徐晴晴，王 峰，王文秀，莫 玲，沈志強1,

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站，濱州 256600；2.揚州大學 博士后科研流動站，揚州 225009；3.太倉廣東溫氏家禽有限公司，太倉 215488；4.山東省院士工作站，濱州 256600））

禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其通過反轉(zhuǎn)錄酶形成cDNA，在整合酶的幫助下插入宿主的基因組中形成前病毒引起患病禽的腫瘤性疾病和免疫抑制[1]。當前主要根據(jù)gp85基因序列的同源性將ALV分為A-K共11個亞群，在無有效疫苗和藥物的情況下，主要通過及時淘汰陽性雞來建立無外源性ALV感染的種雞群[2]。我國于2012年首次發(fā)現(xiàn)并分離到了K亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup,ALV-K）[3]。近年來，ALV-K在我國不同地區(qū)和多個地方品種雞的檢出率呈上升趨勢且超過了經(jīng)典的ALV-A和ALV-B[4-6]。因此，在實施ALV凈化時應(yīng)加強對地方品種雞中ALV-K的調(diào)查和監(jiān)測，避免重組進化出新的ALV亞群毒株而帶來更加復(fù)雜的感染情況[7]。

有規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）存在于絕大多數(shù)細菌和古細菌中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的CRISPR-RNA（crRNA）與反式激活的tracr RNA（trans-activating CRISPR tracr RNA）共同構(gòu)成引導(dǎo)RNA（guide RNA,gRNA），gRNA可引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas蛋白（CRISPR associated protein）對噬菌體的基因片段進行切割，構(gòu)成細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。Cas13a是一種RNA核酸內(nèi)切酶，屬于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Ⅵ型[8]，能在crRNA的引導(dǎo)下特異性切割靶標RNA，并在切割完成后仍保持活性，繼續(xù)切割其他非靶標RNA，即具有“附帶切割”能力[9]。利用Cas13識別靶序列后的附帶切割效應(yīng)，2017年，Gootenberg等[10]開發(fā)了特異性高靈敏度酶解報告基因解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK）檢測系統(tǒng)?；贑RISPR/Cas13a的SHERLOCK反應(yīng)系統(tǒng)在1~2 h內(nèi)便可肉眼觀測病原體的檢測及分型結(jié)果，特別是在野外和醫(yī)療設(shè)備欠缺的地區(qū)。本研究建立了ALV-K的CRISPR/Cas13a檢測體系，配合試紙條的應(yīng)用使檢測結(jié)果可視化，為臨床病例的現(xiàn)場檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸PCR鑒定為陽性的禽白血病病毒A/B/J亞群毒株（ALV-A/B/J）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、雞馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）、雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）和雞新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的病料由本實驗室保存，按照AxyGen DNA/RNA提取試劑盒的說明書制備這些病毒的核酸備用。

1.2 主要試劑DNA提取試劑盒購自AxyGen公司；pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細胞、DL2000 DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；rNTP solution mix、Murine RNase inhibitor、HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit均為New England Biolabs產(chǎn)品購自國內(nèi)代理商；TwistAmp Basic、Milenia HybriDetect 1均購自TwistDx產(chǎn)品。

1.3 RPA引物的設(shè)計RPA引物一般長30~35個核苷酸，引物短會影響重組酶的活性。5'端的前3個核苷酸應(yīng)當避免聚鳥嘌呤，3'末端是鳥嘌呤和胞嘧啶可以提升引物的擴增性能。參照GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ALV-K全基因組序列，使用DNAStar軟件尋找一段在K亞群毒株的gp85基因中比較保守，而與其他亞群ALV毒株差異性大的核酸序列作為目標區(qū)域，按照上述原則來設(shè)計RPA引物表1，在上游引物的5'端加入25 bp的T7啟動子序列，使RPA擴增后的目的片段能轉(zhuǎn)錄為Cas13a的靶標RNA。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 設(shè)計的引物和crRNATable 1 Designed primers and crRNA

1.4 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)TwistAmp?Basic kit的說明書來優(yōu)化RPA反應(yīng)體系，每個RPA酶預(yù)混粉劑可以配置4個反應(yīng)體系，先計算好待測樣品的數(shù)量，再加上陽性對照和陰性對照來配置總的預(yù)混液，混勻后分裝為9 μL/管，最后分別加入1 μL的DNA模板。測試反應(yīng)體系在不同溫度、引物濃度、反應(yīng)時間下的擴增效果。

1.5 crRNA的設(shè)計及體外轉(zhuǎn)錄RPA擴增得到的目的基因片段大小一般為100~200 bp，在目的基因片段中選擇與上、下游引物均不重疊的28 bp作為crRNA的靶向序列，應(yīng)用NCBI BLAST進一步確定該序列的特異性。通過體外轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生crRNA單鏈的DNA序列組成為：25 bp T7啟動子序列（GAAATTAATACGACTCA CTATAGGG）+36 bp與LwCas13a蛋白結(jié)合的錨定序列（GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACT AAAAC）+28 bp目的基因靶向序列的反向互補序列。通過引物合成后退火及T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit轉(zhuǎn)錄為crRNA，得到的crRNA利用Agencourt RNAClean XP磁珠進行純化。

1.6 LwCas13a蛋白的表達與純化構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET28a-LwCas13a并轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，優(yōu)化條件使其為可溶性表達。按照NTA-Ni柱說明書進行親和層析純化LwCas13a蛋白并進行透析和超濾濃縮。實驗過程中利用SDSPAGE進行蛋白大小分析，確保純化后得到的是目的蛋白。

1.7 CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系的建立先通過RPA擴增ALV-K的cDNA，再將RPA擴增產(chǎn)物、crRNA、LwCas13a蛋白、RNA報告分子等成分制備CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系，每個反應(yīng)體系有10 μL。實際應(yīng)用時需數(shù)好待測樣品的數(shù)量，加上陽性對照和陰性對照來配置總的預(yù)混液，混勻后分裝為9 μL/管，再分別加入1 μL的RPA擴增產(chǎn)物作為模板。將反應(yīng)管置于水浴鍋或PCR儀等能保持恒溫的儀器中，37℃孵育適當時間后向各反應(yīng)管中分別加入50 μL HybriDetect 1 assay buffer（來自Milenia HybriDetect 1 kit），移液器上下吹吸混勻，插入試紙條進行顯色。

1.7.1 反應(yīng)的特異性 分別以感染雞的其他常見病毒ALV-A/B/J、REV、MDV、CIAV、IBDV、IBV、NDV的DNA或cDNA為模板，使用所建立的CRISPR/Cas13a方法進行檢測，驗證其與其他病毒是否存在交叉反應(yīng)。

1.7.2 反應(yīng)的敏感性 設(shè)計并合成一對PCR引物（C1/C2）擴增包含了RPA目的基因區(qū)域的一段DNA，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收并克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑單菌落活化，將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒送測序。驗證后的重組質(zhì)粒pMD18-T-K作為標準品，NanoDrop2000可見光分光光度計測定其濃度為190 ng/μL，用無RNA酶的水進行10倍梯度稀釋，拷貝數(shù)計算公式為：（6.02×1023）×（DNA濃度ng/μL×10-9）/（DNA長度×660）=拷貝數(shù)（copies/μL）。得到的含有不同拷貝數(shù)（107~101copies/μL）的質(zhì)粒溶液作為模板進行CRISPR-Cas13a反應(yīng)，檢測該體系的敏感性。

1.7.3 反應(yīng)的符合性 將臨床上PCR檢測為ALV-K陽性的15份病料組織提取DNA后，分別用建立的CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系檢測，驗證該方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 RPA反應(yīng)和crRNA應(yīng)用DNAStar對ALV-K的基因組進行比對分析后，針對其gp85基因設(shè)計了相應(yīng)的RPA引物、標準質(zhì)粒構(gòu)建所需引物（C1/C2）和crRNA（表1），將設(shè)計的RPA引物進行不同的組合優(yōu)化，并通過CRISPR/Cas13a反應(yīng)得到了特異性好敏感性高的RPA引物對（K2F/K3R擴增產(chǎn)物為118 bp，表1中斜體加粗標記），優(yōu)化后的RPA反應(yīng)體系（10 μmol/L K2F/K3R 3 μL，TwistAmp Rehydration Buffer 30 μL，280 mmol/L醋酸鎂3 μL，ddH2O 6 μL）混勻后分裝為9 μL/管，最后分別加入1 μL的DNA模板，37℃孵育30 min快速擴增目的基因。

2.2 LwCas13a蛋白的表達與純化優(yōu)化后重組質(zhì)粒pET28a-LwCas13a的表達條件為：0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，18℃搖床160 rpm，培養(yǎng)16 h。離心收獲菌體，超聲破碎后收集蛋白上清液，用0.45 μm濾膜過濾。上清液用NTA-Ni柱純化（圖1）。純化后蛋白在透析液中（50 mmol/L Tris-HCl,600 mmol/L NaCl,5%glycerol,2 mmol/L DTT）4℃透析過夜，超濾管濃縮至終濃度為2 mg/mL，分裝為5 μL/管存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 純化后的LwCas13a蛋白Fig.1 Purif ied LwCas13a protein

2.3 CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系的建立優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系（ddH2O 6.25 μL，0.25 μL HEPES pH6.8 1 mol/L，0.1 μL MgCl21 mol/L，0.4 μL rNTP solution mix 25 mmol/L，1.0 μL LwaCas13a 63.3 μg/mL，0.5 μL Murine RNase inhibitor 40 U/μL，0.25 μL T7 RNA polymerase 5 U/μL，0.5 μL crRNA 10 ng/μL，0.1 μL RNA 報告分子100 μmol/L）再分別加入1 μL的待測RPA擴增產(chǎn)物作為模板，37℃孵育50 min來檢測目的基因。RNA報告分子兩端分別標記了5/6-羧基熒光素（FAM）和生物素（Biotin）。Milenia HybriDetect試紙條 上劃有與Biotin結(jié)合的鏈霉親和素作為對照線（C線）和用于捕獲與膠體金偶聯(lián)的抗FAM一抗的檢測線（T線）。CRISPR/Cas13a反應(yīng)產(chǎn)物流經(jīng)納米金標抗FAM抗體時，體系中RNA報告分子的FAM端會標記上納米金。若樣本中含有ALV-K，則crRNA、LwCas13a蛋白和RPA擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄后的RNA形成復(fù)合體激活LwCas13a蛋白的RNA酶活性，切割體系中的RN A（包括RNA報告分子）。若RNA報告分子被全部切斷則其FAM端會流過C線到達T線被抗抗體捕捉而顯色；當只有一部分RNA報告分子被切斷時，C和T線都會顯色，這兩種情況都表明樣本中含有ALV-K判定為陽性。若樣本中無ALV-K，crRNA和LwCas13a蛋白形成的復(fù)合體則不能激活蛋白的RNA酶活性來切割RNA。RNA報告分子未被剪切時，其Biotin端會被攔截在C線上顯色而T線不顯色判定為陰性（圖2）。

圖2 CRISPR/Cas13a檢測體系的反應(yīng)流程Fig.2 Experimental workf low of the CRISPR/Cas13a detection system

2.4 CRISPR/Cas13a反應(yīng)的特異性、敏感性和符合性用建立的ALV-K CRISPR/Cas13a體系檢測樣品，只有ALV-K的cDNA作為RPA反應(yīng)模板的T線顯色為陽性，其他的核酸檢測只有C線顯色為陰性（圖3）。結(jié)果表明，本方法具有很高的特異性與其他感染雞的常見病毒不存在交叉反應(yīng)。應(yīng)用1 μL含有不同拷貝數(shù)（107~101copies/μL）的標準品質(zhì)粒溶液作為模板，按照1.4和2.1來配置RPA反應(yīng)體系。再分別取1 μLRPA反應(yīng)產(chǎn)物作為模板按照1.7和2.3的方法進行CRISPR/Cas13a檢測。結(jié)果表明，該方法檢測ALV-K的靈敏度為50 copies/μL（圖4）。用建立的ALV-K CRISPR/Cas13a方法檢測15份PCR鑒定為ALV-K核酸陽性的樣品，結(jié)果顯示，15份樣品全部為陽性，符合率為100 %（圖5）。

圖3 CRISPR/Cas13a檢測體系的特異性Fig.3 Specif icity of CRISPR/cas13a detection system

圖4 CRISPR/Cas13a檢測體系的敏感性Fig.4 Sensibility of CRISPR/cas13a detection system

圖5 CRISPR/Cas13a檢測體系的符合性Fig.5 Conformity of CRISPR/Cas13a detection system

3 討論

根據(jù)傳播的特征和方式，ALV可分為外源性和內(nèi)源性病毒。感染雞的內(nèi)源性ALV為E亞群，主要以cDNA的形式嵌合在雞的染色體基因組中，干擾外源性ALV的檢測為該病的凈化帶來很大的困難[1]。感染雞的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亞群，盡管ALV-K的復(fù)制能力較弱且很少引起腫瘤，但發(fā)現(xiàn)其與其他亞群ALV混合感染的情況時常發(fā)生，而不同亞群毒株的共感染加大了ALV的基因重組及突變[11]。因此，應(yīng)加強地方品種雞中ALV-K的調(diào)查和監(jiān)測，建立特異、準確、快速的檢測方法。

國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種ALV-K的診斷方式，包括病毒分離、ELISA、LAMP、PCR和實時熒光定量PCR等[12-16]，這些技術(shù)都有其適用性，但均存在流程繁瑣，時間較長的缺點，比如病毒分離操作繁瑣且周期長，ELISA敏感性低，LAMP易出現(xiàn)假陽性，而實時熒光定量PCR需要昂貴的設(shè)備和有一定生物技術(shù)的人員才能完成。CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其簡單、高效的基因編輯能力，已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學等多個研究領(lǐng)域。自2015以來CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的研究突飛猛進[17]，被開發(fā)為一種快速、便攜、低成本、高靈敏度的分子檢測體系，在病原體檢測、耐藥性分析和腫瘤基因突變檢測等方面取得了顯著突破，具體的被應(yīng)用于寨卡病毒、登革熱病毒、EB病毒、H7N9禽流感病毒、埃博拉病毒、新型冠狀病毒、致病細菌株及其耐藥基因和SNP分型等多種靶標檢測[18-22]。相比先前的研究，RPA的引入顯著提高了該方法的靈敏度。同時，基于Cas13a的檢測體系擁有高靈敏度和高錯配敏感性，其特異性的crRNA識別目標序列時只允許一個堿基的錯配，能準確的區(qū)分ALV各亞群毒株。商品化試劑盒提取樣品核酸大約10 min，CRISPR/Cas13a體系檢測ALV-K需要80 min左右，因此2 h內(nèi)便可肉眼觀測病原體的檢測及分型結(jié)果。本研究建立了ALV-K的CRISPR/Cas13a檢測方法，為ALV-K的早期快速診斷、流行病學調(diào)查和防控提供了技術(shù)支撐。