包烏日漢， 杜 莎， 王鵬宇， 姚軍虎， 齊景偉， 徐 明，

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 014010；2.內(nèi)蒙古優(yōu)然牧業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 015200；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

反芻動(dòng)物瘤胃產(chǎn)生的甲烷， 既造成了能量損失， 也是溫室氣體的主要來源之一 （王小晶，2009）。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球反芻動(dòng)物的甲烷年排放量達(dá)8000 萬(wàn)t， 占到全球人類活動(dòng)釋放甲烷量的28%（陳曉維，2009）。 Wu 等（2022）發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)瘤胃能量供應(yīng)量、 提供優(yōu)質(zhì)粗飼料和降低原蟲數(shù)量可降低甲烷排放量。根據(jù)抑制甲烷機(jī)制不同，甲烷抑制劑可以分為三類：氫受體類、微生物調(diào)節(jié)類和酶抑制劑。 Wu 等（2022）報(bào)道，三類甲烷抑制劑之間對(duì)體外甲烷產(chǎn)生量之間沒有交互影響。 本試驗(yàn)選擇典型的氫受體類和微生物調(diào)節(jié)類代表延胡索酸、 莫能菌素， 兼氫受體類和微生物調(diào)節(jié)類亞麻油， 進(jìn)一步研究氫受體類和微生物調(diào)節(jié)類之間及內(nèi)部對(duì)體外發(fā)酵和甲烷生成的交互影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 莫能菌素由山東勝利股份有限公司（山東生濟(jì)南市）提供，商品名為莫能菌素預(yù)混合劑，包含20%莫能菌素，添加到發(fā)酵底物中，莫能菌素有效添加量分別為0、120 mg/kg DM。 延胡索酸為純酸（F8509-100 G），從SIGMA-ALDRICH （St.Louis，MO，USA） 購(gòu)買， 發(fā)酵時(shí)直接添加到發(fā)酵液中，添加量分別為0、6.9 mmol。 亞麻油從上海麥克林公司（上海）購(gòu)買，含量＞99%，發(fā)酵時(shí)直接添加到發(fā)酵液中，添加量為0、3.1 mmol。

本研究包括兩個(gè)體外發(fā)酵試驗(yàn)。 試驗(yàn)1 研究莫能菌素和延胡索酸的交互作用，共4 個(gè)處理組，每個(gè)處理組6 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)2 研究莫能菌素、延胡索酸和亞麻油的交互影響，共8 個(gè)處理組，每個(gè)處理組8 個(gè)重復(fù)。

1.2 瘤胃液 瘤胃液從3 只成年山羊瘤胃獲得。供體山羊的飼料總量為2.4 kg DM， 在08：00 和20：00 分為兩次飼喂。 飼料中含有50%精料和50%苜蓿干草。 精料中含有70%玉米粉、25%豆粕和5%預(yù)混料，預(yù)混料中不包含任何甲烷抑制劑。

在晨飼前采集3 只瘤胃瘺管山羊的瘤胃內(nèi)容物，移到二氧化碳保溫盒中，然后立即運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室（在5 min 內(nèi)）。 將3 只供體山羊的瘤胃內(nèi)容物混合（1∶1∶1），然后用攪拌機(jī)（Fisher14-509-1）在二氧化碳下混合20 s， 將雜質(zhì)從飼料顆粒中分離出來。 將混合后的樣品通過四層紗布和玻璃棉進(jìn)行過濾，作為瘤胃液進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。

1.3 體外發(fā)酵 發(fā)酵瓶容積為260 mL， 每個(gè)瓶?jī)?nèi)加入600 mg 飼料。 將這些瘤胃緩沖液（1100 mL）和瘤胃液（200 mL）在二氧化碳環(huán)境下混合加熱，然后把50 mL 加入到發(fā)酵容器中， 通入二氧化碳，在39 ℃下發(fā)酵24 h。

1.4 樣品的采集和分析 發(fā)酵24 h 之后， 用冰塊冷卻發(fā)酵瓶，待氣體溫度接近室內(nèi)溫度時(shí)，用玻璃針管連接針頭測(cè)定氣體產(chǎn)生量，取10 mL 氣體樣品貯存在無抗凝劑的真空采血管中。 將氣體樣品用采樣注射器轉(zhuǎn)移到真空試管中， 然后用氣相色譜儀分析甲烷含量。 使用pH 儀對(duì)發(fā)酵底物進(jìn)行pH 分析，取1.5 mL 的發(fā)酵底物，加入0.3 mL 的偏磷酸溶液（250 g/L），離心15 min（39000 ×g，4 ℃）。取1 mL 的上清液，用氣相色譜法分析總揮發(fā)性脂肪酸（VFA）組成（乙酸、丁酸、丙酸、戊酸、異丁酸和異戊酸）及含量。

1.5 甲烷產(chǎn)生量的預(yù)測(cè) 根據(jù)Castro 等（2011）推薦公式， 依據(jù)發(fā)酵液中乙酸、 丙酸和丁酸濃度（mmol/mol VFA），計(jì)算甲烷產(chǎn)生量預(yù)測(cè)值：

甲烷產(chǎn)生量預(yù)測(cè)值/（mmol/mol VFA） =0.45×乙酸+ 0.4×丁酸-0.275 ×丙酸；

甲烷實(shí)際產(chǎn)生量/（mmol/mol VFA）=甲烷產(chǎn)生量（mL）/22.4 /（VFA×50 mL/1000）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用多因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析， 選用SPSS 13.0 的GLM 模型，試驗(yàn)因素包括莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油的主效應(yīng)和兩者之間及三者之間的交互作用。 極顯著水平為P ≤0.01，顯著水平為P ≤0.05，趨于顯著為0.05 ＜P ≤0.10。

2 結(jié)果

2.1 莫能菌素和延胡索酸的交互影響 由表1可知， 莫能菌素不影響產(chǎn)氣量和發(fā)酵液pH （P ＞0.05），可顯著降低甲烷產(chǎn)量、甲烷在氣體中含量及乙酸產(chǎn)量（P ＜0.05），甲烷產(chǎn)量降低了11.1%、甲烷含量降低了11.6%及乙酸產(chǎn)量降低了6.1%；延胡索酸增加了產(chǎn)氣量和丙酸比例（P ＜0.05），降低了甲烷產(chǎn)量和含量（P ＜0.05），甲烷產(chǎn)量降低了11.4%，甲烷含量降低了22.0%，不影響發(fā)酵pH和VFA 產(chǎn)量（P ＞0.05）。 莫能菌素和延胡索酸對(duì)發(fā)酵液pH、甲烷產(chǎn)量和含量、產(chǎn)氣量及VFA 組成等方面均沒有交互影響（P ＞0.05）。

表1 莫能菌素和延胡索酸對(duì)日糧體外產(chǎn)氣和發(fā)酵的影響

2.2 莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油的交互影響由表2 可知， 莫能菌素能顯著降低產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量及含量，降低幅度分別為5.7%和15.9%（P ＜0.05），增加發(fā)酵液pH（P ＜0.05），降低丁酸和戊酸含量（P ＜0.05）。延胡索酸能降低發(fā)酵pH、甲烷產(chǎn)量和含量 （P ＜0.05）， 增加產(chǎn)氣量和丙酸比例（P ＜0.05），甲烷產(chǎn)量降低11.0%，趨于降低乙酸比例（P =0.06），顯著影響VFA 中的丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸組成及乙丙比（P ＜0.05）。亞麻油能顯著降低甲烷產(chǎn)量， 降低幅度為8.1%（P ＜0.05），趨于降低甲烷含量（P = 0.07），顯著提高產(chǎn)氣量 （P ＜0.05）， 不影響VFA 產(chǎn)量及組成 （P ＞0.05）。 莫能菌素、延胡索酸和亞麻油對(duì)發(fā)酵pH、甲烷產(chǎn)量和含量、 總產(chǎn)氣量及VFA 組成等方面均沒有兩向（P ＞0.05）和三向（P ＞0.05）的交互影響。

表2 莫能菌素、延胡索酸和亞麻油對(duì)飼料體發(fā)酵外和甲烷產(chǎn)生的影響

3 討論

反芻動(dòng)物甲烷排放不僅造成飼料能量損失，還會(huì)導(dǎo)致全球氣候變暖。 甲烷是瘤胃碳水化合物發(fā)酵過程中不可避免的產(chǎn)物， 通過將甲烷轉(zhuǎn)化為丙酸可降低甲烷的產(chǎn)生（王麗鳳，2004）。不同甲烷抑制劑均能顯著減少甲烷排放量， 對(duì)溫室氣體減排和提高經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益都將具有深遠(yuǎn)意義（陳銳等，2022）。本試驗(yàn)利用體外發(fā)酵方法，檢測(cè)莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油對(duì)降低體外甲烷產(chǎn)生量的交互作用，為實(shí)踐應(yīng)用提供依據(jù)。

莫能菌素是典型的微生物調(diào)節(jié)類的甲烷抑制劑。研究表明，莫能菌素作為飼料添加劑能降低甲烷能量損失、乙丙比例、瘤胃液pH 變異程度（楊華明等，2016）， 主要是莫能菌素可抑制瘤胃內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，從而抑制甲烷的產(chǎn)生，改善飼料轉(zhuǎn)化率（朱俊紅等，2022；韓金濤，2014）。 Kim 等（2014）研究表明，莫能菌素抑制了纖維分解菌、甲酸脫氫酶活性，同時(shí)增強(qiáng)了分解淀粉的能力，減少了生產(chǎn)甲烷所需的氫。 在本研究中莫能菌素降低了甲烷生成和乙丙比例， 這與之前的研究結(jié)果一致（Wischer 等，2013；Ponce 等，2012）。

王榮（2019）等選用玉米和菊苣作為體外發(fā)酵底物，研究發(fā)現(xiàn)，延胡索酸有抑制甲烷生成的作用， 且延胡索酸和底物對(duì)氫含量和甲烷產(chǎn)量不存在交互影響，劉南南（2014）也得到同樣的結(jié)論。 延胡索酸作為丙酸生成的中間體，它的添加可增加瘤胃丙酸產(chǎn)量。 經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證，添加延胡索酸可使甲烷釋放量減少約20%（李琳等，2010；Asanuma 等，1999）。本研究顯示，延胡索酸增加了體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和丙酸比例， 降低了甲烷產(chǎn)量， 這與之前的報(bào)道一致 （Hook 等，2010；Newbold 等，2005）。

多不飽和脂肪酸可作為氫受體來降低甲烷的生成， 同時(shí)可抑制甲烷生成相關(guān)菌（原蟲和甲烷菌）。 本試驗(yàn)選用的亞麻油，是兼具氫受體和微生物調(diào)節(jié)功能的甲烷抑制劑。 張春梅（2010）研究顯示， 亞麻油可顯著提高總揮發(fā)性脂肪酸和丙酸含量，降低甲烷產(chǎn)生量。 譚?。?021）研究顯示，亞麻油中不飽和脂肪酸會(huì)通過生物氫化作用促進(jìn)氫的利用，進(jìn)而減少氫濃度，以減少甲烷生成。 本研究結(jié)果顯示，亞麻油顯著降低了甲烷產(chǎn)量，與前人研究結(jié)果一致（譚健等，2021；張春梅等，2010）。

盡管甲烷抑制劑在反芻動(dòng)物飼料中被廣泛使用， 但以往的研究較少討論多種甲烷抑制劑之間的交互影響。一篇早期的研究報(bào)道，莫能菌素和延胡索酸聯(lián)合發(fā)酵時(shí)， 莫能菌素和延胡索酸對(duì)甲烷產(chǎn)量、產(chǎn)氣量、VFA 等均沒有交互影響（Callaway，1996）。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氫分壓是瘤胃產(chǎn)生丙酸和甲烷的標(biāo)志指標(biāo)， 延胡索酸和莫能菌素在促進(jìn)瘤胃丙酸生成方面具有較好的協(xié)同效應(yīng)， 具有一定的可加性 （李宗軍，2018；Castro-Montoya 等，2012；McGinn 等，2004）。也有研究顯示，莫能菌素和延胡索酸對(duì)體外甲烷產(chǎn)生量之間沒有交互影響（Wu 等，2022）。 本研究中觀察到，跟單獨(dú)使用莫能菌素或延胡索酸相比， 同時(shí)添加莫能菌素和延胡索酸對(duì)甲烷的抑制作用更大， 這兩種添加劑通過兩種機(jī)制相互獨(dú)立地降低甲烷產(chǎn)生， 這與前人研究報(bào)道一致。 Wu 等（2022）報(bào)道，三種甲烷抑制劑莫能菌素、 延胡索酸和溴化甲烷對(duì)體外甲烷產(chǎn)生量之間沒有交互影響。本研究結(jié)果顯示，三種甲烷抑制劑莫能菌素、 延胡索酸和亞麻油之間對(duì)體外甲烷抑制也不存在交互影響， 與Wu 等（2022）報(bào)道一致。

根據(jù)這兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，基于乙酸、丁酸和丙酸產(chǎn)量對(duì)甲烷產(chǎn)量進(jìn)行預(yù)測(cè) （Castillo 等，2011），再將預(yù)測(cè)產(chǎn)量和實(shí)際甲烷產(chǎn)量之間進(jìn)行回歸分析，見圖1。 結(jié)果顯示，實(shí)測(cè)甲烷產(chǎn)量與預(yù)測(cè)甲烷產(chǎn)量之間存在顯著相關(guān)性。表明延胡索酸、莫能菌素和亞麻油這三種甲烷抑制劑對(duì)甲烷生成的抑制作用均是通過改變乙酸、丙酸和丁酸比例來實(shí)現(xiàn)的。莫能菌素通過抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和原生動(dòng)物降低乙酸并增加丙酸產(chǎn)量 （Kumar 等，2013；Ellis 等，2012；Hook 等，2010）； 延胡索酸與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)利用代謝氫， 從而直接降低乙酸產(chǎn)量并增加丙酸產(chǎn)量 （Hook 等，2010；Li 等，2009；Castillo 等，2004）。本文在Wu 等（2022）的試驗(yàn)基礎(chǔ)上增加了亞麻籽油，其主要含有十八碳不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸可以作為電子受體與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)氫，通過加氫的順-反異構(gòu)化反應(yīng)生成飽和脂肪酸，從而減少甲烷生成（王澤富等，2022；Dewanckele 等，2020）。 但溴化甲烷并不是通過改變VFA 譜的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的（Wu 等，2022）。 綜合上述結(jié)果，氫受體類和微生物調(diào)節(jié)類甲烷抑制劑均是最終通過改變VFA 譜的機(jī)制來降低甲烷的，而酶抑制劑類甲烷抑制劑直接抑制甲烷生成酶，不通過VFA 譜這條途徑。

圖1 甲烷產(chǎn)量預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的線性回歸

4 結(jié)論

綜合兩個(gè)試驗(yàn)，延胡索酸、莫能菌素或亞麻油均可有效降低體外甲烷產(chǎn)生量，且三種添加劑沒有兩向和三向交互作用。這三種甲烷抑制劑對(duì)甲烷生成的抑制作用在一定范圍內(nèi)具有可加性。