶生物工程（大連）有限公司；061180瓊脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

分離篩選培養(yǎng)基[17]：葡萄糖1 g、蛋白胨0.5 g、胰蛋白胨0.3 g、氯化鈉0.5 g、復(fù)合維生素2.75 mg（包括VB1、VB2、VB3、VB5、VB6各0.5 mg，VB70.25 mg）、瓊脂 20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

ISP2培養(yǎng)基（用于菌株純化、保藏）：酵母膏4 g、麥芽汁10.0 g、葡萄糖4.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、小麥浸出物20 mL、氯化鈉5 g、磷酸氫二鉀4 g、磷酸二氫鉀2 g、七水硫酸鎂0.5 g、蛋白胨4 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；核酸凝膠電泳儀、凝膠成像儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；旋渦振蕩器 江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；超凈工作臺(tái) 江蘇凈化設(shè)備有限公司；Illumina NovaSeq 5000測(cè)序平臺(tái)、Pacbio Sequel第三代單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 高溫放線菌的分離篩選

參考李豆南等[15]的方法對(duì)醬香型高溫大曲中的高溫放線菌進(jìn)行分離篩選。

1.3.2 菌種鑒定

1.3.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察鑒定

將分離到的菌株接種于ISP2固體培養(yǎng)基上，于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d后分別從菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲、氣生菌絲顏色及可溶性色素產(chǎn)生情況等方面觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)經(jīng)菌株插片培養(yǎng)后，制片于掃描電子顯微鏡下觀察其菌絲體及孢子結(jié)構(gòu)特征，并根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》完成菌株形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2.2 菌株溫敏性分析

將菌株分別置于30、37、45、50、55、60 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

1.3.2.3 菌株生理生化鑒定

分別設(shè)計(jì)明膠液化、碳源利用、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原和纖維素降解等生理生化實(shí)驗(yàn)，觀察菌株的生理特性。

1.3.2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

參考李豆南等[15]方法對(duì)分離篩選出的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.3.3 菌株全基因組測(cè)序及序列分析

1.3.3.1 菌株基因組DNA提取及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

菌株FBKL4.014接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，45 ℃培養(yǎng)24 h后，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說明書，并對(duì)抽提的樣品進(jìn)行檢測(cè)。使用紫外分光光度計(jì)，分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定DNA的吸光度，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。

1.3.3.2 全基因組測(cè)序完成圖、組裝及數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

菌株FBKL4.014的全基因組測(cè)序委托上海派森諾生物科技有限公司完成，提取的基因組經(jīng)質(zhì)檢合格達(dá)到測(cè)序要求后，利用第二代Illumina NovaSeq和第三代PacBio Sequel結(jié)合的測(cè)序技術(shù)進(jìn)行完成圖測(cè)序。制備好的二代測(cè)序文庫(kù)在Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序（2×150 bp），測(cè)序深度433×，三代測(cè)序文庫(kù)在PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行單分子測(cè)序。Illumina NovaSeq測(cè)序原始數(shù)據(jù)以雙端（Paired-end）FASTQ格式保存，并對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)過濾，采用Adapter Removal去除3’端接頭污染，采用SOAPec基于Kmer頻率對(duì)所有原始reads進(jìn)行質(zhì)量校正。利用HGAP和Canu軟件對(duì)PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，并用二代的高質(zhì)量數(shù)據(jù)通過pilon軟件對(duì)三代contig結(jié)果進(jìn)行校正，最終拼接得到完整序列。

1.3.3.3 基因預(yù)測(cè)及功能注釋分析

利用Glimmer 3.02對(duì)基因組中的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)[18]。分別使用TRNAscan-SE[19]、Barrnap[20]、Rfam[21]等軟件進(jìn)行tRNA、rRNA和ncRNA預(yù)測(cè)。成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）通過CRISPR識(shí)別工具進(jìn)行鑒定[22]?；蚬δ茏⑨屚ㄟ^BLAST將菌株預(yù)測(cè)的基因序列結(jié)果分別與非冗余（Non-Redundant，NR）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[23]、基因本體論[24]（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書[25]（Kyoto Encycolpedia of Gene and Genomes，KEGG）、直系同源聚類群[26]（Cluster of Orthologous Groups，COG）、歐洲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot[27]、碳水化合物活性酶[28]（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZy）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到相應(yīng)的基因功能注釋結(jié)果，采用CGView（http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/）繪制基因組圈圖。通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑進(jìn)行挖掘。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選及鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

從醬香高溫大曲中分離得到1 株純種菌株FBKL4.014，根據(jù)菌落形態(tài)特征初步判斷其可能歸屬于高溫放線菌，并保藏于貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

菌株宏觀形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示（圖1A），該菌株長(zhǎng)勢(shì)良好，在培養(yǎng)基正反兩面表現(xiàn)出的生長(zhǎng)趨勢(shì)不同，菌落總體呈缺刻圓狀、突起、有較多皺褶、質(zhì)地干燥致密，基內(nèi)菌絲呈淺黃色，氣生菌絲呈乳白色且較為發(fā)達(dá)，無可溶性色素產(chǎn)生，該菌株的菌落形態(tài)具有高溫放線菌培養(yǎng)的典型特征。高溫放線菌FBKL4.014的微觀形態(tài)特征如圖1B所示，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[29]分析，發(fā)現(xiàn)其菌絲體較短，形狀不一且黏在一起呈簇狀，呈圓球形的分生孢子直接著生于菌絲體上，分布于菌絲體兩側(cè)，其中有分支的孢子梗長(zhǎng)度較短。

2.1.2 菌株的最適生長(zhǎng)溫度

表1結(jié)果表明，菌株FBKL4.014在45～50 ℃條件下生長(zhǎng)最旺盛，在55～60 ℃高溫范圍內(nèi)仍能夠緩慢生長(zhǎng)，37 ℃時(shí)該菌株能正常生長(zhǎng)，但在30 ℃時(shí)不生長(zhǎng)。Wang Xueshan等[30]和顏林春[31]的研究表明高溫放線菌屬大多可以生長(zhǎng)在最高溫度可達(dá)60～65 ℃的高溫發(fā)酵環(huán)境中，因此，菌株FBKL4.014在耐熱性方面與高溫放線菌具有很高的相似度，而這也與其分離環(huán)境——醬香大曲的高溫發(fā)酵環(huán)境密切相關(guān)。

2.1.3 菌株的生理生化特征

生理生化分析（表2）表明，高溫放線菌FBKL4.014為革蘭氏陽性菌，該菌株可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并能使牛奶凝固但不胨化，使明膠產(chǎn)生液化現(xiàn)象，同時(shí)該菌株能水解淀粉和纖維素，由此推測(cè)該菌株能夠代謝產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，具備將大分子原料降解為可發(fā)酵性糖的潛能，有助于推動(dòng)整個(gè)釀造過程的順利進(jìn)行。碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株能夠有效利用葡萄糖、海藻糖、D-棉子糖、D-甘露醇和D-山梨醇等碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，對(duì)麥芽糖表現(xiàn)出弱利用特征，不能利用乳糖和肌醇兩種碳源。此外，該菌株能夠利用硫酸銨和磷酸氫二銨兩種無機(jī)氮源和酪氨酸，對(duì)尿素表現(xiàn)出弱利用性，不能利用脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和甘氨酸。

表2 菌株FBKL4.014的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain FBKL4.014

2.1.4 菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

高溫放線菌FBKL4.014基因組DNA片段長(zhǎng)度約23 kb，經(jīng)PCR擴(kuò)增、拼接后的16S rDNA序列有效片段長(zhǎng)度約為900 bp，與GenBank、EzTaxon等數(shù)據(jù)庫(kù)中相似菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在種分類學(xué)水平搜索序列相似性，結(jié)果顯示菌株FBKL4.014與萊斯氏屬下糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）序列相似性最高；通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），發(fā)現(xiàn)高溫放線菌FBKL4.014與L.sacchariJF819833聚類在同一個(gè)分支上，其序列同源性為99.78%，因此判斷該菌株在種水平上極有可能為L(zhǎng).sacchari。

圖2 菌株FBKL4.014基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain FBKL4.014

2.2 L. sacchari FBKL4.014全基因組結(jié)果與分析

2.2.1 菌株FBKL4.014基因組的一般特征

L.sacchariFBKL4.014基因組信息已上傳NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為CP103866.1。對(duì)Illumina NovaSeq和PacBio Sequel下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合拼裝，得到完整的基因組序列。L.sacchariFBKL4.014基因組序列全長(zhǎng)3.35 Mb，GC含量為48.67%，共預(yù)測(cè)到3 328 個(gè)蛋白編碼基因，包括97 個(gè)tRNA、31 個(gè)rRNA（10 個(gè)5S rRNA、11 個(gè)16S rRNA、10 個(gè)23S rRNA）和36 個(gè)ncRNA編碼基因，預(yù)測(cè)到11 條CRISPRs結(jié)構(gòu)，測(cè)序深度為433×（表3）。利用CGView軟件繪制了FBKL4.014基因組圈圖（圖3）。此外，通過NCBI平臺(tái)查閱到其他糖萊西氏菌的GC含量大多在47%～49%之間，與本研究菌株所測(cè)得的GC含量（48.67%）接近，進(jìn)一步證實(shí)該菌符合高溫放線菌菌屬GC含量低的特征。

圖3 菌株FBKL4.014基因組圈圖Fig.3 Circos plot of the genome of strain FBKL4.014

2.2.2 菌株FBKL4.014基因組功能注釋結(jié)果分析

利用BLAST在線比對(duì)分析工具將FBKL4.014的測(cè)序結(jié)果分別與NR、直系同源蛋白分組比對(duì)（evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）、KEGG、Swiss-Prot、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲取注釋到的蛋白編碼基因數(shù)量分別為3 325、2 580、1 649、2 301、2 150 個(gè)和2 497 個(gè)；其中，在TCDB和PHI數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的基因數(shù)較少，分別為474 個(gè)和553 個(gè)。此外，在CAZy和CARD數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到72 條和56 條基因信息。FBKL4.014基因組功能注釋總體情況如圖4所示。

圖4 菌株FBKL4.014基因組功能注釋總體結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.4 Overall statistics of gene function annotation of strain FBKL4.014

2.2.2.1 NR數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋分析

FBKL4.014共有3 225 個(gè)蛋白編碼基因在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，占總預(yù)測(cè)編碼蛋白基因總數(shù)的96.91%，其中注釋到與L.sacchari同源的基因數(shù)量最多，共2 614 個(gè)，占全部注釋結(jié)果的81.5%，這表明FBKL4.014在基因組的結(jié)構(gòu)、同源性上與L.sacchari高度相似，也與前述16S rRNA基因分類鑒定結(jié)果一致。

2.2.2.2 eggNOG（COG）數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋分析

eggNOG（COG）數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析結(jié)果顯示（ 圖5 ） ， 在 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 的 所 有2 5 個(gè) 功 能 分 類中，F(xiàn)BKL4.014共有19 類2 580 個(gè)基因得到了注釋，占注釋基因總數(shù)的77.52%。其中具有潛在生物學(xué)功能的基因注釋結(jié)果最為豐富，共721 個(gè)，占注釋基因總數(shù)的27.95%，這也為今后針對(duì)高溫放線菌未知基因組信息的進(jìn)一步挖掘提供可能。其次，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝存在215 個(gè)注釋結(jié)果，占注釋基因總數(shù)8.33%；有研究表明醬香大曲中氨基酸代謝的活躍程度總體較高[2]，釀酒原料中含有豐富的蛋白質(zhì)，微生物通過氨基酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑分解原料中的蛋白質(zhì)，不僅可以為微生物生長(zhǎng)提供必須的能量物質(zhì)，也可以為酒體提供風(fēng)味及其前體物。結(jié)合課題組前期的工作，這一研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)也說明在發(fā)酵體系中菌株FBKL4.014可能與醬香型白酒中含氮化合物的形成密切相關(guān)。

圖5 FBKL4.014基因組eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析結(jié)果Fig.5 Results of alignment of FBKL4.014 genome with eggNOG database

2.2.2.3 GO數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果表明（圖6），菌株基因組共有2 150 個(gè)蛋白編碼基因得到注釋，占注釋基因總數(shù)的64.60%。在GO數(shù)據(jù)庫(kù)生物過程、細(xì)胞組成、分子功能三大功能分類數(shù)據(jù)庫(kù)中，生物過程、細(xì)胞氮化合物代謝過程、生物合成過程和小分子代謝過程這4 個(gè)途徑富集的基因數(shù)量最多，分別富集到2 030、789、753 個(gè)和579 個(gè)基因。有研究表明，在醬香型白酒高溫釀造體系下，隨著發(fā)酵溫度升高，大曲中微生物豐度隨之降低[5]，因此以菌株FBKL4.014為代表的一類嗜熱菌的正常生物合成和代謝活動(dòng)對(duì)推動(dòng)醬香型白酒整體釀造進(jìn)程意義重大，尤其是細(xì)胞氮復(fù)合代謝過程富集到較多的基因，也與前期該菌株能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽以及利用硫酸銨和磷酸氫二銨等無機(jī)氮源的研究結(jié)果高度相關(guān)，初步揭示該菌株具有將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為如游離氨等某些含氮風(fēng)味物質(zhì)前體物的潛力。碳水化合物代謝過程和分解代謝過程也分別富集了113 個(gè)和272 個(gè)基因，表明該菌株可能參與到釀酒原料中淀粉、纖維素及其他有機(jī)大分子物質(zhì)的分解代謝過程，是酒體中風(fēng)味及其前體物的潛在來源。此外，細(xì)胞、細(xì)胞組成、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)4 個(gè)途徑分別富集到686、523、510 個(gè)和396 個(gè)基因；分子功能、離子結(jié)合和DNA結(jié)合3 個(gè)途徑也分別富集到1968、690 個(gè)和336 個(gè)基因。

圖6 FBKL4.014基因組的GO功能分類圖Fig.6 GO function classification map of FBKL4.014 genome

2.2.2.4 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中FBKL4.014共有1 649 個(gè)蛋白編碼基因注釋到8 個(gè)層級(jí)的205 條通路中，占基因總數(shù)的49.55%，結(jié)果如圖7所示。分析結(jié)果表明代謝途徑富集到的基因數(shù)量最多，共1 085 個(gè)，其中有19 個(gè)較為完整的代謝途徑（圖8），總體上表現(xiàn)出氨基酸代謝活動(dòng)較為活躍的結(jié)果。

圖7 菌株FBKL4.014的KEGG功能分類圖Fig.7 KEGG function classification map of strain FBKL4.014

圖8 菌株FBKL4.014較完整的代謝途徑Fig.8 Complete metabolism pathways in strain FBKL4.014

進(jìn)一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)氨基酸代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)菌株具備丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、色氨酸和蘇氨酸等19 種氨基酸代謝途徑。對(duì)氨基酸代謝通路的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和天冬酰胺可由糖類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化而成，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸既可以由糖類物質(zhì)生物合成，也可以由前述的6 種氨基酸通過生物轉(zhuǎn)化合成。從FBKL4.014注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)、亮氨酸、精氨酸、賴氨酸和酪氨酸只能通過相應(yīng)氨基酸生物轉(zhuǎn)化而不能由糖類物質(zhì)合成，這與張巧玲等[32]的研究結(jié)果一致。氨基酸代謝在白酒釀造體系中極為重要，主要表現(xiàn)在3 個(gè)方面：一方面氨基酸是醬香型白酒中風(fēng)味前體物的重要來源，可代謝產(chǎn)生相應(yīng)的醇類物質(zhì)作為酒體中酸類和酯類物質(zhì)形成的重要前體，如亮氨酸代謝生成異戊醇、異亮氨酸代謝產(chǎn)生活性戊醇、酪氨酸代謝產(chǎn)生酪醇、纈氨酸代謝產(chǎn)生異丁醇、苯丙氨酸代謝產(chǎn)生2-苯乙醇等。另一方面氨基酸本身就是醬香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)的直接來源，通過代謝產(chǎn)生內(nèi)酯、大馬士酮和香葉基內(nèi)酮等風(fēng)味物質(zhì)。第三氨基酸與還原糖在高溫條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)生成呋喃類衍生物、吡咯類衍生物和醛酮及吡嗪類衍生物[33]。因此，菌株FBKL4.014 KEGG注釋分析結(jié)果也初步表明其在醬酒釀造體系中可能與一些含氮風(fēng)味組分的產(chǎn)生密切關(guān)聯(lián)。

2.2.2.5 CAZy分析

醬香型白酒釀造體系中，釀酒原料主要以高粱為主，原料中含有豐富的淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)，在微生物代謝產(chǎn)生的碳水化合物活性酶的作用下被分解為許多小分子化合物，為微生物生長(zhǎng)提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是酒體中風(fēng)味物質(zhì)的重要來源[33-34]。測(cè)序結(jié)果分析表明，F(xiàn)BKL4.014基因組中共有72 個(gè)基因注釋到CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中包含碳水化合物結(jié)合域酶（carbohydrate-binding modules，CBMs）9 個(gè)，CBM家族包括CBM16、CBM32、CBM39、CBM50和CBM61；碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）17 個(gè)，CE家族包括CE1、CE3、CE4、CE8、CE9、CE10和CE14；糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases，GTs）13 個(gè)，GT家族包括GT1、GT2、GT4、GT28和GT51；輔助活性酶（auxiliary activities，AAs）7 個(gè)，AA家族包括AA1_3、AA3、AA4、AA6和AA10；其中，糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）最多，有25 個(gè)，GH家族則包括GH3、GH4、GH13_1、GH13_29、GH13_31、GH15、GH18、GH23、GH25、GH33、GH46、GH64、G H 1 0 9、G H 1 2 3、G H 1 2 9；最少的是多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs），僅注釋到PL22_1中的1 個(gè)基因。CAZy 注釋分析結(jié)果見表4。

表4 FBKL4.014基因的CAZy分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of CAZy analysis of FBKL4.014 genes

FBKL4.014基因組中GH15家族的葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）是水解淀粉的主要酶，在白酒釀造中可將原料中的淀粉水解為葡萄糖，一方面葡萄糖為酵母菌、細(xì)菌等微生物生長(zhǎng)代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，推動(dòng)發(fā)酵過程的進(jìn)行；另一方面葡萄糖經(jīng)糖酵解、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝等途徑產(chǎn)生氨基酸、有機(jī)酸等酒體風(fēng)味及風(fēng)味前體物[35]。此外，GH3家族的β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是纖維素降解的關(guān)鍵酶，通過水解纖維素非還原末端β-D-糖苷鍵形成葡萄糖[36]。這也進(jìn)一步證實(shí)了前期菌株生理生化特征有關(guān)菌株能產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的推測(cè)?？傊?，從CAZy分析角度對(duì)菌株FBKL4.014降解淀粉、纖維素等碳水化合物能力的明確，再次表明高溫放線菌類群在推動(dòng)醬香型白酒釀造順利進(jìn)行的過程中具有一定的潛在作用。

2.2.2.6 FBKL4.014四甲基吡嗪合成相關(guān)基因分析

白酒釀造體系中的四甲基吡嗪可通過微生物代謝產(chǎn)生，乙偶姻和游離氨是其關(guān)鍵前體物[44]。因此四甲基吡嗪的代謝可分為兩部分：1）吡嗪半環(huán)碳骨架化合物的合成；2）吡嗪含氮基團(tuán)結(jié)構(gòu)的形成。如圖9所示，一方面，釀酒原料中的糖類物質(zhì)在微生物作用下，經(jīng)糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸通過乙酰乳酸合酶（EC 2.2.1.6）轉(zhuǎn)化為α-乙酰乳酸，隨后通過乙酰乳酸脫羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）脫羧轉(zhuǎn)化為乙偶姻（半環(huán)碳骨架化合物）；另一方面，蛋白質(zhì)被蛋白酶水解成游離氨基酸，經(jīng)氨基酸代謝進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為游離態(tài)氨（含氮基團(tuán)）；半環(huán)碳骨架化合物和含氮基團(tuán)通過非酶促反應(yīng)生成四甲基吡嗪[45-46]。

圖9 四甲基吡嗪生物合成途徑Fig.9 Biosynthesis pathways of tetramethyl pyrazine

乙偶姻的生物合成途徑包含一系列復(fù)雜的生物過程[47]，F(xiàn)BKL4.014基因組中所注釋到的葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）可分別將淀粉和纖維素降解為單糖，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸，在乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）作用下合成乙酰乳酸，再經(jīng)ALDC或2,3-丁二醇脫氫酶（2,3-butanediol dehydrogenase，BDH）脫羧/脫氫合成乙偶姻[48]。不過基因組中沒有發(fā)現(xiàn)ALDC和BDH蛋白編碼基因，因此，推測(cè)該菌株這些蛋白編碼基因發(fā)生了變異，亦或該菌株可能存在尚未被發(fā)現(xiàn)的四甲基吡嗪生物合成的完整途徑。

四甲基吡嗪生物合成的另一個(gè)關(guān)鍵前體物質(zhì)為游離氨，KEGG注釋分析表明，F(xiàn)BKL4.014氨基酸代謝活動(dòng)比較活躍，基因組中含有蛋白酶、肽酶及羧肽酶編碼基因，具備有效將原料中的蛋白質(zhì)和多肽水解成游離氨基酸的能力，同時(shí)，丙氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.1）、谷氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.2）、亮氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.9）和脯氨酸脫氫酶（EC 1.5.5.2）等氨基酸脫氫酶注釋結(jié)果也說明菌株可能具備將游離氨基酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為游離態(tài)氨的能力。吳建峰[49]研究表明，固態(tài)發(fā)酵體系中氨濃度增加可提高四甲基吡嗪的含量，微生物產(chǎn)生的蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，再經(jīng)谷氨酸脫氫酶等氨基酸脫氫酶進(jìn)行聯(lián)合脫氨作用產(chǎn)生氨。綜上所述，結(jié)合本課題組前期的工作，認(rèn)為FBKL4.014具備生物合成四甲基吡嗪的潛力。

3 結(jié) 論

從醬香型高溫大曲中篩選到1 株高溫放線菌FBKL4.014，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定，確定其可能為高溫放線菌科、萊斯氏菌屬下的L.sacchari。同時(shí)，利用第2代和第3代結(jié)合的測(cè)序技術(shù)完成L.sacchariFBKL4.014基因組測(cè)序工作，測(cè)序結(jié)果表明，L.sacchariFBKL4.014染色體基因組序列全長(zhǎng)3.35 Mb，GC含量48.67%，測(cè)序深度433×，共預(yù)測(cè)到3 328 個(gè)蛋白編碼基因，為后續(xù)進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行功能性研究提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)希望為醬香型白酒釀造體系中其他未培養(yǎng)微生物篩選方法提供參考。

通過全基因組測(cè)序及基因組解析，發(fā)現(xiàn)了L.sacchariFBKL4.014基因組上葡萄糖淀粉酶（EC 3.2.1.3）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）等碳水化合物活性酶編碼基因的存在，證實(shí)其可能為該菌株參與釀酒原料中碳水化合物分解代謝的關(guān)鍵證據(jù)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析結(jié)果進(jìn)一步顯示該菌株基因組中有較完整的氨基酸代謝途徑，說明該菌株氨基酸代謝活動(dòng)也可能非常活躍；醬香型白酒中含氮化合物高是其典型的風(fēng)格特征，其中，細(xì)胞氮復(fù)合代謝過程可能是該菌株將環(huán)境中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為某些風(fēng)味前體物的關(guān)鍵途徑，無疑表明菌株FBKL4.014很可能也是醬香型白酒中含氮物質(zhì)的重要微生物來源。此外，該菌株基因組中還存在四甲基吡嗪合成的關(guān)鍵酶編碼基因，同時(shí)針對(duì)ALDC和2,3-BDH尚未在該菌株基因組中被發(fā)現(xiàn)的事實(shí)，推測(cè)該菌株可能存在尚未被發(fā)現(xiàn)的特殊的四甲基吡嗪生物合成完整途徑，也為今后醬香型白酒中風(fēng)味組分在高溫放線菌中的生成機(jī)理研究提供了基因?qū)用娴臄?shù)據(jù)支持。本研究有助于發(fā)掘醬香大曲中高溫放線菌的功能應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)高溫放線菌功能特性的確定與資源挖掘奠定了基礎(chǔ)。