馬躍龍，張益萍，褚佳玥

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,國家市場監(jiān)管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)），上海 200233）

0 引 言

乳制品營養(yǎng)豐富，含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)、乳糖、多種維生素及礦物質(zhì)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，我國2021 年奶類消費量達到了42.3 kg/人的水平[3]。乳糖是適合人體的碳水化合物，占母乳的7.2%，占牛奶的4.7 %。我國嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品的國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，乳糖含量需達到碳水化合物總量的90%以上。β-半乳糖苷酶（乳糖酶），主要功能為促進乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖[4-5]。當(dāng)人體缺乏乳糖酶時，消化乳糖的功能會受限，較嚴(yán)重時會出現(xiàn)乳糖不耐癥[5-7]。乳糖酶缺乏有3種類型：遺傳型、繼發(fā)型、成人型，其中成人型最為普遍[9]，大多數(shù)人在斷奶后會逐漸停止產(chǎn)生乳糖酶[5]。乳糖酶缺乏發(fā)病率因地區(qū)人種而異，亞洲、非洲地區(qū)高于歐美國家[8]。

應(yīng)對乳糖酶缺乏可以采取兩種方式：食用無乳糖乳制品[9-10]或?qū)⑼庠葱匀樘敲鸽S乳制品一起攝入。乳制品去除乳糖存在幾個弊端：可能導(dǎo)致其他營養(yǎng)成分被破壞[10]、影響嬰幼兒鈣質(zhì)吸收[11]、價格通常較高。因酸性乳糖酶更適合于人體，通常被選作外源性乳糖酶來源[1]。孟祥輝[12]的研究結(jié)果顯示，補充外源性乳糖酶的方法治療乳糖不耐癥的效果顯著。王麗[13]等研究發(fā)現(xiàn)，乳糖酶能夠顯著改善乳糖不耐受癥狀，使患兒獲得較好的體重增長。石壯[14]研究結(jié)論認為，補充外源性乳糖酶的方式，各項臨床癥狀均優(yōu)于食用無乳糖奶粉，并且顯著改善患者體內(nèi)的微量元素水平。

隨著添加乳糖酶的食品越來越多，其中以調(diào)制乳粉最為流行，廠家爭相將乳糖酶活力標(biāo)注于產(chǎn)品標(biāo)簽作為賣點，但是，未檢索到食品中乳糖酶活力的測定方法。文獻報道關(guān)于乳糖酶的檢測方法大多為熒光探針法[15-21]，也有納米顆粒探針法[22]、化學(xué)發(fā)光法探針法[23]、電化學(xué)法[24]、拉曼散射法[25]、磁共振法[26]等，主要用于探測人體或動植物組織中微量乳糖酶活力，檢出限較低，但線性范圍具有一定局限性，儀器成本較高。有報道基于水相的分光光度法和雙酶法測定乳糖酶制劑活力[27-28]。其中何云山等[27]指出，雙酶法測定乳糖酶制劑中的乳糖酶活力的精密度較差。Sylwia Chojnowska 等[29]使用4-硝基苯酚作為底物，利用分光光度法測定溶血血清中的乳糖酶活力，指出血紅蛋白對測定結(jié)果有一定影響。

分光光度法因經(jīng)濟、便捷被實驗室所青睞。本研究針對適用于人體的酸性乳糖酶進行研究，開發(fā)了基于水-甲醇體系的分光光度法測定調(diào)制乳粉中乳糖酶活力測定方法，并對開發(fā)的方法進行了方法學(xué)驗證。相較于水體系，提高了反應(yīng)的靈敏度，可以排除調(diào)制乳粉中雜質(zhì)的干擾，為調(diào)制乳粉中乳糖酶活力的準(zhǔn)確標(biāo)注及產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

3900H 型UV-Vis 紫外分光光度計，日本Hitachi公司；S220-K 型pH 計、XPE204 型分析電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Eppendorf Centrifuge 5804 高速離心機，德國Eppendorf 公司；Lauda Proline RP845型超級恒溫器，德國Lauda 公司；渦旋震蕩器，德國Heidolph 公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（分析純），上海普譽；鄰硝基苯酚（ONP）（純度≥99 %），美國Sigma-Aldrich公司；乳糖酶（來源于米曲霉，酶活力1.2×106U/g），中諾生物科技發(fā)展江蘇有限公司；甲醇、無水乙醇、乙酸、氫氧化鈉、碳酸鈉（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 ONPG 法測定乳糖酶活力機理

鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG）由鄰硝基苯酚和半乳糖縮合而成，分子結(jié)構(gòu)與乳糖類似，不同之處為用鄰硝基苯酚的基團取代葡萄糖基團。采用ONPG 作為底物，在乳糖酶的作用下，水解生成鄰硝基苯酚（ONP）和半乳糖，加入碳酸鈉將反應(yīng)體系溶液變?yōu)閴A性，終止反應(yīng)。ONP 在堿性條件下顯色，具有特征吸收波長，通過分光光度法測定其吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法測定鄰硝基苯酚含量，計算β-D-半乳糖苷酶的酶活力。乳糖酶水解乳糖及ONPG 機理如圖1所示。

圖1 乳糖酶水解乳糖及ONPG 機理示意圖

1.3 實驗步驟

1.3.1 試劑的配制

1.3.1.1 緩沖液的配制

吸取11.5 mL 冰乙酸，加水至100 mL。稱取4 g氫氧化鈉，溶于25 mL 水中。將50 mL 冰乙酸溶液與11.5 mL 氫氧化鈉溶液混合，加水至約900 mL。用冰乙酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至4.50±0.02，然后用水定容至1 L。

1.3.1.2 ONPG 底物溶液的配制

稱取0.370 g ONPG，加入pH=4.50 的緩沖液約50 mL，充分?jǐn)嚢枞芙?，繼續(xù)用緩沖液定容至100 mL。該溶液用前配制，在4 h 內(nèi)使用完畢，過時需重新配制。

1.3.2 ONP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取0.139 g ONP，加入10 mL 無水乙醇，充分溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶，并用水定容，其濃度為2 mmol/L，作為儲備液。取適量儲備液，補加水至7.5 mL，加入1 g/100 mL 碳酸鈉溶液2.5 mL，加甲醇定容至25 mL，配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.15 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 測試步驟

稱取1 g 樣品，用緩沖液溶解并定容至50 mL，過濾，稀釋。將稀釋液與ONPG 溶液分別放入37 ℃水浴中恒溫10 min，于0 時刻，吸取0.5 mL 稀釋液及2 mL ONPG 溶液迅速充分混合于25 mL 容量瓶中，置于37 ℃水浴中，計時。至反應(yīng)結(jié)束時刻，迅速加入2.5 mL碳酸鈉溶液，混勻，終止反應(yīng)。加入5 mL 水，用甲醇定容，8 000 r/min 離心5 min 去除沉淀。用1 cm 比色皿測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.3.4 計算方法

根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的測試液中ONP 含量，按式（1）計算樣品中乳糖酶活力。式中C 為測試液中ONP 的含量（mmol/L）；f 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；W 為樣品質(zhì)量（g），t 為反應(yīng)時間（min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件的確定

2.1.1 測定波長的選擇

在文獻報道的采用ONPG 分光光度法測定乳糖酶制劑的酶活方法中，測量波長均選擇為420 nm[28-29]。為確定最優(yōu)的測量波長，分別配制濃度為0.12 mmol/L的ONP 的水溶液和水-甲醇（V∶V=2∶3）溶液進行波長掃描，掃描范圍400~430 nm，結(jié)果如圖2 所示。從圖2 中可以看出，與文獻報道不同，ONP 水溶液的最大吸收峰出現(xiàn)在415 nm 處，而本研究提出使用的水-甲醇體系的最大吸收峰出現(xiàn)在416 nm 處，兩者均與文獻報道的420 nm 有所區(qū)別[27-28]。此外，對比ONP 水溶液及水-甲醇體系溶液波長掃描曲線，可以看出，在相同的ONP 濃度，相同的碳酸鈉含量的條件下，水-甲醇體系的吸光度響應(yīng)值，顯著高于水體系。這意味著，在相同的條件下，水-甲醇體系可以獲得更低的檢出限，在靈敏度方面具有顯著的優(yōu)勢。

圖2 ONP 水溶液及水-甲醇溶液波長掃描圖譜（CONP=0.12 mmol/L）

2.1.2 碳酸鈉溶液濃度的選擇

ONPG 法測定乳糖酶活力，在結(jié)束時加入碳酸鈉，將反應(yīng)體系變?yōu)閺妷A性，具有兩個功能：終止反應(yīng)和使ONP 顯色。ONP 的顯色受pH 值影響，酸性條件下不顯色，中性至堿性條件下顯色，吸光系數(shù)與pH 值有關(guān)。為確定最優(yōu)的碳酸鈉添加量，本研究考察了碳酸鈉添加量對ONP 吸光度的影響。在25 mL容量瓶中，加入1.9 mL 2 mmol/L 的ONP 溶液，補加5.6 mL 水，加入2.5 mL 碳酸鈉溶液（濃度分別為0.01~10 g/100 mL），用甲醇定容至25 mL，于416 nm測定吸光度。進行5 平行試驗，測定結(jié)果如圖3 所示。由結(jié)果分析，水-甲醇體系中，ONPG 在416 nm 下的吸光度總體隨著碳酸鈉濃度的升高而升高，在0.01~0.02 g/100 mL 之間吸光度迅速升高，隨后趨于平緩。碳酸鈉濃度高于2 g/100 mL 以上，有一個小幅度上升的趨勢，濃度進一步升高，吸光度有所下降，且偏差顯著升高。這是因為在添加碳酸鈉的濃度在較低的范圍變化時，給整體溶液帶來的pH 值變化較明顯，隨著濃度升高，pH 變化趨于平緩，從而吸光度變化也隨之減小。當(dāng)碳酸鈉濃度達到5 g/100 mL 時，溶液出現(xiàn)了較明顯的渾濁現(xiàn)象，至10 g/100 mL 時，出現(xiàn)較多的沉淀，這是碳酸鈉溶液在水-甲醇中的溶解度下降引起的。

圖3 添加不同濃度碳酸鈉溶液的ONP 的水-甲醇溶液吸光度(n=5)

碳酸鈉溶液通過改變反應(yīng)體系的pH 值使反應(yīng)終止，同時使ONP 顯色。選擇碳酸鈉濃度變化對吸光度影響較小的濃度范圍，不僅可以避免碳酸鈉濃度偏差對測試結(jié)果的影響，更加提高了該反應(yīng)體系對樣品本身酸堿度及緩沖液的適應(yīng)能力。由圖中可以看出，在碳酸鈉溶液0.5~2 g/100 mL 區(qū)間，吸光度變化對碳酸鈉溶液的變化不敏感，本研究最終選擇碳酸鈉溶液的濃度為1 g/100 mL。

2.1.3 雜質(zhì)的去除

調(diào)制乳粉產(chǎn)品的水溶液呈較穩(wěn)定的懸濁液狀態(tài)，且不可通過過濾、離心等物理方法使其澄清，這一特性是乳粉研發(fā)者所追求的高溶解性的品質(zhì)要求，卻給分光光度法的應(yīng)用帶來困難。在進行吸光度測試前，需要消除懸浮物對吸光度的影響。因乳糖酶本身即為大分子蛋白質(zhì)，如在酶反應(yīng)前進行雜質(zhì)的去除，可能引起乳糖酶同時析出，導(dǎo)致測量結(jié)果偏低。因此本研究選擇反應(yīng)結(jié)束后去除雜質(zhì)的辦法。

因ONPG 方法測定乳糖酶活力的特殊性，反應(yīng)測試目標(biāo)產(chǎn)物ONP 需要在堿性條件下顯色，故相當(dāng)多的雜質(zhì)去除方法如三氯乙酸沉淀法、鹽酸沉淀法、乙酸鋅-亞鐵氰化鉀共沉淀法受到限制。本研究曾嘗試使用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀共沉淀法去除雜質(zhì)，然后使用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至與碳酸鈉溶液等效的強堿性pH 值，雖然可以實現(xiàn)溶液的澄清，但加標(biāo)回收率急劇下降，且測試結(jié)果極不穩(wěn)定。這可能因為亞鐵氰化鉀和乙酸鋅在共沉淀去除其他雜質(zhì)的同時，也將部分ONP 一同去除，導(dǎo)致溶液中ONP 濃度呈現(xiàn)出無規(guī)律的下降。

本研究使用水-甲醇體系，首先使底物ONPG 與樣品中的乳糖酶在水溶液中進行反應(yīng)，加入碳酸鈉溶液使反應(yīng)終止后，加入甲醇，混合后經(jīng)離心去除雜質(zhì)。經(jīng)過實驗證實，當(dāng)水相與甲醇比例為2∶3 時，可以很好地解決雜質(zhì)干擾的去除問題，同時可以提高ONP 的響應(yīng)。典型水體系和水-甲醇體系對同一產(chǎn)品的測試結(jié)果溶液對比如圖4 所示。

圖4 水體系及水-甲醇體系最終比色溶液狀態(tài)對比

2.1.4 反應(yīng)時間的選擇

考察反應(yīng)時間對ONPG 法測定乳糖酶活力測定結(jié)果的影響。選取2 款含乳糖酶的乳粉進行測定，測定時間分別選取5、10、15、20、25、30、40 min，進行7平行試驗，檢測結(jié)果見表1。由表1 可以看出，反應(yīng)時間為5~20 min 時，檢測結(jié)果較穩(wěn)定；反應(yīng)時間為20～40 min 時，檢測結(jié)果有升高的趨勢，這可能是因底物ONPG 在反應(yīng)條件下自行分解引起吸光度上升導(dǎo)致的。當(dāng)反應(yīng)時間為5 min 時，RSD 顯著偏高，這是由于測定的操作過程消耗時間的差別引起的，當(dāng)反應(yīng)時間延長至10 min 時，RSD 顯著降低。

表1 不同反應(yīng)時間調(diào)制乳粉中乳糖酶活力測定結(jié)果（n=7）

適當(dāng)增加反應(yīng)時間，不僅可以減小實驗的相對偏差，還可以一定程度提高方法的響應(yīng)，降低檢出限。ONPG 配制成水溶液后，較容易分解，需在4 h 內(nèi)使用完畢，因此反應(yīng)時間不宜過長。綜合考慮方法的精密度、檢出限、檢測效率等因素，本研究將反應(yīng)時間確定為15 min。

2.1.5 顯色液穩(wěn)定性的確認

本研究使用的水-甲醇反應(yīng)體系，按照2.1.2 的研究結(jié)果，選取的碳酸鈉濃度為1 g/100 mL，減小了碳酸鈉濃度偏差對反應(yīng)結(jié)果精密度的影響。但需考察添加碳酸鈉后對反應(yīng)終止效果和顯色液穩(wěn)定性的評估。選取3 款添加乳糖酶的調(diào)制乳粉進行測試，在反應(yīng)結(jié)束并去除雜質(zhì)后，計時、比色。每隔5 min 進行一次吸光度測試，見表2。由結(jié)果可以看出，加入2.5 mL 1 g/100 mL 的碳酸鈉溶液，可以確保反應(yīng)終止，且顯色液穩(wěn)定性良好。因此，對于反應(yīng)終止后的最終顯色液，吸光度測試時間可以不做嚴(yán)格規(guī)定，30 min 內(nèi)比色可以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。

表2 顯色液吸光度隨時間變化

2.2 方法學(xué)參數(shù)

2.2.1 方法的線性

按照本方法進行測定，配制0.005~0.150 mmol/L的ONP 水-甲醇溶液，測定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，進行線性回歸分析，得線性回歸方程Y=5.1141X+0.0004，R2=0.9997。

2.2.2 方法的檢出限、定量限

分光光度測定方法，以0.010 對應(yīng)的目標(biāo)物含量為檢出限，以3.3 倍的檢出限作為定量限。將吸光度0.010 帶入線性回歸方程，并按式（1）計算酶活力，得本方法檢出限為0.32 U/g，定量限為1.0 U/g。

2.2.3 方法的精密度、回收率

選取3 款經(jīng)測試無乳糖酶活力的調(diào)制乳粉產(chǎn)品，分別進行3 個水平的加標(biāo)回收率測定（n=7）。根據(jù)檢測結(jié)果計算回收率（Recoveries）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviations，RSDs），如表3。本方法加標(biāo)回收率95.0%~98.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.78%~0.98%。

表3 方法的精密度和回收率（n=7）

2.3 實際樣品檢測

按照本研究制定的測定方法，對市場銷售的9 款含乳糖酶的調(diào)制乳粉中乳糖酶活力進行測定，每個產(chǎn)品重復(fù)測定7 次，測定結(jié)果見表4。

表4 實際樣品測定（n=7）

3 結(jié) 論

在我國，因乳糖酶缺乏原因?qū)е氯橹破废芟薜娜巳夯鶖?shù)較大。從營養(yǎng)健康的角度，人們越來越傾向于采用補充外源性乳糖酶的方式來應(yīng)對這一問題，含乳糖酶的調(diào)制乳粉，是一種十分便捷的補充方式。本研究在水體系中ONPG 法測定乳糖酶的方法基礎(chǔ)上，開發(fā)了適用于含乳糖酶調(diào)制乳粉中乳糖酶活力的測試方法。采用水-甲醇體系，不僅可以消除乳粉中多種雜質(zhì)的影響，而且提高了吸光度響應(yīng)。在0.005~0.150 mmol/L 范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)0.9997，線性良好，定量限為1.0 U/g，加標(biāo)回收率在95.0%~98.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.78%~0.98%，可以作為常規(guī)實驗室測定調(diào)制乳粉中乳糖酶活力的經(jīng)濟、可靠的測定方法。