楊婷婷，任李順，陳光未，黃艾祥*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

植物甾醇（phytosterols，PS）是一類天然存在的甾體類化合物，其結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，主要功能是降膽固醇、降心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[1]，但人們只能通過植物性食物攝取。研究表明，攝入2～3 g PS可使血清總膽固醇和低密度脂蛋白降低[2]。而PS在水中難以溶解的特性，腸道吸收率極低，也使得其在食品中的應(yīng)用大大受限制[3]。在前期研究中，只能將PS添加在油脂含量較高的食物當(dāng)中（如黃油、奶油等），通過食用這些高脂食品來獲取更多的甾醇，以降低體內(nèi)的血脂水平。但隨著研究的發(fā)現(xiàn)，以高脂食品作為基體的PS進(jìn)入人體后，將導(dǎo)致人體內(nèi)的吸收和利用程度會(huì)有所降低，從而影響了其降膽固醇作用[2,4]。由于高親脂性PS導(dǎo)致攝入吸收性差且存在健康問題，使應(yīng)用在功能性食品配方上有限。因此，開發(fā)水溶性PS并拓寬其在食品加工中的應(yīng)用成為了當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Meng Xianghe等[5]報(bào)道了環(huán)糊精-PS復(fù)合物的形成可以提高PS水溶性和生物利用率。周士嬌等[6]制備了乳清分離蛋白-PS納米顆粒，具有良好的水溶性和穩(wěn)定性。為了改善以上問題，可通過將溶解性較差的物質(zhì)封裝在載體中，如納米顆粒、微膠囊、水凝膠、乳液[7]。

利用玉米醇溶蛋白（Zein）為載體制備負(fù)載PS的納米顆粒，以提高PS的水溶性、穩(wěn)定性及生物活性具有重要意義。Zein是玉米中的主要儲(chǔ)存蛋白，具有生物降解性、生物相容性、耐高溫性及良好的成膜性，是一種普遍被認(rèn)為安全的食品級(jí)蛋白質(zhì)[8]。Zein是一種天然的疏水蛋白，具有大量的疏水氨基酸殘基，因此可溶于乙醇水溶液而不溶于水[9]。以Zein為載體不僅能夠通過包埋植物香精、功能油脂而提高功能性成分的穩(wěn)定性，而且能夠起到增加溶解性和緩釋等方面的作用。因此，Zein可以與活性物質(zhì)通過自組裝形成納米復(fù)合物并改善穩(wěn)定性、包埋率、生物活性。有研究表明，Xie Hujun等[10]采用抗溶劑共沉淀法制備了Zein-卵磷脂-EGCG納米顆粒在穩(wěn)定性和胃腸緩釋性方面顯著提高。Chen Shuai等[11]以疏水蛋白Zein為核心，親水性陰離子卡拉膠為殼，制備了核殼型生物聚合物納米顆粒，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和胃腸道消化性。此外，將Zein-殼聚糖納米顆粒包埋槲皮素，可提高其對(duì)胃腸道消化酶的抗性、生物相容性、穩(wěn)定性。目前，PS對(duì)Zein的穩(wěn)定性和釋放性的研究鮮有報(bào)道，這將有助于解決PS穩(wěn)定性差的問題，還拓寬了PS在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

采用反溶劑法制備了Zein負(fù)載PS納米顆粒，對(duì)納米粒包埋率、性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，并考察了納米粒的水溶解度、復(fù)溶特性、貯藏穩(wěn)定性及胃腸道模擬消化，以期為提高Zein-PS納米粒在胃腸消化吸收中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Zein（純度≥99.5%） 上海屹鋒生物科技有限公司；PS（純度≥95%，大豆中提取） 上海益康食品有限公司；豆甾醇（純度≥95%） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、濃磷酸、濃硫酸（分析純） 天津大茂化學(xué)科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本Hitachi公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀賽默飛世爾科技有限公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；Zetasize nanozs 90型粒度電位儀 英國(guó)馬爾文公司；FD5-3冷凍干燥機(jī) 深圳金西蒙公司。

1.3 方法

1.3.1 Zein負(fù)載PS納米顆粒（Zein-PS）的制備

參考駱兆嬌等[12]的方法，并稍作修改。取10 mg PS樣品溶于5 mL無水乙醇，取150 mg玉米蛋白置于燒杯中，加45 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，將二者混合后進(jìn)行超聲處理。將超聲后的分散液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡無水乙醇，加入去離子水使納米液終體積與分散液初始體積一致，并在一定溫度下攪拌水合，得到Zein負(fù)載PS的納米液。

1.3.2 PS標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及含量的測(cè)定

以豆甾醇代替PS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并配制豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用酶標(biāo)儀法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。參照文獻(xiàn)[6]的磷硫鐵法測(cè)定甾醇得率。準(zhǔn)確稱取95%豆甾醇標(biāo)樣5 mg，溶于無水乙醇中，定容至50 mL，豆甾醇質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，按一定比例稀釋分別配制成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)液，貯于棕色瓶中，低溫保存?zhèn)溆?。分別取樣品1 mL，無水乙醇1 mL，加入磷硫鐵顯色劑2 mL，置于10 mL的試管中，搖勻；顯色15 min后于520 nm處測(cè)定其吸光度。豆甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.002 8x＋0.001 9，R2=0.998 9），并測(cè)定樣品PS含量。

1.3.3 包埋率和離心穩(wěn)定性的測(cè)定

參考姚艷玉等[13]的方法測(cè)定PS納米液的包埋率。將納米液稀釋10 倍，取稀釋后的納米液2 mL于10 mL試管中，在3 000 r/min離心3 min，按照上述方法測(cè)定上清液的吸光度。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。根據(jù)已得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算上清液中PS含量，再根據(jù)下式計(jì)算藥物包埋率：

式中：W1為樣品中PS的含量；W為納米乳樣品中PS總含量。

取2 mL乳液于3 000 r/min離心3 min，按照甘凌[14]的方法測(cè)定上清液的吸光度。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。通過下式計(jì)算離心穩(wěn)定常數(shù)K：

式中：A0為樣品離心前的吸光度；A1為樣品離心后上清液的吸光度。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以Zein與PS質(zhì)量比、溫度、時(shí)間為因素，考察單因素對(duì)Zein-PS復(fù)合物包埋率的影響，可得最佳制備工藝。研究Zein與PS質(zhì)量比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1）、水合溫度（45、50、55、60、65 ℃）、水合時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3 h）、超聲時(shí)間（10、15、20、15、30 min）對(duì)納米復(fù)合膜包埋率的影響。測(cè)定單因素時(shí)，其他因素固定為Zein與PS質(zhì)量比15∶1、水合溫度55 ℃、水合時(shí)間2 h、超聲時(shí)間20 min。

1.3.5 正交試驗(yàn)

采用3因素3水平正交試驗(yàn)確定Zein-PS納米復(fù)合物的最佳工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Levels of independent variables used in orthogonal array design

1.3.6 Zein-PS納米粒的特性研究

1.3.6.1 Zein-PS的粒徑和Zeta電位測(cè)定

取納米復(fù)合物溶液并稀釋，于25 ℃室溫下測(cè)定顆粒粒徑、多分散指數(shù)（polydispersion index，PDI）及電位，每個(gè)平行測(cè)定3 次。

1.3.6.2 Zein-PS的濁度和復(fù)溶穩(wěn)定性

測(cè)定參考張娟聰[15]的方法，稍有改動(dòng)。取一定量的凍干粉溶解于去離子水中，振蕩使其完全分散均勻。在520 nm采用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品上清液的吸光度，對(duì)凍干粉的復(fù)溶特性進(jìn)行考察。

1.3.6.3 Zein-PS水溶解度的測(cè)定

參考彭捷[16]方法，并稍有改動(dòng)。將凍干粉溶解于水中，使得樣品達(dá)到過飽和狀態(tài)，37 ℃搖床振蕩24 h后，5 000 r/min離心10 min，取上層清液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其PS含量。

1.3.7 Zein-PS納米粒的結(jié)構(gòu)表征分析

1.3.7.1 Zein-PS的SEM觀察

將Zein-PS納米復(fù)合物凍干粉分散于金屬樣品臺(tái)上，噴金1 h，置于SEM下觀察納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)，在7.00 kV加速電壓下進(jìn)行觀察拍照。

1.3.7.2 Zein-PS的傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）測(cè)定

將凍干的樣品與K B r 均勻混合，壓片。在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)記錄光譜，分辨率為2 cm-1，對(duì)不同樣品的FTIR進(jìn)行分析比較。

1.3.8 Zein-PS納米粒穩(wěn)定性的測(cè)定

1.3.8.1 Zein-PS的緩釋研究

參考Lacatusu等[17]的方法，稍作修改。將0.2 g NaCl，0.32 g胃蛋白酶溶于100 mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 2.0，制備模擬胃液。將0.68 g K2HPO4、0.061 6 g NaOH、1.0 g胰酶溶于100 mL去離子水中，調(diào)至pH 7.0，得到模擬腸液。取10 mL新制備的納米分散液加30 mL模擬胃液，使用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2，37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h，胃消化結(jié)束后，取20 mL胃消化混合物加入20 mL模擬腸液。37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h。每隔30 min收集1 mL消化液，使用離心機(jī)在5 000 r/min離心10 min。采用未包埋的PS作為對(duì)照，按1.3.2節(jié)的方法測(cè)定消化液中PS的釋放率，計(jì)算公式如下：

式中：Wt為PS在消化液中的釋放量/（mg/mL）；W0為初始PS總添加量/（mg/mL）。

1.3.8.2 Zein-PS納米液的貯藏穩(wěn)定性

將制備好的納米液于4 ℃和25 ℃放置30 d后，測(cè)定納米液的粒徑和包埋率變化，測(cè)試方法參考1.3.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行實(shí)驗(yàn)。圖表制作采用OriginPro 8.0和Design-Expert 12.0軟件，使用SPSS 26.0進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析和方差分析，采用P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zein-PS納米顆粒的制備

2.1.1 Zein-PS納米粒的單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 Zein與PS質(zhì)量比對(duì)納米粒性能的影響

由圖1可知，隨著Zein添加量的增加，納米顆粒的包埋率先增大后減小，當(dāng)Zein與PS質(zhì)量比為15∶1時(shí)，包埋率為83.42%。當(dāng)質(zhì)量比超過15∶1時(shí)，包埋率顯著降低，可能是由于過量的Zein在溶液中易聚集，使納米顆粒與反應(yīng)溶劑之間的相互作用減弱[18]。納米顆粒的穩(wěn)定性隨著質(zhì)量比的增加也是先增大而降低，說明隨著Zein的增加，PS負(fù)載在顆粒表面和溶液中，而不是嵌入在蛋白基體中[6]。這與Patel等[19]研究玉米蛋白濃度越高，包埋率先增大后降低的結(jié)果一致。PS不溶于水微溶于油，且界面張力隨Zein的增加而減小，這歸因于表面活性劑在油水界面的吸附。此外，油水界面張力的降低有利于更小粒度液滴的形成，與納米液粒徑變化保持一致。因此，選擇Zein-PS質(zhì)量比為15∶1。

圖1 Zein與PS質(zhì)量比對(duì)納米復(fù)合物性能的影響Fig.1 Effect of zein/PS ratio on properties of nanocomposites

2.1.1.2 水合時(shí)間對(duì)納米顆粒性能的影響

從圖2可見，隨著水合時(shí)間延長(zhǎng)，Zein和PS的結(jié)合程度增加，導(dǎo)致對(duì)PS包埋率顯著升高且K值也升高，Zein和PS充分水合2 h后形成的納米粒對(duì)PS的包埋率達(dá)到最大，為86.66%。且能夠均勻分散在水中形成納米分散體系，當(dāng)水合時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，包埋率也緩慢降低，而離心穩(wěn)定性持續(xù)增加[20]。該結(jié)果與Nagwa等[21]研究結(jié)果一致，適當(dāng)增加水合時(shí)間能有效提高包埋率及離心穩(wěn)定性，但水合時(shí)間過多會(huì)使包埋率下降。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中，Zein和PS之間的界面張力增大，發(fā)生凝聚使穩(wěn)定性降低[22-23]。因此水合時(shí)間2 h時(shí)效果最佳。

圖2 水合時(shí)間對(duì)納米復(fù)合物性能的影響Fig.2 Effect of hydration time on properties of nanocomposites

2.1.1.3 水合溫度對(duì)納米顆粒性能的影響

從圖3可以看出，隨著水合溫度升高Zein-PS納米復(fù)合物的包埋率增大，在45～55 ℃時(shí)增加的趨勢(shì)比較明顯，當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)包封率變化呈下降趨勢(shì)。因?yàn)閆ein在加熱的條件下對(duì)PS能較好地包埋形成納米結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)開始變性容易發(fā)生聚集，使得對(duì)其包埋率下降。隨著溫度升高，納米復(fù)合物的離心穩(wěn)定性也逐漸增加，當(dāng)超過55 ℃后顯著降低。這是由于溫度過高會(huì)使納米粒分子內(nèi)部遭受破壞，進(jìn)而使PS發(fā)生損失。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Tatiana等[24]的結(jié)果一致，經(jīng)過溫度熱處理，納米復(fù)合物可以保持一定的穩(wěn)定性，但有研究表明在熱處理?xiàng)l件下，納米復(fù)合物的粒徑會(huì)增加，離心穩(wěn)定性會(huì)降低[25]。因此55 ℃為最佳條件。

圖3 水合溫度對(duì)納米復(fù)合物性能的影響Fig.3 Effect of hydration temperature on properties of nanocomposites

2.1.1.4 超聲時(shí)間對(duì)納米顆粒性能的影響

超聲時(shí)間可以使Zein-PS納米復(fù)合物的剪切作用減弱，對(duì)提高其性能有重要影響。如圖4所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，納米液的包埋率顯著升高并且K值也隨之升高，當(dāng)超聲時(shí)間超過20 min后，K值和包埋率均顯著降低。增加超聲時(shí)間能降低納米液的粒徑，從而提高離心穩(wěn)定性及包埋率，但進(jìn)一步增加并不能使包埋率及K值增加。這是由于在超聲過程中，需要極強(qiáng)的剪切作用來克服Zein和PS分子間抗變形與分散的作用力。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，界面張力逐漸減小，使得剪切效果逐漸增強(qiáng)和液滴粒徑增大，導(dǎo)致液滴之間發(fā)生碰撞及凝聚不穩(wěn)定的現(xiàn)象[26-27]。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)納米復(fù)合物性能的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on properties of nanocomposites

2.1.2 Zein-PS納米顆粒性能的正交試驗(yàn)

如表2所示，通過極差分析可知，以包埋率為考察指標(biāo)，影響Zein-PS納米粒性能的主次因素為：水合時(shí)間＞水合溫度＞Zein與PS質(zhì)量比，即水合時(shí)間對(duì)納米顆粒的包埋率影響最大，Zein與PS質(zhì)量比最小。在正交試驗(yàn)中得到的最佳工藝條件為A2B2C2，由極差分析得到的最佳工藝為A2B2C1。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

方差分析見表3，由極差大小可知，B對(duì)納米顆粒包埋率的影響更為顯著，因此選取包埋率中B因素的較優(yōu)水平為2 h。通過F值可知，各因素對(duì)納米顆粒包埋率的影響順序?yàn)椋核蠒r(shí)間＞水合溫度＞Zein與PS質(zhì)量比。分別按正交試驗(yàn)A2B2C2和極差分析A2B2C1中得到的最佳工藝制備納米顆粒，發(fā)現(xiàn)A2B2C2（86.65%）制備出的納米粒包埋率比A2B2C1（80.24%）高。綜合考慮得出最佳Zein-PS納米粒工藝：Zein與PS質(zhì)量比15∶1、水合時(shí)間2 h、水合溫度55 ℃。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2 Zein-PS納米粒的特性分析

2.2.1 粒徑和Zeta電位分析

粒徑與Zeta電位是影響納米液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，粒徑越小且Zeta電位的絕對(duì)值越大穩(wěn)定性越高。由圖5A可知，納米液的粒徑隨著質(zhì)量比的增加而逐漸減小，這說明Zein的加入改變了PS的粒徑分布情況。從圖5B可以看出，Zein納米液的Zeta電位的絕對(duì)值比PS的更高，隨質(zhì)量比的增加，Zeta電位先升高后降低。這是歸因于帶帶正電荷的Zein成功負(fù)載了PS，導(dǎo)致納米液的負(fù)電荷增加[28]。當(dāng)Zeta電位低于-30 mV或高于30 mV時(shí)，該納米液體系較為穩(wěn)定。質(zhì)量比15∶1的電位為（-22.79±0.015）mV，接近-30 mV，表明該納米液體系趨于穩(wěn)定狀態(tài)。而且，Zein和PS之間存在較強(qiáng)的靜電相互作用力，這有利于降低納米液的粒徑，從而提高Zeta電位和穩(wěn)定性[29]。此外，當(dāng)質(zhì)量比為15∶1時(shí)，納米粒的PDI達(dá)到最大。質(zhì)量比增大，PDI也顯著降低，可能是由于Zein添加量越高，Zein和PS之間的相互作用力增強(qiáng)，從而降低界面張力，使納米粒的粒徑分布更均勻[30]。所有粒徑的PDI保持在0.3以下，說明Zein與PS結(jié)合形成更緊密的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致粒徑較窄且穩(wěn)定性高[31]（圖5C）。

圖5 不同質(zhì)量比Zein-PS納米粒的粒徑（A）、Zeta電位（B）、PDI（C）Fig.5 Particle size (A), zeta potential (B), and PDI (C) of zein-PS nanoparticles with different zein/PS ratios

2.2.2 濁度和復(fù)溶穩(wěn)定性

由圖6可知，3 種樣品在24 h后吸光度下降較快。在48～72 h之內(nèi)Zein和PS的吸光度呈降低趨勢(shì)，而Zein-PS的吸光度變化緩慢且基本保持不變，這說明Zein-PS凍干粉的復(fù)溶穩(wěn)定性較好，Zein和PS最差，表明Zein成功的包封了PS，未出現(xiàn)沉降分層的現(xiàn)象[32]。從表4可知，隨著Zein與PS質(zhì)量比的增加，其粒徑和PDI呈先增大后降低的趨勢(shì)，這與前面的穩(wěn)定性和包埋率的結(jié)果相結(jié)合，說明納米液的分散性較好。納米粒凍干復(fù)溶后粒徑變大，PDI也逐漸增大，說明冷凍干燥會(huì)使納米粒聚集和分散性降低。復(fù)溶納米液在室溫下放置72 h后，質(zhì)量比低于15∶1時(shí)，復(fù)溶納米分散液是穩(wěn)定的，而質(zhì)量比超過15∶1時(shí)，發(fā)現(xiàn)復(fù)溶納米液有明顯的沉淀，說明過量的Zein不利于納米粒的復(fù)溶。這可能是由于冷凍干燥會(huì)引起Zein和PS結(jié)晶度增加，從而使納米復(fù)合物穩(wěn)定性降低[26]。

圖6 Zein、PS、Zein-PS凍干粉的復(fù)溶穩(wěn)定性Fig.6 Stability in aqueous solution of zein, PS and zein-PS freeze-dried powder

表4 凍干前后Zein-PS納米粒的粒徑和PDITable 4 Particle size and PDI of zein-PS nanoparticles before and after freeze drying

2.2.3 水溶解度

從圖7可知，凍干粉的包埋率和水溶解度隨著質(zhì)量比的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量比15∶1時(shí)，包埋率和水溶解度最高，分別為75.67%和0.36 mg/mL。這與前面的包埋率和離心穩(wěn)定性結(jié)果結(jié)合，說明質(zhì)量比過高會(huì)使Zein和PS的結(jié)合度減弱，將導(dǎo)致包埋率、離心穩(wěn)定性和水溶解度降低。與Lynda等[28]研究結(jié)果一致，主要是由于蛋白與甾醇分子之間存在氫鍵和疏水相互作用，使Zein-PS納米粒的溶解度和包埋率增大，但過多的質(zhì)量比不利于其形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

圖7 不同質(zhì)量比Zein-PS凍干粉的包埋率及水溶解度Fig.7 Encapsulation efficiency and water solubility of zein-PS freezedried powder with different zein/PS ratios

2.3 Zein-PS納米粒的結(jié)構(gòu)表征分析

2.3.1 SEM觀察Zein-PS納米粒的形態(tài)

從圖8A可知，Zein表面光滑呈近似球形的顆粒，這與Huang Min等[33]的研究結(jié)果玉米蛋白為典型的球形顆粒一致。而PS為雜亂的、無序的塊狀結(jié)構(gòu)（圖8B），這與周士嬌等[6]的研究結(jié)果類似。當(dāng)Zein和PS結(jié)合后微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，納米粒表面光滑且呈不規(guī)則的球形顆粒（圖8C），說明了PS成功包封在納米粒中。與前面的包埋率和離心穩(wěn)定性相結(jié)合，可能是由于PS填充了Zein內(nèi)部的蛋白空間，并呈現(xiàn)在納米顆粒的表面，使其離心穩(wěn)定性和包埋率增加。由于Zein帶正電荷，具有很強(qiáng)的靜電吸引作用，使納米粒的表面更加光滑和粒徑分散更均勻，與粒徑測(cè)得結(jié)果一致。Zein-PS納米粒凍干后會(huì)發(fā)生聚集和吸附，是由于凍干過程中Zein中的含硫氨基酸形成了二硫鍵。這說明PS能夠與Zein結(jié)合可以減少納米粒的損失，增加納米粒的穩(wěn)定性，從而形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[34]。

圖8 Zein（A）、PS（B）、Zein-PS（C）納米粒凍干粉的SEM圖Fig.8 SEM images of zein (A), PS (B), and zein-PS (C) nanoparticle freeze-dried powder

2.3.2 FTIR分析Zein、PS之間的分子相互作用

FTIR闡明了Zein和PS之間的分子相互作用機(jī)制，從圖9可知，Zein-PS納米粒與Zein的紅外光譜圖相似，表明Zein和PS之間沒有新的共價(jià)鍵生成。Zein和PS分別在3 413.92 cm-1和3 447.63 cm-1處的寬峰與—OH拉伸振動(dòng)有關(guān)。隨著Zein濃度的增加，—OH拉伸峰出現(xiàn)輕微的偏移，峰強(qiáng)度也增加。這些現(xiàn)象表明Zein和PS之間存在氫鍵作用[33]。酰胺I帶中Zein和PS的特征峰分別在1 658.99、1 658.51、1 627.71 cm-1處，與C＝O伸縮振動(dòng)有關(guān)。酰胺II帶中Zein和PS的代表峰在1 523.51 cm-1處與C—N和N—H拉伸振動(dòng)有關(guān)，且PS在1 523.51 cm-1處的特征峰幾乎消失，這說明Zein中的酰胺基團(tuán)和PS的羥基基團(tuán)之間發(fā)生了靜電相互作用[31]。由于Zein-PS納米復(fù)合物中存在氫鍵、靜電相互作用，表明Zein和PS分子之間具有較好的相容性和穩(wěn)定性。這與Zhou等[30]報(bào)道的乳清蛋白-PS研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，PS與Zein結(jié)合后并未改變Zein的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而是加強(qiáng)了Zein和PS分子間的相互作用而形成納米結(jié)構(gòu)。因此，PS被成功地包埋在Zein壁材中。

圖9 不同質(zhì)量比Zein-PS納米粒FTIRFig.9 FTIR spectra of zein-PS nanoparticles with different zein/PS ratios

2.4 Zein-PS納米粒的穩(wěn)定性分析

2.4.1 Zein-PS納米粒在胃腸道模擬液中的釋放

納米粒中生物活性物質(zhì)的釋放率和穩(wěn)定性對(duì)模擬載體在人體胃腸道中的代謝具有重要作用，一般PS不能溶解于消化液中被認(rèn)為不能被人體吸收利用。由圖10可知，在胃液中，PS釋放率為62.09%，而包埋后的Zein-PS納米粒中PS釋放率顯著降低，為57.78%。這說明由PS和Zein通過靜電作用和界面張力形成的納米復(fù)合物，對(duì)Zein-PS納米粒的包埋具有較好的緩釋能力。在腸液中，PS和Zein的釋放率均顯著降低，但Zein-PS釋放率下降高于PS?？赡苁怯捎赑S在模擬腸液中極不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)易被破壞的原因，將Zein負(fù)載PS的納米粒可以改善這一缺點(diǎn)。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，Zein-PS納米粒在胃腸液中的釋放率分別減少49.03%和28.11%，這說明胃蛋白酶和胰酶會(huì)導(dǎo)致以蛋白為壁材的基質(zhì)發(fā)生水解并形成孔隙，從而延緩納米粒釋放率和提高其穩(wěn)定性[35]。

圖10 Zein-PS納米粒在模擬胃腸中的釋放Fig.10 Release of zein-PS nanoparticles in simulated gastrointestinal fluids

2.4.2 貯藏穩(wěn)定性

將納米粒的粒徑應(yīng)用到食品生產(chǎn)中，對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。表5為Zein-PS納米粒粒徑及包埋率在4 ℃和25 ℃分別貯藏30 d后的變化。不同溫度下納米粒的包埋率和粒徑隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)均發(fā)生變化。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度下納米粒的粒徑均有所增加，但25 ℃時(shí)粒徑上升速度比4 ℃快。4 ℃時(shí)納米粒包埋率在貯藏30 d后變化較小，而25 ℃時(shí)納米粒包埋率顯著下降。這說明納米粒在室溫貯藏時(shí)粒徑增加更快，在較高溫度下易發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致其產(chǎn)生聚結(jié)現(xiàn)象[36]。因此，納米液在高溫或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存時(shí)具有靜電相互作用，導(dǎo)致納米粒的構(gòu)象發(fā)生變化，從而使其穩(wěn)定性降低。由此可知，低溫顯示了納米液具有較好的穩(wěn)定性，表明復(fù)合體系穩(wěn)定界面的能力更強(qiáng)。

表5 Zein-PS納米液的貯藏穩(wěn)定性Table 5 Storage stability of zein-PS nanoparticles in water

3 結(jié) 論

篩選了一種具有穩(wěn)定性及緩釋效果的納米粒，通過正交試驗(yàn)確定Zein-PS納米顆粒的最佳制備工藝：Zein與PS質(zhì)量比為15∶1、水合時(shí)間2 h、水合溫度55 ℃、超聲時(shí)間20 min。所制備的納米粒包埋率為84.97%，粒徑為（479.76±0.38）nm，PDI為0.236±0.012，Zeta電位為（-22.79±0.015）mV。對(duì)于納米粒的性質(zhì)，添加Zein可顯著提高其水溶解度和復(fù)溶特性。SEM顯示納米粒呈致密的網(wǎng)絡(luò)形狀及FTIR揭示其具有氫鍵、靜電相互作用，并未改變Zein和PS的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Zein-PS納米粒比PS更具有明顯的緩釋作用。在4 ℃貯藏過程中，可顯著降低Zein-PS納米粒的界面張力和形成粒徑較小的納米分散液，表現(xiàn)出更好的貯藏穩(wěn)定性。說明Zein-PS納米顆粒能有效改善PS的水溶性，增強(qiáng)其生物活性。因此，該研究結(jié)果可為Zein-PS復(fù)合納米顆粒作為穩(wěn)定劑或緩釋劑提供新思路，并促進(jìn)其在食品工業(yè)中的發(fā)展。