申玉蓉，梁朝遠(yuǎn)，張曉菲，何學(xué)松，琚琪，王曉麗，鄧雄威，肖向茜，盛望

1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124；2.國家納米科學(xué)中心，北京100190

黑色素瘤雖然僅占所有皮膚癌的1%，但卻是最具侵襲性和危險性的一種腫瘤，占所有皮膚癌死亡病例的90%［1］。目前治療黑色素瘤的方法有手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療、免疫治療等［2］。但單純通過手術(shù)切除腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險較高，而放化療消滅腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生多種副作用［3］，會對癌癥患者身體造成二次傷害。靶向治療，如v-raf 鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）的抑制劑，已經(jīng)用于臨床。但靶向治療面臨的一大瓶頸是繼發(fā)性耐藥，甚至有的患者對藥物不產(chǎn)生反應(yīng)或藥物副作用嚴(yán)重［4］。急需開發(fā)一種個性化的抗黑色素瘤藥物療法。

免疫療法治療腫瘤如今受到醫(yī)學(xué)界和生物學(xué)界的廣泛關(guān)注。免疫療法包括免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR-T）細(xì)胞療法、Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）激動劑、過繼性免疫細(xì)胞療法、腫瘤疫苗等。TLR 是模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）的一種，在先天免疫反應(yīng)中具有重要作用［5］，TLR9 在人B 細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）中表達(dá)［6］，人工合成的CpG寡脫氧核苷酸（CpG ODN）可激活TLR9，降低免疫耐受，從而促進免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)［7］，目前已有100款以上以CpG 作為佐劑的預(yù)防性、治療性疫苗正處于臨床試驗階段。納米佐劑有較強的免疫募集活性，其大小、形狀和表面性質(zhì)均可根據(jù)需求設(shè)計［8］，CpG被納米顆粒包載后有利于被細(xì)胞通過內(nèi)吞作用進入活細(xì)胞，并與內(nèi)體／溶酶體表面的TLR9結(jié)合，進一步激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的免疫級聯(lián)反應(yīng)，具有免疫原性增強作用［9］。

腫瘤疫苗根據(jù)用途分為預(yù)防型和治療型兩種，是近些年的研究熱點之一，根據(jù)成分可分為腫瘤全細(xì)胞疫苗、蛋白多肽疫苗、基因工程疫苗、抗體腫瘤疫苗等。癌癥疫苗將腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)蛋白或多肽、表達(dá)腫瘤抗原的基因等多種形式的腫瘤抗原導(dǎo)入患者體內(nèi)，激發(fā)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞裂解物中含有豐富的抗原，可有效激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，通過與佐劑共同作用可增強腫瘤特異性免疫應(yīng)答。

本實驗前期自行設(shè)計并構(gòu)建了β葡聚糖-CpG復(fù)合佐劑納米顆粒，該納米顆粒利用自組裝原理將CpG 包裹其中，形態(tài)近球形，作為佐劑，可成為良好的藥物遞送系統(tǒng)［10］，本研究將該納米顆粒和黑色素瘤細(xì)胞裂解液分別在體外對骨髓來源樹突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）進行刺激后，按一定比例將二者混合制備成疫苗對荷瘤小鼠進行治療，通過體內(nèi)外免疫效果評價探討該疫苗對黑色素瘤的治療作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 小鼠黑色素瘤細(xì)胞系（B16F10）購自北京協(xié)和細(xì)胞庫，保存于北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院藥物研究所實驗室。

1.2實驗動物 SPF 級雌性C57BL／6N 小鼠，50 只，6 ～8周齡，體質(zhì)量18 ～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于北京神瑞生物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號：SYXK（京）2020-0001。本實驗以科研為目的進行小鼠的養(yǎng)殖和使用，且經(jīng)北京工業(yè)大學(xué)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照中國科學(xué)院過程工程研究所倫理要求進行動物實驗（IPEAECA2019016）。

1.3主要試劑及儀器 包載CpG 的納米顆粒（CpGcoated nanoparticles，CNP，即納米復(fù)合佐劑）由本實驗室自行設(shè)計并構(gòu)建［10］；CpG 1826 由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；羧甲基β 葡聚糖（carboxymethyl β-glucan，CMG）購自美國Sigma公司；小鼠IFNγ ELISA 試劑盒（貨號：1210002）、IL-12 ELISA 試劑盒和TNF-α ELISA 試劑盒（貨號：1217202）購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-6試劑盒（貨號：431304）、IL-2p40 ELISA 試劑盒（貨號：431604）、鼠抗CD11c（FITC 標(biāo)記）、MHC-Ⅱ（PE 標(biāo)記）、CD80（APC 標(biāo)記）、CD86（PerCP-Cy5.5）和TruStain FcX?PLUS（CD16／32）抗體購自美國BioLegend 公司；4%多聚甲醛組織細(xì)胞固定液購自北京索萊寶科技有限公司；CD8α 試劑（D4W2Z）XP?Rabbit mAb（Mouse Specific）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國CST 公司；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）購自美國Thermo公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自美國Merck公司；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.4腫瘤裂解液及疫苗的制備 采用反復(fù)凍融法制備腫瘤裂解液。將B16F10 細(xì)胞用含10%FBS 和1%PS的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至融合度約80%時，用0.25%胰酶（含EDTA）消化，PBS 洗滌去除殘留培養(yǎng)基，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1 × 107個／mL，分裝至細(xì)胞凍存管中，1 mL／管；將凍存管先置于液氮中5 min，然后迅速置預(yù)熱的37 ℃水浴鍋中加熱5 min，反復(fù)凍融5 次；將凍存管中液體轉(zhuǎn)移至離心管中，25 ℃，2 000×g離心15 min；收集上清，BCA 試劑盒檢測上清蛋白含量，-20 ℃條件下保存。

將腫瘤裂解液（50μg／mL）與CNP（20μg／mL）混合，制備腫瘤裂解物疫苗。

1.5小鼠BMDCs 的分離及體外刺激成熟試驗 將C57BL／6N小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉并脫頸處死后進行酒精消毒處理，無菌取完整的股骨和脛骨，分別剪開兩端露出骨髓腔，用RPMI1640培養(yǎng)基沖洗骨髓多次至髓腔變白，將收集的骨髓沖洗液經(jīng)70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，置培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱靜置30 min；收集懸浮細(xì)胞以及皿底松散貼壁細(xì)胞置50 mL 離心管中，400×g離心5 min；棄上清，細(xì)胞計數(shù)后，按4×106個／孔接種6 孔板，補加DCs 培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)液加入50 μmol／L β-巰基乙醇、10% FBS、1%PS、0.05% IL-4 和1% GM-CSF），4 mL／孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，記為第0天；第3天細(xì)胞全換液；第5 天細(xì)胞半換液；第7 天收集懸浮細(xì)胞，350×g離心5 min；細(xì)胞計數(shù)后，按1×106個／孔接種24孔板，補加DCs培養(yǎng)基，1 mL／孔。設(shè)PBS、CpG（2μg／孔）、CNP（2μg／孔）、裂解液（3、5、8μg／孔）組，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后分別收集細(xì)胞及其上清液。BMDCs 用流式抗體CD11c-FITC、MHC-Ⅱ-PE、CD86-PerCPCy5.5、CD80-APC 4 ℃染色15 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測；上清液中細(xì)胞因子含量檢測按IL-6、IL-12 ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.6B16F10動物模型的建立及分組給藥 經(jīng)C57BL／6N小鼠右后肢皮下接種2×105個對數(shù)生長期的B16-F10 細(xì)胞，7 d 后，篩選腫瘤大小相對一致的40 只小鼠，隨機分為4組，每組10只：對照（PBS，100μL／只）、佐劑（CNP，20μg／只）、裂解液（Lysate，50μg／只）、疫苗（Vaccine，CNP 20 μg／只、Lysate 50 μg／只）組，均經(jīng)頸部皮下注射，100μL／只，每周給藥1 次，連續(xù)3 周。給藥期間，用游標(biāo)卡尺每隔2 d 記錄腫瘤最大直徑（a）和最小直徑（b），計算腫瘤體積（V=1／2×a×b2），計算腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。

1.7外周血中IFNγ和TNF-α含量的檢測 于最后1次給藥后第7 天，用10%水合氯醛麻醉小鼠，眼眶取血，置EDTA 抗凝管中，450 ×g離心10 min，收集上清，按IFNγ和TNF-α ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.8腫瘤組織中細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞（cytotoxic T Cells，CTLs）浸潤情況的檢測 剝離各組小鼠腫瘤，置4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后制備組織切片，用抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）進行修復(fù)（中火8 min，?；? min，再轉(zhuǎn)中低火7 min）；切片置3%雙氧水溶液（阻斷內(nèi)源性過氧化物酶），室溫避光25 min；滴加3%BSA 封閉30 min；加入一抗（CD8α試劑，1∶1 000稀釋），4 ℃過夜；加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶1 000 稀釋）避光孵育50 min；甩干，加入DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水洗滌終止顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核約3 min；自來水洗滌后脫水封片。顯微鏡下采集圖像，分析腫瘤組織中CTLs（也稱CD8+T淋巴細(xì)胞）浸潤情況。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 6.0 軟件繪制圖表。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，隨時間變化的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果用FlowJo軟件分析。

2 結(jié)果

2.1BMDCs 體外刺激成熟結(jié)果 與PBS 組比較，經(jīng)CpG 和CNP 刺激后，BMDCs 表面的MHC-Ⅱ、CD86、CD80 表達(dá)明顯增加，其中，CNP 與CpG 比較，可刺激產(chǎn)生更高水平的的MHC-Ⅱ、CD86 和CD80（t分別為3.686、4.031 和4.093，P均＜0.05），表明CpG 可促進BMDCs 成熟，且納米顆粒包載后可提高CpG 促BMDCs成熟的作用。此外，與PBS組比較，加入不同劑量的腫瘤細(xì)胞裂解液刺激BMDCs，對其成熟的作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明裂解物對DCs無免疫調(diào)控活性。見圖1。

圖1 BMDCs 表面標(biāo)志物MHC-Ⅱ（A）、CD86（B）和CD80（C）表達(dá)的分析Fig.1 Expression of surface markers MHC-Ⅱ（A），CD86（B）and CD80（C）in BMDCs

經(jīng)CpG刺激后，BMDCs分泌IL-6和IL-12的能力提高。CNP 刺激后分泌IL-6 和IL-12 的水平，與CpG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為7.776 和3.163，P分別為＜0.01和＜0.05），其中，分別為CpG刺激后的1.4和1.2倍，表明納米顆粒包載后可提高CpG的免疫調(diào)節(jié)活性，在促進BMDCs 成熟后，促進其細(xì)胞因子分泌。經(jīng)不同劑量裂解液刺激后的BMDCs，IL-6和IL-12 分泌水平與PBS 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明裂解物對DCs 無免疫調(diào)控活性。見圖2。

圖2 BMDCs培養(yǎng)上清中IL-6（A）和IL-12（B）分泌水平的檢測Fig.2 IL-6（A）and IL-12（B）secretion levels in culture supernatant of BMDCs

2.2小鼠腫瘤體積生長曲線 與PBS 組比較，CNP、Lysate 和Vaccine 組小鼠腫瘤生長速度均變緩，其中Vaccine 組小鼠腫瘤體積最小，表明疫苗接種可誘導(dǎo)更強的抗腫瘤免疫效應(yīng)（與PBS、CNP、Lysate組比較，t分別為17.44、10.78、13.93，P均＜0.000 1）。見圖3。

圖3 小鼠腫瘤體積生長曲線Fig.3 Growth curve of tumor volume in mice

2.3血清中細(xì)胞因子含量 與PBS 組比較，CNP 和Lysate 組小鼠血清中IFNγ 水平升高不顯著（t分別為1.689 和0.863 8，P＞0.05），但Vaccine 組顯著升高（t=7.189，P＜0.000 1），且Vaccine組與CNP、Lysate、PBS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為4.436、6.247、7.189，P分別為＜0.01、＜0.000 1、＜0.000 1），表明疫苗免疫可有效激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。CNP和Lysate 組小鼠血清中TNF-α水平與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為0.287 0、1.334，P均＞0.05），但Vaccine組高于PBS 組（t= 2.330，P＜0.05），表明疫苗免疫具有促進TNF-α表達(dá)的免疫調(diào)控作用。見圖4。

圖4 血清中IFNγ（A）和TNF-α（B）含量Fig.4 Contents of IFNγ（A）and TNF-α（B）in serum

2.4腫瘤中CTLs細(xì)胞浸潤情況 PBS組中分離的黑色素瘤組織中幾乎未見棕褐色染色區(qū)域，與其相比，CNP和Lysate組出現(xiàn)少量棕褐色染色的CD8+T細(xì)胞，而Vaccine 組棕褐色區(qū)域明顯增加，表明疫苗免疫可有效促進CD8+T 淋巴細(xì)胞在黑色素瘤組織中的浸潤，改變了黑色素瘤組織中冷腫瘤狀態(tài)，并有效抑制黑色素瘤生長。見圖5。

圖5 各組小鼠腫瘤內(nèi)CD8+T 淋巴細(xì)胞的浸潤情況（標(biāo)尺：20μm）Fig.5 Infiltration of CD8+ T lymphocytes in tumor tissues of mice in each group（scale：20μm）

3 討論

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是一個復(fù)雜的環(huán)境，既有腫瘤細(xì)胞，又有各種免疫細(xì)胞，包括T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓來源的抑制性細(xì)胞等，此外還有各種細(xì)胞因子、免疫檢查點分子，其中，細(xì)胞與細(xì)胞分子相互作用影響腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［11］。

DCs 作為功能最強的抗原提呈細(xì)胞，起到免疫檢測前哨作用［12］，腫瘤裂解液中含有豐富的抗原，可有效通過病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被DCs 識別，PAMPs 的直接識別是由PRRs 介導(dǎo)的，包括TLRs 和C 型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）［13］，抗原肽經(jīng)過加工后與主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子形成異常穩(wěn)定的復(fù)合體。與此同時，DCs趨于成熟，共刺激分子表達(dá)增加，包括CD40、CD8 和CD86；功能也發(fā)生變化，具備提呈功能，將抗原肽-MHC 復(fù)合體呈遞給輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，Th）或殺傷性T細(xì)胞（cytotoxic T cells，Tc）［14］。

非甲基化的CpG基序存在于細(xì)菌和病毒的DNA，而在脊椎動物基因組中被高度抑制和甲基化，早在上個世紀(jì)就有人專門用細(xì)菌提取物成功治愈癌癥［15］，CpG ODN 可模擬細(xì)菌DNA，刺激B 細(xì)胞、DCs 和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進而刺激NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞等［16］。TLR是PRRs的一種，屬于跨膜蛋白，而TLR9是胞內(nèi)蛋白，CpG被內(nèi)吞后可與細(xì)胞內(nèi)TLR9結(jié)合，激活MyD88NFκB信號通路，激發(fā)免疫反應(yīng)。

本研究采用CpG 作為佐劑，用納米包載后與黑色素瘤細(xì)胞系B16F10 的裂解物混合制備成治療性腫瘤疫苗，分別進行體內(nèi)外試驗評價該款疫苗免疫效果。在體外刺激BMDCs 的試驗中，CpG 對DCs 有明顯刺激成熟作用，其表面標(biāo)志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)量相較于對照組增加，且IL-6 和IL-12 的分泌量也有很大提高，CpG 被納米顆粒包載后，對DCs刺激成熟情況也比未納米化有一定提高，但腫瘤裂解液對BMDCs 的刺激成熟效果并不佳；體內(nèi)抗黑色素瘤試驗中，疫苗免疫接種取得了較好的抗黑色素瘤效果，腫瘤體積明顯小于單獨使用組和對照組，且疫苗組小鼠血清中IFNγ（P＜0.000 1）和TNF-α（P＜0.05）含量均高于對照組；治療后腫瘤中CD8+T 數(shù)量增多，表明淋巴細(xì)胞浸潤腫瘤內(nèi)，將腫瘤由“冷”轉(zhuǎn)“熱”，對其產(chǎn)生了殺傷作用。

但腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，易產(chǎn)生免疫耐受和免疫抑制，CTLs 會出現(xiàn)功能障礙和衰竭［17］，因此單一的治療效果可能不佳，考慮在之后的研究中引入放化療或其他免疫治療手段，如免疫檢查點抑制劑、小分子抗體等。近年來，以PD-1、PD-L1、CTAL-4為靶點的免疫檢查點抑制劑已應(yīng)用于臨床，也有研究表明，IFNγ的分泌與宿主和癌癥細(xì)胞中PD-1的表達(dá)密切相關(guān)［18］。

本研究不僅證實了納米化的CpG 作為佐劑在抗腫瘤方面的有效性，同時腫瘤裂解物獲取途徑較為便捷，疫苗制作工藝簡單，與佐劑聯(lián)合起到了很好的協(xié)同抑瘤作用，為腫瘤免疫治療提供了參考。