寧淼，賀凱茹，楊慧，樸瑜瓊，李欣霏，姜北辰，包雨飛，武俊瑞,2

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，沈陽市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，沈陽 110866）

0 引 言

熱處理等手段被廣泛的應(yīng)用于牛乳殺菌中。該殺菌工藝對于確保牛奶微生物安全和維持牛奶質(zhì)量至關(guān)重要，但殺菌過程中伴隨著復(fù)雜的物理化學(xué)變化，會不可避免地對乳體系中活性成分的活性、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。雖然之前已有研究證明添加保護(hù)劑可使一些特定物質(zhì)保持生物活性并避免熱處理時失活，但加熱必然導(dǎo)致活性的變化，進(jìn)而影響其對乳制品的功能作用[1]。因此，研究熱處理對乳中生物活性物質(zhì)的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

1 牛乳中的生物活性物質(zhì)及其功能

1.1 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（lactoferrin, LF）由鐵和糖蛋白復(fù)合而成，當(dāng)乳鐵蛋白含鐵量低于5%時，屬于缺鐵型乳鐵蛋白（apo-LF）；當(dāng)乳鐵蛋白含鐵量高于85%時，則屬于鐵飽和乳鐵蛋白（holo-LF）。乳鐵蛋白作為功能性成分，常被用于酸奶，嬰兒配方奶粉以及膳食補充劑等多種食品中。乳鐵蛋白對許多致病菌表現(xiàn)出抑制作用，可與免疫球蛋白協(xié)同參與局部免疫調(diào)節(jié)，提高機(jī)體免疫力。醫(yī)藥上也有抗菌抗炎活性，抗病毒及抗癌等功效。乳鐵蛋白之所以具有廣譜抗菌活性，是因為它能螯合細(xì)菌在生長過程中需要的Fe，因而能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜并有效抑制細(xì)菌生長。Soboleva 等[2]證實LF還具有磷酸酶、過氧化物酶和蛋白酶等活性。

1.2 免疫球蛋白

人們常常把免疫球蛋白和抗體混為一談，事實上兩者并非完全等同，免疫球蛋白包括抗體，但并不都是抗體。免疫球蛋白在常乳中占1%~2%[3]。常見的免疫球蛋白包括IgA、IgG、IgM 等，其中IgG 含量最高，占80%以上[4]。有研究認(rèn)為，母乳中的IgG 可與抗原形成復(fù)合物，預(yù)防哮喘等過敏性疾病，而牛乳中IgG 是否具備上述功能還有待研究[5]。

1.3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

在牛乳乳清蛋白中，α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La）的含量占27%左右，是唯一能與Ca2+結(jié)合的營養(yǎng)成分[6]，其與Ca2+的結(jié)合，不僅能促進(jìn)鈣的吸收，還增強(qiáng)了自身的穩(wěn)定性。α-乳白蛋白在氨基酸比例、結(jié)構(gòu)及功能特性方面與人乳非常相似，將其添加到母乳中有助于嬰兒的生長發(fā)育[7]。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）含量約占乳清蛋白的50%，是氨基酸的重要來源，有利于蛋白質(zhì)的合成。迄今為止，對β-乳球蛋白的研究主要集中在營養(yǎng)功能、分子結(jié)構(gòu)、熱特性以及在保健食品開發(fā)中的應(yīng)用等方面。隨著研究的不斷深入，β-乳球蛋白的價值將會被人們更好的挖掘利用。牛乳中生物活性蛋白的主要功能如表1 所示。

表1 生物活性蛋白的主要功能

1.4 乳過氧化物酶

乳過氧化酶（lactoperoxidase, LPO）可與過氧化氫、硫氰酸根形成乳過氧化物酶體系，參與宿主防御系統(tǒng)的構(gòu)成，以抵抗微生物的侵害，延長乳制品的貨架期。LPO 具有廣譜抗菌性，可阻止過氧化物的累積，減少致癌物的產(chǎn)生，對免疫系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用[9-10]。

1.5 不飽和脂肪酸

牛乳中含有少量不飽和脂肪酸，是機(jī)體不可缺少的營養(yǎng)成分，其含量與奶牛泌乳期和胎次有關(guān)[11]。包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、α-亞麻酸（αlinolenic acid, ALA）和共軛亞油酸（conjugated linoleic acid, CLA）等。影響牛乳中不飽和脂肪酸的因素及其功能如表2 所示。

表2 影響牛乳中不飽和脂肪酸的因素及其功能

1.6 生長因子

牛乳中的生長因子大多為多肽類物質(zhì)，具有耐熱性。有些重要生長因子的化學(xué)成分與人乳中的相似。牛乳中的生長因子主要包括表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor, IGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta, TGF-β）和β細(xì)胞素（betacellulin,BTC）等，作用如表3 所示，其中表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1（IGF-1) 以及轉(zhuǎn)化生成因子-β1（TGF-β1）含量較高。在奶牛產(chǎn)犢后的一個小時內(nèi)，生長因子在牛初乳中的含量達(dá)到最高，之后會隨著產(chǎn)犢時間的增加而降低。

表3 牛乳中主要生長因子的作用

2 熱處理對牛乳中乳鐵蛋白的影響

乳鐵蛋白含量和活性的變化是加工過程中的一個主要問題[16]。通過對牛乳LF 在72～85 ℃變性一級反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)apo-LF 較holo-LF 易變性，這可能是由于鐵離子的結(jié)合使LF 二硫化物發(fā)生結(jié)合從而阻止蛋白聚合所致，同時利用熱誘導(dǎo)的動力學(xué)參數(shù)證實，LF 在變性過程中受鐵結(jié)合狀態(tài)的影響，使apo-LF 與holo-LF 構(gòu)象發(fā)生獨立擴(kuò)展，apo-LF 在60 ℃左右時發(fā)生變性，其暴露的非共價鍵位點與二硫鍵形成非共價鍵聚合體。而含鐵量高的holo-LF 結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，在80 ℃條件下可與二硫鍵反應(yīng)，生成可溶性聚合體，說明蛋白質(zhì)一定程度上的變性會影響其構(gòu)象穩(wěn)定性，結(jié)果損失部分活性，或造成聚集，沉淀而失去作用[1]。

Franco 等[17]研究證明，巴氏殺菌不影響乳鐵蛋白與細(xì)菌之間的相互作用能力，并且對乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響；而超高溫瞬時殺菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization, UHT）處理可不同程度地降低乳鐵蛋白與細(xì)菌的相互作用能力。劉海燕[18]通過實驗得出，在90 ℃/15 s 熱處理條件下，乳鐵蛋白的檢出量極低；當(dāng)熱處理溫度高于95 ℃時，乳鐵蛋白的降解率達(dá)到了100%。Liu 等[19]發(fā)現(xiàn)在巴式殺菌條件下，中國牛奶LF 的活性保留率低于新西蘭牛奶，可能是由于LF 鐵飽和度不足而造成的。

3 熱處理對牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的影響

3.1 熱處理導(dǎo)致的含量和活性的變化

β-乳球蛋白作為牛乳中對熱不穩(wěn)定的一類營養(yǎng)物質(zhì)，加熱過程中會發(fā)生一系列變化。Lan 等[20]認(rèn)為，溫度決定著β-乳球蛋白的變性，牛乳經(jīng)105 ℃/15 s熱處理后檢測到其含量僅為0.07 mg/mL，溫度升至115 ℃時，β-乳球蛋白已經(jīng)完全變性。

β-乳球蛋白包括2 種變異體A 和B(β-LgA、β-LgB)。其中β-lgB 對熱最敏感，β-lgA 次之，α-乳白蛋白耐熱性最強(qiáng)。孫琦等[21]研究表明，隨著熱處理溫度的提高，ɑ-乳白蛋白、β-lgA 和β-lgB 含量逐漸降低，β-lgA 和β-lgB 分別在125 ℃、95 ℃時已無法檢出，而ɑ-乳白蛋白在UHT 滅菌溫度下依然存在。這也證實了Lan 等人的研究結(jié)果。此外，對比巴氏殺菌和UHT 殺菌處理方式發(fā)現(xiàn)，低溫長時間巴氏殺菌對β-Lg 和α-La 的熱損傷小于高溫短時間巴氏殺菌，且經(jīng)巴氏殺菌后低溫存放的鮮牛奶能最大程度的保留α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，UHT 乳中α-La 和β-Lg 含量最低[22-24]。通過對比不同種類的乳發(fā)現(xiàn)牛乳中α-乳白蛋白的耐熱性不如駱駝奶，變性溫度也較低。在90 ℃，5 min 的處理條件下，駱駝奶中有33%的α-乳白蛋白變性，而牛乳中卻有95%的α-乳白蛋白變性[25]。

3.2 熱處理導(dǎo)致的聚合物的形成

對牛乳進(jìn)行熱處理可導(dǎo)致乳清蛋白之間及乳清蛋白與酪蛋白之間發(fā)生聚合反應(yīng)。當(dāng)溫度為75 ℃時，巰基團(tuán)因β-乳球蛋白的去折疊化而裸露，與具有二硫鍵的游離κ-酪蛋白發(fā)生巰基-二硫化物交換反應(yīng)，形成β-乳球蛋白與κ-酪蛋白復(fù)合物。而且，活化的β-乳球蛋白可產(chǎn)生硫化氫，使牛乳具有“烹調(diào)味”而影響口感[22]。

α-La 熱變性的本質(zhì)是蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊化，暴露出分子內(nèi)部的二硫鍵。雖然α-乳白蛋白不含游離—SH，但其中的S—S 被破壞后會與含有游離—SH的β-乳球蛋白聚合形成復(fù)合物，具有與κ-酪蛋白反應(yīng)的趨向，由于β-Lg 具有游離巰基，在很大程度上決定了乳清蛋白在牛乳中的熱變性和聚集，因此這種聚合以β-Lg 為主，α-La 為輔。α-La/β-Lg 聚集體形成后，具有活性—SH 的β-Lg 與κ-CN 結(jié)合，同時實現(xiàn)了α-La 與酪蛋白的反應(yīng)?？梢姦?La、β-Lg 與酪蛋白膠束之間的聚集體形式，一種是β-Lg 聚集體與κ-CN 結(jié)合，另一種是α-La/β-Lg 聚合物與κ-CN結(jié)合[26]。

4 熱處理對乳中免疫球蛋白的影響

國內(nèi)外研究學(xué)者對免疫球蛋白的熱穩(wěn)定性展開了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白的熱變性是一個展開又聚合的過程，對其肽鏈的展開及構(gòu)象變化有不同程度的影響。在低溫下，三級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生展開，但一些展開的區(qū)域可能是可逆的。此外，研究發(fā)現(xiàn)在75~77 ℃條件下，溫度每升高1 ℃，免疫球蛋白損失15%~30%[27]。在探究牛初乳中IgG 在不同熱處理條件下的變化規(guī)律時，發(fā)現(xiàn)牛初乳經(jīng)過55 ℃、30 min 的熱處理后，IgG 含量明顯下降，之后經(jīng)一系列熱處理條件后，均低于牛初乳中的IgG 水平[28]。這可能是由于熱處理后IgG 分子變形或展開所致。與Fc 段相比，IgG 中Fab 段的CH區(qū)不穩(wěn)定，容易展開，導(dǎo)致Fab 段結(jié)構(gòu)改變，IgG 活性喪失。

楊紅等[29]曾在研究中闡述，IgG 的耐熱程度與IgG的純度密切相關(guān)，純度越低，耐熱性越好。而IgG 變性程度與加熱溫度和時間成正比，即熱處理溫度越高、時間越長，其變性程度越高。UHT 和加熱蒸發(fā)幾乎能完全破壞IgG 的活性，而HTST 殺菌和間歇式巴氏消毒處理后的IgG 活性僅損失0.5%~10%。任璐[30]在傳統(tǒng)高溫?zé)釟⒕⒄羝胧綒⒕?、膜過濾結(jié)合巴氏殺菌對ESL 牛乳品質(zhì)的影響的實驗中表明，膜過濾結(jié)合72 ℃、15 s 的殺菌能更好地保留IgG。

5 熱處理對牛乳中乳過氧化物酶的影響

乳過氧化物酶的熱穩(wěn)定性高于其他乳中的內(nèi)源酶。Lorenzen 等[31]對乳過氧化物酶活性在不同溫度下的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)牛乳中的LPO 活性隨著溫度的升高而不斷下降，經(jīng)過65 ℃、90 s 加熱后其活性約為原料乳的65%，原料乳經(jīng)過75、85 ℃加熱90 s后，LPO 活性已不足原料乳的0.17%。

此外，也有一些研究通過測定牛乳中LPO 不同溫度下的D 值和Z 值來反映其活性，且結(jié)果存在一定差異。Tayefi-Nasrabadi 等[32]研究了熱處理對牛乳中LPO 的影響，用D 值和Z 值表示。研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中LPO 活性在67、69、71 ℃和73 ℃的D 值依次降低，Z 值為4.7 ℃。Loredana 等[33]分析了牛乳中LPO在70~77 ℃條件下的活性變化。發(fā)現(xiàn)LPO 活性的D值隨著溫度的升高而逐漸降低，Z 值約為3.58 ℃。LPO 鈍化溫度的差異與牛乳樣品中的脂肪含量有關(guān)，也可能與酸度有關(guān)，因為LPO 在酸性條件下熱穩(wěn)定性差，關(guān)于這一假設(shè)仍需要進(jìn)一步驗證。

Wendie 等[34]報道經(jīng)過72 ℃、15 s 的巴氏殺菌，LPO的活性為加熱前的70%，經(jīng)過UHT 處理后LPO 沒有活性。純化分離的LPO 經(jīng)70 ℃、15 min 殺菌后，LPO依然是穩(wěn)定的，但在78 ℃、15 s 時完全失活。對乳過氧化物酶不同工藝下的活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在75 ℃、15 s 的條件下可檢測到較高的乳過氧化物酶活性[35]，而經(jīng)85 ℃或125 ℃處理15 s 后基本檢測不出活性。

6 熱處理對牛乳中生長因子的影響

生長因子的熱變性變化與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，分子具有很強(qiáng)的疏水性，這有利于自身聚合和與其他蛋白質(zhì)的非特異性相互作用。巴氏殺菌處理下，乳中的生長因子濃度較高，較高溫度下，生長因子多數(shù)與牛乳中高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)結(jié)合，并且以潛在的形式存在。

熱處理可以激活生長因子，Pia 等[36]發(fā)現(xiàn)，牛乳經(jīng)過65 ℃和72 ℃加熱15 s 后，IGF-I 的濃度較原料乳高，當(dāng)原料乳經(jīng)過90 ℃、15 s 的熱處理后，IGF-I 的濃度急劇增加，而經(jīng)過135 ℃、15 s 加熱后，IGF-I 活性降低，進(jìn)而指出90 ℃加熱可以激活I(lǐng)GF-I。Kang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在原料乳中添加凍干的初乳乳清粉能夠增加IGF-I 的水平，經(jīng)過75 ℃和85 ℃加熱15 min 后，其濃度降低，分別為加熱前的45.05%和45.25%；經(jīng)過121 ℃、15 min 的熱處理后牛乳中沒有檢測出IGF-I活性。Yun 等[38]研究表明，IGF-I 在UHT 乳中比一些生物活性蛋白的熱穩(wěn)定性還要強(qiáng)。

7 熱處理對牛乳中不飽和脂肪酸的影響

熱處理決定乳中不飽和脂肪酸的濃度和氧化程度。研究發(fā)現(xiàn)HTST 和UHT 處理對牛乳中CLA 和ALA 的濃度沒有影響[39]。然而，Xu 等[40]人發(fā)現(xiàn)，與生牛乳相比，UHT 牛奶中的不飽和脂肪酸濃度降低了53%。Dias 等[41]研究中表明，HTST 和UHT 處理后的牛乳中亞油酸和a-亞麻酸的氧化產(chǎn)物濃度比它們在生牛乳中的氧化產(chǎn)物濃度低51%~64%，這是因為它們又生成了二級氧化產(chǎn)物。

8 展 望

目前，國內(nèi)外研究者已對牛乳中生物活性物質(zhì)的種類和功能進(jìn)行了較為全面的研究。而本文對牛乳中生物活性化物質(zhì)在熱處理后的變化進(jìn)行了較為詳細(xì)的論述，為牛奶生物活性物質(zhì)的應(yīng)用提供了參考。但加熱過程中生物活性物質(zhì)活性變化的分析與研究仍主要集中于活性的比較方面，同時對這些活性物質(zhì)在熱處理后的生物可及性和生物利用度還沒有充分的了解和研究，在此基礎(chǔ)上還需要更多的體外和體內(nèi)研究來了解牛乳的熱處理對人體健康的影響。此外，還可以對牛乳的熱處理方法進(jìn)行創(chuàng)新，以生產(chǎn)具有豐富營養(yǎng)價值和生物活性成分的乳制品。