張方方，邢銀英，張碧宇，張亮，周建峰

（1.溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江 溫州，325000; 2.溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院，浙江 溫州，325000）

0 引 言

盲樣考核是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，確保日常檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性必須運(yùn)行的一項(xiàng)重要質(zhì)量控制活動(dòng)[1-2]，是中國(guó)計(jì)量認(rèn)證和中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)證評(píng)審的重要內(nèi)容，也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段[3-6]。乳粉是最常見的乳制品之一，目前乳粉中黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1)的常用檢測(cè)方法主要依據(jù)為GB 5009.24-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M 族的測(cè)定》中的第一法“同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”。

為了最大限度地控制Aflatoxin M1的攝入量，我國(guó)及世界上其他許多國(guó)家制定了乳及乳制品中Aflatoxin M1的限量標(biāo)準(zhǔn)[7-9]。GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[10]規(guī)定，乳及乳制品中Aflatoxin M1限量為0.5 μg/kg。通過此次考核，可以進(jìn)一步加強(qiáng)承檢機(jī)構(gòu)監(jiān)督管理，提升食品抽檢工作質(zhì)量水平，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室提高Aflatoxin M1的檢測(cè)水平和質(zhì)量，保障乳品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6470 LC-MS/MS 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（配ESI 源)，美國(guó)安捷倫公司；賽默飛世爾LP Vprtex Mixer 渦旋振蕩器，美國(guó)賽默飛世爾公司；SIGMA 3K15 冷凍離心機(jī)(轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min），美國(guó)Sigma 公司；氮吹儀，上海安譜科技有限公司；Research Plus 微量移液器，德國(guó)艾本德公司；Millipore 超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；針式濾器(孔徑為0.22 μm）有機(jī)相微孔濾膜，上海安譜科技有限公司。

1.1.2 試劑與耗材

黃曲霉毒素M1(AFT M1)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素M1(13C17-AFT M1)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/mL）、甲醇(色譜純），上海安譜科技有限公司；黃曲霉毒素M1免疫親和柱(AflaStar IAC1005），ROMER 國(guó)際貿(mào)易有限公司；考核盲樣(LH-B01)，由浙江省局食品抽檢監(jiān)測(cè)秘書處；實(shí)驗(yàn)用水由Millipore 超純水處理系統(tǒng)制備。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前處理

稱取1 g 樣品(精確到0.001 g) 于50 mL 離心管中，加入13C17- Aflatoxin M1內(nèi)標(biāo)溶液振蕩混勻后靜置30 min，加入4 mL 50 ℃熱水，渦旋混勻。待樣液冷卻至20 ℃后，加入10 mL 甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min 下離心10 min。將7 mL 上清液或?yàn)V液轉(zhuǎn)移至燒杯中，加40 mL 水稀釋，備用。將低溫下保存的AflaStar IAC1005 黃曲霉毒素M1免疫親和柱恢復(fù)至室溫后，將上述混合液體倒入。用10 mL 去離子水緩沖液淋洗免疫親和柱，去離子水淋洗完后將柱體壓干。用2×1.0 mL 純甲醇洗脫免疫親和柱，收集洗脫液，將洗脫液于50 ℃條件下氮?dú)獯抵两?，用初始流?dòng)相定容至1.0 mL，渦旋30 s 溶解殘留物，0.22 μm濾器過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

圖1 黃曲霉毒素M1 免疫親和柱操作示意

1.2.2 色譜條件

色譜柱型號(hào)：Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，美國(guó)安捷倫公司；液相流速：0.2 mL/min；柱溫箱溫度：35 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：水(含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨)；梯度洗脫比例為：0~0.1 min，10%A~10%A；0.1~2.0 min,10%A~40%A；2.0~4.0 min，40%A~70%A；4.0~4.1 min，70%A~ 90%A；4.1~6.0 min，90%。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI 電離源，正離子模式，離子源溫度350 ℃，質(zhì)譜毛細(xì)管電壓4 500 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：310.26 ka；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，監(jiān)測(cè)參數(shù)如表1 所示。

表1 黃曲霉毒素M1 和13C17-黃曲霉毒素M1 質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取10 μg/mL AFT M1標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 于10 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得到100 ng/mL的AFT M1標(biāo)準(zhǔn)工作液。取AFT M1同位素內(nèi)標(biāo)(0.5 μg/mL)250 μL，用乙腈稀釋至25 mL，得到5.0 ng/mL 的13C17-AFTM1標(biāo)準(zhǔn)液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取AFT M1標(biāo)準(zhǔn)工作液20、40、60、80、100 μL 至10 mL 容量瓶中，加入500 μL 5.0 ng/mL 的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相定容至刻度，配制AFT M1的濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5 質(zhì)量控制措施

根據(jù)《乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書》的內(nèi)容說明，此次提供的能力驗(yàn)證樣品為乳粉樣品，凈重約10 g。為確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.24—2016，制定以下質(zhì)量控制措施：測(cè)試樣品的含量水平、空白樣品加標(biāo)回收、人員平行比對(duì)（因?yàn)榇舜蚊涌己说臅r(shí)間原因，實(shí)驗(yàn)室未能及時(shí)配備乳粉黃曲霉毒素M1的質(zhì)控樣進(jìn)行質(zhì)量控制）。（1）測(cè)試樣品的含量水平。由于作業(yè)指導(dǎo)書沒有明確樣品含量水平，所以實(shí)驗(yàn)先初步測(cè)試樣品含量水平，再根據(jù)該水平配制合適的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）空白樣品加標(biāo)。在確定樣品含量水平后，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行同等水平的樣品濃度添加回收平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)回收水平。（3）人員平行比對(duì)。實(shí)驗(yàn)中以2 名檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)較為豐富的檢測(cè)員同時(shí)開展盲樣考核實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)，以此考核人員的檢測(cè)能力[11-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍確定

根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.24—2016，對(duì)盲樣(LHB01) 進(jìn)行測(cè)試，盲樣中AFT M1含量在0.6 μg/kg 水平，對(duì)應(yīng)的待測(cè)液濃度為0.3 ng/mL。為確保能夠準(zhǔn)確有效校正待測(cè)物，本實(shí)驗(yàn)配制了0.2 ~1.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，線性方程為：y=1.606907x-0.038098，R2=0.9996，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)TIC MRM 圖和系列標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2 和圖3 所示。

圖2 黃曲霉毒素M1 MRM

圖3 黃曲霉毒素M1 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 盲樣考核結(jié)果

分別稱取平行盲樣(LH-B01)，按照GB 5009.24—2016 以及黃曲霉毒素M1免疫親和柱要求開展實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)和空白加標(biāo)回收平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表2 所示。由測(cè)定數(shù)據(jù)分析得出，測(cè)定結(jié)果精密度和RSD 均小于10%，兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值為1.1%，符合要求。由于I 組與II 組相比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密度前者為0.16%< 3.04%，且RSD 為0.9%<5.2%，平均回收率良好。依據(jù)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析，I組的數(shù)據(jù)可靠性較好，按照作業(yè)指導(dǎo)書保留3 位有效數(shù)字要求，本實(shí)驗(yàn)室選取I 組的數(shù)據(jù)“黃曲霉毒素M1含量為0.618 μg/kg”，作為此次盲樣考核的最終結(jié)果上報(bào)。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分析

本次盲樣考核要求參加實(shí)驗(yàn)室為25 家，黃曲霉毒素M1考核項(xiàng)目的實(shí)際參加實(shí)驗(yàn)室為21 家，本實(shí)驗(yàn)室黃曲霉毒素M1的考核Z 值為“-0.9”，結(jié)果滿意，其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果如表3 所示。本次盲樣考核評(píng)價(jià)以組織方確認(rèn)的樣品指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)參加實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行判定，判定結(jié)果分為通過和不通過 (包括不滿意和可疑)。評(píng)判的參數(shù)為實(shí)驗(yàn)室間Z值，Z 值大小體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與中位值的偏離程度，Z 值“＋”、“－”表明結(jié)果偏離方向，|Z|≤2.0 為滿意，2.0＜|Z|＜3.0 為可疑結(jié)果，|Z|≥3.0 為不滿意(離群)結(jié)果[15]。

表3 實(shí)驗(yàn)室間黃曲霉毒素M1 考核評(píng)價(jià)結(jié)果

3 結(jié) 論

從實(shí)驗(yàn)室結(jié)果統(tǒng)計(jì)看出，參加黃曲霉毒素M1考核的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果均為滿意，但是分析結(jié)果均存在負(fù)偏離。此次實(shí)驗(yàn)的前處理包括試劑提取、過柱凈化、濃縮步驟，產(chǎn)生測(cè)量值呈負(fù)偏離的因素可能在于13C17-AFT M1作為待測(cè)物內(nèi)標(biāo)為實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)添加，而AFT M1在乳品中可能為穩(wěn)定結(jié)合存在，兩者在提取率上存在一定差別，測(cè)定時(shí)應(yīng)盡可能提取充分；由于黃曲霉毒素M1免疫親和柱的特殊性，盡量按照其說明進(jìn)行活化、吸附和洗脫，減少待測(cè)物的流失或者洗脫不充分因素；在濃縮定容時(shí)，盡量按要求保持恒溫進(jìn)行氮吹，避免待測(cè)物因溫度等原因影響回收結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)室在此次盲樣考核中取得了滿意結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室中的人員檢測(cè)能力、設(shè)備性能和涉及的耗材試劑有效性也均得到了確認(rèn)，這不僅是對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)工作經(jīng)驗(yàn)開展的一次總結(jié)，也是對(duì)實(shí)驗(yàn)室自身檢測(cè)水平的提升。為今后自身的檢測(cè)工作和其他盲樣考核、能力驗(yàn)證工作提供了參照，也為其他食品實(shí)驗(yàn)室的同行檢測(cè)人員提供盲樣考核和能力驗(yàn)證的方案提供了借鑒。