劉景，徐振波

（豐益（上海）生物技術研發(fā)中心有限公司，上海 200137）

0 引 言

發(fā)酵黃油 (fermented butter/sour butter/cultured butter)也稱為酸黃油，是經(jīng)過乳酸菌等菌種發(fā)酵而制成的黃油，因其豐富的風味和令人愉悅的口感深受消費者喜愛，近年在中國隨著烘焙產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展也越來越被人們所熟悉。發(fā)酵黃油中一系列風味相關化合物對人體嗅覺、味覺和化學感覺（或三叉神經(jīng)）刺激的綜合感知，就是我們所感知到的發(fā)酵黃油風味。在關于發(fā)酵黃油的質(zhì)量評價中，風味是其中一個重要因素。

與普通黃油相比，發(fā)酵黃油具有更濃郁的風味、以及更豐富的風味層次。這些風味一部分來源于高含量乳脂所帶來的揮發(fā)性成分，另一方面，發(fā)酵工藝也產(chǎn)生了諸如酸類、醛類、酮類、酯類等多種重要的風味化合物，這些化合物的共同作用令黃油自帶一種發(fā)酵香氣，并且風味相比未發(fā)酵黃油更為濃郁飽滿。

目前在黃油中已鑒定出幾百種揮發(fā)性化合物，但其中只有少數(shù)幾種被報道證實與黃油的特征香氣有聯(lián)系。如具有水果和奶油特征風味的內(nèi)酯，以及具有玉米和大蒜氣味的含硫化合物[1-2]。與未發(fā)酵黃油不同的是，發(fā)酵黃油則通常以其強烈的雙乙酰味道為特征[3]。除了對特征或關鍵風味及風味物質(zhì)的報道，目前針對發(fā)酵黃油整體風味化合物及其相關代謝、以及風味化合物對風味作用等的系統(tǒng)性研究較為缺乏。本文將綜述以上問題，對近年來發(fā)酵黃油及風味相關研究進展作逐一介紹。

1 發(fā)酵黃油中的主要代謝過程

發(fā)酵黃油是經(jīng)過發(fā)酵工藝步驟制得的黃油，屬于黃油中一種特殊的品類。由于發(fā)酵培養(yǎng)通常會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，發(fā)酵黃油也叫酸黃油（或培養(yǎng)黃油）；相對地，未發(fā)酵黃油通常也稱為甜黃油。發(fā)酵黃油的主要制作流程見圖1，包括脂肪分離、殺菌、接種、發(fā)酵、相轉(zhuǎn)換、壓煉等過程。其中核心工藝是發(fā)酵步驟。接種后的細菌發(fā)酵劑在合適的工藝條件下通過一系列反應將底物轉(zhuǎn)化為多種風味化合物，例如將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸、脂肪轉(zhuǎn)化為中短鏈脂肪酸等。

發(fā)酵黃油中的代謝根據(jù)不同的底物類型主要可分為碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)的代謝。這些底物經(jīng)過包括乳酸菌在內(nèi)的一種或幾種微生物代謝初步降解為丙酮酸、脂肪酸、氨基酸等中間產(chǎn)物，再經(jīng)過一系列酶參與下的反應途徑，最后形成酸、酮、醛、內(nèi)酯等多種風味化合物，如圖2 所示。

圖2 發(fā)酵黃油底物及其風味化合物降解途徑

1.1 碳水化合物代謝

通常情況下，發(fā)酵黃油的底物稀奶油中含有2.0%～3.0%的碳水化合物，其中大部分是乳糖。在通常的發(fā)酵條件下，乳糖被乳酸菌等發(fā)酵菌種迅速分解為半乳糖等單糖后，再進入下一步降解。對比發(fā)酵黃油中可能使用的幾種菌種代謝乳糖過程中的運輸、代謝和調(diào)節(jié)表現(xiàn)，表1 總結(jié)了常見發(fā)酵菌種一些乳糖代謝途徑的特性。乳酸菌可以在NADH 氧化酶和丙酮酸氧化酶介導的反應中利用氧氣，通過丙酮酸脫氫酶-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶-乙酸激酶[4]或丙酮酸酶-乙酸酶途徑[5]，形成包括H2O2在內(nèi)的中間產(chǎn)物和額外的ATP。目前，乳酸菌中糖酵解的控制和調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚，乳酸菌對糖酵解速率的控制并不只是基于單一酶類、糖轉(zhuǎn)運或完全依賴ATP，更有可能是包括以上幾種機制的共同作用。

表1 發(fā)酵黃油中常見菌種乳糖代謝的特點

發(fā)酵黃油中另一類重要的糖類代謝是檸檬酸途徑，這條途徑與風味密切相關。其過程可簡要描述為：檸檬酸鹽在檸檬酸裂解酶的作用下產(chǎn)生乙酸鹽和草酸鹽，草酸鹽脫羧酶將后者脫羧為丙酮酸鹽和CO2；生成的丙酮酸鹽與另一個丙酮酸分子縮合形成α-乙酰乳酸和CO2；中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸可以通過化學方式自發(fā)降解為雙乙酰，或通過酶降解為乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）。其中雙乙酰、乙醛等直接影響風味的形成，而乙偶姻作為雙乙酰的前體則對風味產(chǎn)生間接影響。一些商業(yè)菌種具有良好的檸檬酸鹽代謝能力，如明串珠菌屬和乳酸乳球菌某些亞種等，通過代謝檸檬酸鹽形成雙乙酰而提供奶油風味（buttery）。它們作為風味的主要貢獻菌，通常與中溫產(chǎn)酸菌株（如乳球菌）結(jié)合使用[6]。這些具備產(chǎn)雙乙酰能力的菌種在奶酪、發(fā)酵黃油和酸奶等發(fā)酵乳制品中具有非常重要的作用[7]，有助于發(fā)酵乳制品產(chǎn)生濃郁飽滿的風味。由于檸檬酸途徑在工業(yè)，特別是風味上的重要性[8]，人們非常重視代謝工程策略，以增強檸檬酸鹽代謝，并將其導向特定終產(chǎn)物（尤其是雙乙酰）含量的增加[9-10]。

1.2 脂類代謝

基于含量的優(yōu)勢，脂類是黃油在發(fā)酵過程中最主要的底物。黃油中的脂質(zhì)首先會發(fā)生氧化或水解。甘油三酯酶解（脂解）為游離脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA）和甘油、單甘油三酸酯或雙甘油三醇，其中FFA 被認為是風味演化的關鍵。因具有疏水性，脂質(zhì)既是風味化合物的優(yōu)良載體，也是許多風味化合物的前體。脂肪分解和脂肪酸分解代謝是發(fā)酵過程的關鍵之一，產(chǎn)生的風味化合物在許多發(fā)酵乳制品中都很重要[11]。另外，由于人類口腔對脂類代謝物的敏感性，脂肪在發(fā)酵乳制品風味質(zhì)量上也有一定的指示作用[12]。比如，在脂肪分解水平較低的黃油或無水黃油中，F(xiàn)FA 也會被感知；并具體根據(jù)FFA 的濃度和風味特征，判斷可預期的風味平衡或風味缺陷[13]。

盡管脂解非常重要，但其機制中所涉及的酶及酶活性的主要影響因素仍未明確。基因組測序為乳制品相關微生物中存在的潛在酯酶提供了分子層面的全新見解，但對乳脂的特異性活性仍然需要使用生化方法進行研究[14]。另一方面，現(xiàn)有乳制品中關于脂肪酸分解代謝途徑的研究集中于干酪發(fā)酵劑的活性，人們因此更好理解和控制各類發(fā)酵乳制品中游離脂肪酸衍生風味化合物的形成[15-16]。這些研究結(jié)果可作為發(fā)酵黃油風味相關脂類及脂肪酸代謝的重要參考。

1.3 蛋白質(zhì)代謝

蛋白質(zhì)水解是乳制品中研究最廣泛的生化變化。黃油中通常含有2%左右的蛋白質(zhì)，盡管含量不高，但發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)水解是發(fā)酵黃油產(chǎn)品風味形成的基礎。在發(fā)酵黃油的生產(chǎn)過程中，在各種蛋白水解酶的共同作用下，酪蛋白逐漸分解。不同途徑的蛋白質(zhì)降解為不同的氨基酸，并進一步分解釋放具有各異風味特性的短肽。這些酶包括乳內(nèi)源酶（如纖溶酶、組織蛋白酶）、發(fā)酵劑產(chǎn)生的細胞膜相關蛋白酶以及肽酶等。

蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物本身（即肽和游離氨基酸）對發(fā)酵黃油風味的影響更多體現(xiàn)在“背景”風味方面，某些情況下可能與一些異味（如苦味）相關[17]。比如，游離氨基酸作為一系列分解代謝反應產(chǎn)生的揮發(fā)性風味化合物的前體，雖然沒有直接產(chǎn)生香氣，但因為酪蛋白產(chǎn)生氨基酸釋放速率的增加可激發(fā)發(fā)酵微生物，為其提供多種代謝物前體，因此在香氣形成中起著至關重要的作用。另一方面蛋白質(zhì)水解也可能為幾種替代途徑中酶的合成提供必要氨基酸[18]。因此，蛋白質(zhì)的代謝有助于構建發(fā)酵黃油的良好香氣和風味的框架背景。

2 發(fā)酵黃油的風味化合物

2.1 脂肪酸

發(fā)酵黃油含有高達80%以上的脂肪，乳脂肪在脂肪酶作用下發(fā)生降解。其中，甘油三酯（占乳脂的98%以上）的水解是乳脂最主要的生化轉(zhuǎn)化，該反應會產(chǎn)生游離脂肪酸（FFA）、二甘酯、單甘酯，以及可能的甘油等。其中，游離脂肪酸類對發(fā)酵黃油風味有重要貢獻。

低分子脂肪酸，如乙酸和丁酸，除本身具有酸味外，也是風味活性化合物。與乙酸類似，丁酸也是乳糖發(fā)酵的產(chǎn)物。而一些中短鏈脂肪酸，尤其是C4∶0 和C12∶0 之間的FFA，具有特征性風味，如酸味、尖銳味、山羊味、肥皂味，椰子味等。FFA 的風味強度不僅取決于含量濃度，還取決于其在水相和脂肪相之間的分布、介質(zhì)的pH 值、某些陽離子（例如Na+、Ca2+）的存在以及蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物等多種因素[19]。

另一方面，脂肪酸也是多種風味物的前體物質(zhì)，涉及了多種風味相關化合物的反應途徑如圖3 所示。比如，中鏈脂肪酸（主要從C6∶0 到C12∶0）氧化為β-酮酸，經(jīng)過脫羧反應生成相應少一個碳原子的甲基酮，再進一步生成二級醇；某些不飽和脂肪酸會氧化生成氫過氧化物，在酶的作用下生成醛類，進而氧化成酸或者醇?？梢哉f，脂肪酸的代謝會影響大部分其他風味化合物（如酮、醛、酸、醇、內(nèi)酯等）的生成。因此，脂肪酸類是研究發(fā)酵黃油風味最重要的物質(zhì)之一。

圖3 發(fā)酵黃油中的脂類代謝

2.2 羰基化合物

發(fā)酵黃油中常見與風味相關的的羰基化合物主要是酮、醛等化合物。酮是一種羰基分子（=C=O），是發(fā)酵黃油最重要的風味化合物之一。發(fā)酵黃油中酮的來源主要有3 種：不飽和脂肪酸降解、氨基酸降解或發(fā)酵微生物代謝。微生物代謝是其中最主要的途徑。脂肪被菌種代謝降解為脂肪酸后氧化生成β-酮酸、進一步通過脫羧反應形成酮類化合物。酮類化合物大多數(shù)都具有特殊香氣，且閾值較低（濃度一般為μg/L）。比如，雙乙酰（2,3-丁二酮）是發(fā)酵乳制品風味形成的關鍵芳香化合物，其風味特征是特殊的奶油香氣；2-壬酮則能賦予發(fā)酵乳制品奶油味和水果香味[20]。另外有報道指出，含有黃油的烘焙食品的主體風味成分是甲基酮[21]。甲基酮的前體以酮酸形式存在于新鮮黃油中，受熱后即轉(zhuǎn)化為甲基酮，甲基酮是含有黃油的熟食和加熱食品中的主要的揮發(fā)性風味化合物。

2.3 內(nèi)酯

內(nèi)酯是由γ-和δ-羥基酸與相應的醇結(jié)合而成的內(nèi)部形成的環(huán)狀酯，通常具有廣泛的風味特征，包括黃油味、椰子味、奶油味、水果味、堅果味、甜味等。游離態(tài)內(nèi)酯是黃油的主要揮發(fā)性成分，而使用這些黃油產(chǎn)品制成的糕點或烘焙食品也因此具有這些特征性風味。乳制品中的內(nèi)酯大部分是偶數(shù)碳原子數(shù)，如δ-己內(nèi)酯[22]等。在未發(fā)酵黃油（甜黃油）中報道的一些內(nèi)酯包括δ-辛內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯和γ-十二內(nèi)酯等[23]。其中δ-己內(nèi)酯和γ-十二內(nèi)酯分別有奶油和類似桃子的氣味；而δ-十內(nèi)酯具有一種非常強烈的氣味和奶油味，濃度小于5×10-6g/L。它也是香料行業(yè)的關鍵內(nèi)酯，廣泛應用于乳品和水果香精。

另外，內(nèi)酯前體也會間接影響風味，特別是當黃油作為烘焙或烹飪原料時。發(fā)酵黃油中含有的無味內(nèi)酯前體羥基酸，在溫度升高的影響下會發(fā)生自動重排，轉(zhuǎn)化成為風味明顯的γ-內(nèi)酯和δ-內(nèi)酯，并緩慢釋放[21，24]。而乳脂特定的熔融特性又會影響這種釋放速率，從而影響整體風味輪廓。這種特殊的風味轉(zhuǎn)化與釋放特征也是迄今為止無法通過在人造黃油中加入合成香味物質(zhì)來達到天然黃油感官質(zhì)量的重要原因之一。

2.4 含硫化合物

發(fā)酵黃油的揮發(fā)性成分中通常含有多種含硫化合物，如甲硫醇、硫化氫、二甲基硫醚、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、二甲四硫化物等。目前這些已知含硫化合物來源于蛋氨酸Met，通過一系列氧化還原及酶作用，生成甲基硫后，再經(jīng)過氧化產(chǎn)生各種硫化物。這些硫化物大多具有洋蔥風味特征，均有助于形成復雜的香氣[25]。此外，Shooter 等[26]經(jīng)過對黃油中揮發(fā)性硫化合物的選擇性研究，發(fā)現(xiàn)由于不同季節(jié)牧草成分的變化，春季黃油中的甲硫醇和二甲基二硫化物濃度增加，而在儲存期這些化合物又會顯著減少；含硫化合物的變化可能是不同的牧場環(huán)境或牧草影響黃油風味的主要原因之一。

2.5 滋味相關化合物

乳制品的風味包括氣味和滋味。氣味由揮發(fā)性風味化合物經(jīng)由鼻腔感知，而滋味則多為不揮發(fā)風味化合物，入口后主要在口腔中被感知。兩者比例約為75∶25。因此，除了氣味之外，滋味對風味也有重要作用。在發(fā)酵黃油中，涉及的滋味化合物主要包括氨基酸、有機酸、低分子量肽和水溶性礦物鹽等。其中，氨基酸和小肽（300～400 u）的濃度如果超過感官閾值，可能會導致苦味、鮮味等異味[27]。

3 發(fā)酵黃油風味相關研究進展

3.1 風味化合物的保留特性及相互作用

發(fā)酵黃油基質(zhì)的復雜性決定了對風味的研究必須考慮到大分子之間的相互作用。揮發(fā)性風味化合物從基質(zhì)到空氣中的釋放特性很大程度上取決于它們與食物基質(zhì)中存在的非揮發(fā)性化合物的相互作用[28-29]。不同大分子的性質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和水膠體等）和數(shù)量，都會影響香氣的釋放[30]。目前發(fā)酵黃油中缺乏針對風味化合物互作的研究，公開發(fā)表的相關文獻一般涉及人造奶油[31]、奶油[32]、奶酪[33-34]等固體乳制品或者油-水等理論模型[35-36]。

脂質(zhì)是與風味相關關鍵香氣的形成基質(zhì)和保留劑，同時也是對疏水揮發(fā)性化合物在介質(zhì)和空氣中的分配影響最大的食品成分[37]。這一點在脂肪含量較高的乳制品中現(xiàn)象更為明顯。比如天然奶酪中通常含有20%～30%以上的脂質(zhì)，Lauverjat 等[38]通過增加脂肪含量，觀察到風味物質(zhì)中己酸乙酯的空氣-食品介質(zhì)分配系數(shù)和擴散系數(shù)均有降低；而對于雙乙酰則觀察不到任何影響。造成這個現(xiàn)象的原因就是這兩種化合物在油相介質(zhì)中具有完全不同的分配系數(shù)。此外，脂肪含量的改變也會影響脂肪/蛋白質(zhì)的比例，這將強烈影響乳制品的微觀結(jié)構[39]，從而進一步影響其中香味化合物的釋放。

關于蛋白質(zhì)對乳制品香氣釋放的影響，有一些研究表明[40]，與平衡狀態(tài)下靜態(tài)頂空測量的外部研究相比，乳制品中實際蛋白質(zhì)對香味物質(zhì)的保留較少。這可以用芳香化合物和蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用來解釋。在這些互作機制下，蛋白質(zhì)不僅釋放了游離醛，還釋放了部分結(jié)合醛。

Boisard 等[41]研究了鹽、蛋白質(zhì)和脂肪對內(nèi)部香氣釋放的聯(lián)合效應。由于分子相互作用，蛋白質(zhì)含量的增加降低了強疏水性化合物壬烷-2-酮的釋放速率。在奶酪模型中添加鹽會導致酮的香氣釋放速率顯著增加，但雙乙酰則沒有影響。如果奶酪在水相中的含鹽量較高，將會觸發(fā)香氣更快速地從蛋白質(zhì)相釋放到口腔、鼻腔，從而導致更高的釋放速率。

另外，基質(zhì)中大分子降解的中間產(chǎn)物（如脂質(zhì)等）也可能會直接或間接影響風味化合物。比如一項對烤羊肉脂質(zhì)及風味的研究[42]就發(fā)現(xiàn)，兩類甘油三酯TG（16∶0_18∶1_18∶1）和TG（18∶0_18∶0_18∶1）可能是結(jié)合芳香化合物的主要脂質(zhì)。特異性脂質(zhì)中的磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），則主要有助于芳香化合物的形成。

另外，發(fā)酵黃油中涉及鼻受體的芳香化合物主要是脂溶性的，不僅來源于脂質(zhì)分解，還來源于氨基酸和碳水化合物的分解代謝。這些化合物在不同種類的發(fā)酵黃油中以不同的組合形成風味。這種風味在一些具有特殊原料或工藝、或者發(fā)酵周期較長的發(fā)酵黃油中非常復雜，如北非地區(qū)發(fā)酵黃油smen[43]、土耳其發(fā)酵黃油yayik[44]、印度黃油類發(fā)酵乳制品makkhan[45-46]等。目前對這些特殊種類發(fā)酵黃油的風味研究尚未開展風味化合物互作層面的深入研究。

3.2 近年發(fā)酵黃油風味相關研究進展

總結(jié)近8 年（2014～2022 年）以來一些公開發(fā)表對發(fā)酵黃油風味的研究，涉及關鍵風味物質(zhì)（key aroma compounds）或香氣活性物質(zhì)（aroma-active compounds），結(jié)果見表2。

隨著科學分析儀器和方法的快速進步，對發(fā)酵黃油風味研究的廣度和深度在擴大，取得的進展也更為廣泛和深入。比如，Mallia 等[47]針對發(fā)酵黃油風味化合物中的某一類特定化合物—含硫化合物進行單獨的具體研究，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性硫化物的濃度會影響其最終風味。更多研究則借助化學統(tǒng)計方法和軟件工具（如SPSS、heatmap 等），對數(shù)量龐大的風味檢測數(shù)據(jù)進行深入的數(shù)據(jù)分析，深入探索風味化合物與風味特征的聯(lián)系，并從統(tǒng)計學角度研究它們與發(fā)酵菌株、工藝條件等風味影響因素之間的關系與相互作用[48-50]。

另一方面，除了對不同國家（地區(qū)）、不同動物來源發(fā)酵黃油的風味差異分析之外，不少研究傾向于傳統(tǒng)工藝或者地域特定的某一類發(fā)酵黃油，如北非地區(qū)手工制作的發(fā)酵黃油”smen”。這種傳統(tǒng)發(fā)酵黃油使用天然發(fā)酵的混合菌種，且成熟時間較長（1～12 個月），具有較為多元的微生物多樣性及豐富風味，因此成為近年來黃油領域的研究熱點，圍繞其開展關于工藝、菌種、理化特性等公開發(fā)表的論文也不斷出現(xiàn)[43，48，50-51]。通過對這些地域性特殊發(fā)酵黃油的研究，深入分析對特征性風味物質(zhì)（群）和關鍵微生物、關鍵工藝技術之間關系的研究，可能是未來提高發(fā)酵黃油風味、質(zhì)量以及生產(chǎn)效率的突破性窗口。

4 結(jié)果與展望

綜上所述，發(fā)酵黃油的豐富風味主要是由發(fā)酵菌株代謝產(chǎn)生的，是包含酸、酮、醛、內(nèi)酯、硫化物等多種風味化合物不斷變化、相互影響、共同作用的一個動態(tài)結(jié)果。其中，脂肪酸類的代謝不僅以最終產(chǎn)物游離脂肪酸的形式直接影響發(fā)酵黃油的風味，而且還作為中間產(chǎn)物參與諸如酸、醛等風味物質(zhì)的代謝過程，是發(fā)酵黃油中最重要的風味相關化合物。檢測方法和分析工具的迭代進步有助于發(fā)酵黃油風味研究的快速發(fā)展。近年來針對地域性特殊發(fā)酵黃油的風味分析研究相對較多，但放眼整個乳制品領域，目前對發(fā)酵黃油風味的研究還沒有形成熱點。展望未來發(fā)酵黃油風味研究的趨勢，可能會從以下幾個方面取得突破：(1)關鍵發(fā)酵微生物及其代謝特性，尤其是特殊類型或地域性發(fā)酵黃油；(2)芳香化合物與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子及其次級降解產(chǎn)物的相互作用；(3)風味化合物在高脂基質(zhì)中分布的特性研究，以及發(fā)酵過程對于黃油結(jié)構的衍生影響；(4)結(jié)合應用（如烘焙過程）開展的風味變化研究及相應的生產(chǎn)技術改良等。