牛銀銀，陳鵬，崔紅米，楊瀟燕，米貫勛，李三華，劉文弟，齊華

河南省腫瘤病理診斷試劑工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001

以酶標(biāo)二抗為核心的免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色技術(shù)是病理學(xué)的重要組成部分，優(yōu)質(zhì)的酶標(biāo)二抗具有特異性強(qiáng)，靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。目前，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗工作液在冷藏條件下可保存1 年，穩(wěn)定性好，可滿足IHC 技術(shù)的需求［1］。近年來，隨著蛋白標(biāo)志物研究水平的提高，多重IHC 的應(yīng)用在科研與臨床檢測領(lǐng)域均有需求，研究人員可通過對組織樣本進(jìn)行多重IHC，在原位分析不同抗原靶標(biāo)之間的空間關(guān)系，特別是對腫瘤微環(huán)境的研究尤其重要。多重IHC 的核心在于用不同種類酶標(biāo)記的二抗來結(jié)合多個蛋白標(biāo)志物，再利用不同酶的顯色底物進(jìn)行顯色，常用的不同酶標(biāo)記二抗是HRP 偶聯(lián)二抗和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）偶聯(lián)二抗的雞尾酒混合物［2-5］。

混合酶標(biāo)記抗體在科研領(lǐng)域的應(yīng)用中，基本是以濃縮液或凍干粉的形式存儲于-20 ℃及以下低溫環(huán)境中，可使試劑保存期達(dá)1 年以上，使用時，用稀釋液對其進(jìn)行處理配置為工作液，保存于冷藏（2 ～8 ℃）條件下，保存期僅為1 個月左右。在臨床檢測領(lǐng)域，檢測試劑為即用型工作液，在冷藏條件下至少需保存1 年。因此，提高混合酶標(biāo)抗體的穩(wěn)定性，對于多重IHC的發(fā)展尤其重要［6-9］。

為了確保混合酶標(biāo)記抗體的長期穩(wěn)定性，本研究以Tris-HCl 緩沖鹽溶液為基礎(chǔ)溶液，探討不同稀釋液配方對其穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1樣本 人乳腺癌（RX1024）、食管鱗癌（SG512）、結(jié)腸癌（C1022）、肺鱗癌（FLCa896）和扁桃體（BTT-433、BTT827）石蠟組織切片由鄭州賽諾特醫(yī)學(xué)檢驗所提供并授權(quán)研究。所有樣本入庫建檔日期在2018年3月—2019年12月之間，每個樣本制備3μm厚的白片10張。

1.2主要試劑及儀器 AP標(biāo)記的羊抗兔二抗?jié)饪s液（使用效價：10μg／mL）、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗?jié)饪s液（使用效價：7.5μg／mL）、鼠抗人p53 單克隆抗體（克隆號：DO-7，稀釋比：1／150）、鼠抗人細(xì)胞角蛋白5 單克隆抗體（克隆號：GM028，稀釋比：1／200）、鼠抗人E-Cadherin 單克隆抗體（克隆號：GM028，稀釋比：1／200）、兔抗人CD3 單克隆抗體（克隆號：MRQ-39，稀釋比：1／100）、兔抗人Ki67 單克隆抗體（克隆號：SP6，稀釋比：1／150）、兔抗人C-erbB-2 單克隆抗體（克隆號：EP3，稀釋比：1／200）均由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司提供；Tris、L-Ascorbic Acid、Lmethionine、L-histidine、酪蛋白酸鈉、BSA 和海藻糖購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氯化鎂、氯化鋅、氯化鈉和Tween-20 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Proclin-950 購自北京索萊寶科技有限公司；ELISA 試劑盒購自美國Abcam 公司；酶標(biāo)儀和紫外光分光光度計購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.34 種不同稀釋液保存混合酶標(biāo)抗體試劑的配制及放置 配制4 種不同配方的抗體稀釋液A、B、C、D［3-4］，在每種稀釋液中添加相同含量的混合酶標(biāo)抗體，配制成工作液，用離心管分裝，每種試劑分裝10支（1 mL／支），其中5 支放入恒溫培養(yǎng)箱（設(shè)置37 ℃）中，另5支放入2 ～8 ℃冷藏條件下保存。

A 液配方為：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化鈉（150 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）；B 液配方為：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化鈉（150 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）+氯化鎂（0.5 mmol／L）；C液配方為：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+ 氯化鈉（150 mmol／L）+ L-methionine（5 mmol／L）+明膠（1%，g／100 mL）+海藻糖（8%，g／100 mL）+氯化鋅（0.1 mmol／L）；D液配方為：Tris（50 mmol／L）+ 牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化鈉（150 mmol／L）+L-Ascorbic Acid（1 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+酪蛋白酸鈉（1%，g／100 mL）+氯化鋅（0.1 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）。

1.4混合酶標(biāo)抗體中HRP 和AP 活性剩余比率的測定 活性剩余比率指37 ℃熱加速試驗后的活性與相同條件保存于冷藏條件的試劑活性的比率。HRP的活性檢測需將樣本稀釋2.5倍，將該工作液與聯(lián)苯三酚底物反應(yīng)生成紅陪酚產(chǎn)物，通過紫外光分光光度計在420 nm波長處測定吸光度值，通過公式1計算出酶活性；AP的活性檢測需將樣本濃度稀釋至1μg／mL，樣本中的AP與底物PNPP 反應(yīng)，形成黃色產(chǎn)物，通過紫外光分光光度計在400 nm 波長處測定吸光度值，通過公式2計算出工作液中的酶活性［10-11］。

式中3為測定的體積（mL）；df為稀釋因子；12為式中Vt 為反應(yīng)混合物最終體積；Vs 為樣品體積（0.10 mL）；ε 為對硝基苯酚的微摩爾消光系數(shù)（18.7 cm2／μmol）；體積活度（U／mL）=△A400／min×1.6×稀釋倍數(shù)。

1.5混合酶標(biāo)抗體中抗體工作液效價的測定 采用間接ELISA 法測定工作液的效價，按試劑盒說明書操作。

1.6組織切片的IHC 檢測 組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，用純水沖洗干凈，利用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)液為Tris-EDTA（pH 9.0），修復(fù)2.5 min；自然冷卻，TBST 洗滌，過氧化物酶封閉劑封閉5 min；TBST洗滌，加入一抗，常溫孵育60 min；TBST 洗滌，加入二抗，常溫孵育30 min；TBST洗滌，DAB顯色5 ～8 min；純水沖洗，蘇木素襯染1 ～3 min；純水沖洗，脫水，透明，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.7數(shù)據(jù)采集及分析 通過Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，使用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1混合酶標(biāo)抗體中HRP和AP活性剩余比率 D液最優(yōu)，10 周后HRP 和AP 活性剩余分別為93.46%和96.07%，A 和B 液的HRP 和AP 活性下降幅度很大，C 液對HRP 的活性有一定的保護(hù)作用，10 周后活性還剩余90.51%，但對AP 活性未起到很好的保護(hù)作用，10周后AP活性下降接近20%。見表1。

表1 混合酶標(biāo)抗體中HRP和AP活性剩余比率（%）Tab.1 Residual ratios of HRP and AP activity in mixed enzyme-labeled antibody（%）

2.2混合酶標(biāo)抗體中HRP 和AP 偶聯(lián)二抗的效價ELISA 結(jié)果顯示，D 液最優(yōu)，10 周后HRP 偶聯(lián)二抗和AP 偶聯(lián)二抗與第0 天對照所得曲線非常接近，而其他組距離較遠(yuǎn)，A液整體最差。見圖1。

A：HRP偶聯(lián)二抗37 ℃保存2周；B：AP偶聯(lián)二抗37 ℃保存2周；C：HRP偶聯(lián)二抗37 ℃保存4周；D：AP偶聯(lián)二抗37 ℃保存4周；E：HRP偶聯(lián)二抗37 ℃保存6周；F：AP偶聯(lián)二抗37 ℃保存6周；G：HRP偶聯(lián)二抗37 ℃保存8周；H：AP偶聯(lián)二抗37 ℃保存8周；I：HRP偶聯(lián)二抗37 ℃保存10周；J：AP偶聯(lián)二抗37 ℃保存10周。

2.3不同存儲時間保存試劑的IHC 檢測 IHC 檢測結(jié)果顯示，D 液染色效果最優(yōu)，混合酶標(biāo)二抗于37 ℃放置10 周后，其染色強(qiáng)度與第0 天對照試劑的染色效果最接近，其他配方均有不同程度的減弱。見圖2和圖3。

圖3 AP偶聯(lián)抗體的IHC結(jié)果（快紅染色，×200）Fig.3 IHC results of AP conjugated antibody（Fast red staining，×200）

3 討論

為了研究出一種適用于混合酶標(biāo)抗體的稀釋液，本研究設(shè)計了4 種保存液配方，將二抗試劑用保存液稀釋，配置成工作液，探討其對HRP偶聯(lián)二抗和AP 偶聯(lián)二抗穩(wěn)定性的影響。HRP 和AP 是目前使用最廣泛的標(biāo)記酶，用于標(biāo)記抗體或其他蛋白質(zhì)，用于定性或定量檢測。這種酶標(biāo)記的抗體溶液是體外診斷試劑盒的重要組成成分，與試劑的性能質(zhì)量直接相關(guān)。

Tris緩沖液作為一種生物緩沖試劑，在水中的溶解度極高，對很多酶反應(yīng)是惰性的，可作為酶偶聯(lián)二抗的緩沖系統(tǒng)。BSA 作為蛋白保護(hù)劑，可提高溶劑中蛋白質(zhì)的濃度，對酶起到保護(hù)作用，防止酶的分解及非特異性吸附，減輕不利環(huán)境下引起的酶或蛋白變性［12-14］。Tween-20 是非離子型表面活性劑，具有復(fù)性抗原的作用，可提高抗原抗體的結(jié)合能力，保護(hù)抗體效價。氯化鋅等可溶解性鹽中的鋅離子可阻止AP 受到螯合劑的作用失去鋅離子，氯化鎂等可溶性鹽中的鎂離子可激活A(yù)P，提高其催化水解的效率，同時，鎂離子可與蛋白形成多點(diǎn)接觸，增加蛋白的剛性，提高蛋白應(yīng)對溫度變化的穩(wěn)定性［15-16］。適宜的鈉離子濃度可很好地穩(wěn)定酶的活性，同時，作為電解質(zhì)，有益于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)。明膠和酪蛋白是一類生物高聚分子，作為封閉劑，可在一定程度上避免抗體的吸附，在保存液中起到穩(wěn)定劑的作用［17］。海藻糖是一種多糖，能夠干擾酶分子的結(jié)構(gòu)重疊，同時，這種物質(zhì)中的多元醇結(jié)構(gòu)可通過氫鍵與酶的表面分子結(jié)合，促進(jìn)酶分子的穩(wěn)定效果［18-19］。P950 是一種廣譜型抑菌劑，在一定濃度下可長期抑制細(xì)菌、真菌等微生物的生長，且不影響HRP等酶的活性，對于抗體的結(jié)合反應(yīng)無干擾，是理想的生物防腐劑。L-methionine 是一種強(qiáng)抗氧化劑，由于其本身的硫和螯合能力，使其具有清除自由基的活性，保持蛋白的穩(wěn)定性，L-Ascorbic Acid 作為一種常見的抗氧化劑，用途很廣，可減輕酶的氧化作用，L-histidine 在抗體試劑中，既可作為賦形劑，也可起到抗氧化作用，因為組氨酸能結(jié)合Cu2+等易催化抗體蛋白發(fā)生氧化修飾的金屬離子［20-21］。

本研究發(fā)現(xiàn)，D 液配方［Tris（50 mmol／L）+ 牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化鈉（150 mmol／L）+L-AscorbicAcid（1mmol／L）+L-methionine（5mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+酪蛋白酸鈉（1%，g／100 mL）+氯化鋅（0.1 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）］保存混合酶標(biāo)抗體的穩(wěn)定性最好，在37 ℃條件下保存10周，HRP偶聯(lián)二抗和AP偶聯(lián)二抗的工作液效價最高，HRP 和AP 的活性剩余比率分別為93.46%和96.07%，IHC結(jié)果無明顯改變。綜合分析，此配方可延長試劑中酶及其標(biāo)記抗體的保存期限，滿足酶標(biāo)混合二抗作為體外診斷試劑盒組分之一的需求。