郭偉　范帥華　杜鵬程　郭軍

摘要：血流感染（BSI）是由細(xì)菌、真菌和病毒等微生物引起的血液播散性疾病，可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥、感染性休克，嚴(yán)重危及人類生命健康。明確病原體是精準(zhǔn)治療BSI的重要核心。傳統(tǒng)血培養(yǎng)是病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其不足是耗時長，會產(chǎn)生假陰性結(jié)果等，在臨床實踐中具有一定的局限性。納米孔測序作為新一代測序技術(shù)，能快速檢測病原體，完成耐藥基因、毒力基因檢測，可優(yōu)化臨床治療。本文就納米孔測序技術(shù)在BSI中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行綜述。

關(guān)鍵詞：納米孔測序；血流感染；高通量核苷酸測序

中圖分類號： R446.5文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1000-503X（2023）02-0317-05

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.14995

Application and Prospect of Nanopore Sequencing Technology in Etiological Diagnosis of Blood Stream Infection

GUO Wei FAN Shuaihua DU Pengcheng GUO Jun1，3

ABSTRACT：Blood stream infection （BSI），a blood-borne disease caused by microorganisms such as bacteria，fungi，and viruses，can lead to bacteremia，sepsis，and infectious shock，posing a serious threat to human life and health.Identifying the pathogen is central to the precise treatment of BSI.Traditional blood culture is the gold standard for pathogen identification，while it has limitations in clinical practice due to the long time consumption，production of false negative results，etc.Nanopore sequencing，as a new generation of sequencing technology，can rapidly detect pathogens，drug resistance genes，and virulence genes for the optimization of clinical treatment.This paper reviews the current status of nanopore sequencing technology in the diagnosis of BSI.

Key words：nanopore sequencing；blood stream infection；high-throughput nucleotide sequencing

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：317-321

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物進入血流引起的播散感染，可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥和膿毒癥，嚴(yán)重者可引起休克、多臟器功能衰竭乃至死亡。近年來，隨著艾滋病患者和移植術(shù)后患者等免疫力低下患者的人數(shù)增多、醫(yī)療侵襲性操作項目的不斷增加和廣譜抗菌藥物、皮質(zhì)激素等藥物的廣泛應(yīng)用，BSI的發(fā)病率及病死率逐年上升［1］。一項覆蓋了3.2億人口、基于國家死亡檢測系統(tǒng)系統(tǒng)的回顧性分析發(fā)現(xiàn)：2015年標(biāo)化BSI相關(guān)死亡率為6.67/萬，相當(dāng)于全國BSI死亡例數(shù)達到102.6萬例（通過2015年的普查人口估算）。2019年末開始的由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型導(dǎo)致的新型冠狀病毒感染疫情的暴發(fā)，再次敲響了公共衛(wèi)生警鐘，提示著感染性疾病，尤其是病毒引起的呼吸道傳染病仍嚴(yán)重威脅人類的生命健康。Li等［2］指出，在臨床中許多嚴(yán)重或危重新型冠狀病毒感染患者特有典型的休克癥狀，常常是BSI中的病毒性敗血癥臨床表現(xiàn)。BSI已經(jīng)成為了嚴(yán)峻的臨床和公共衛(wèi)生安全問題，嚴(yán)重影響了人們的生命安全，給公共衛(wèi)生健康帶來了巨大挑戰(zhàn)［3］。

明確病原體是治療BSI的核心，病原體是實施精準(zhǔn)治療的靶標(biāo)，目前血培養(yǎng)依然是診斷BSI的金標(biāo)準(zhǔn)，但這通常需要2～7 d才能完成病原菌鑒定和抗生素敏感性試驗［4］，導(dǎo)致依據(jù)病原學(xué)檢測結(jié)果優(yōu)化和精準(zhǔn)實施抗菌藥物治療的嚴(yán)重延誤，在最初24 h內(nèi)仍未接受治療或接受不適當(dāng)抗菌治療的膿毒癥患者的死亡風(fēng)險會因此而增加［5］，此外病原學(xué)診斷的延遲促進了廣譜抗菌藥物的不當(dāng)使用和過度使用，使得病原菌耐藥性增強、高耐藥病原體在臨床流行，導(dǎo)致患者發(fā)生醫(yī)院感染的風(fēng)險升高，進一步增加了抗菌治療的難度，形成惡性循環(huán)［6］。此外，還有許多病原微生物，如病毒、支原體等無法在常規(guī)臨床實驗室進行培養(yǎng)和檢測。因此為了探索建立簡單、快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷方法，微生物學(xué)家、臨床檢驗學(xué)家等開展了大量研究建立新型病原檢測方法，根據(jù)方法學(xué)原理的不同可分為酶聯(lián)免疫吸附測定、血清抗體檢測、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、二代宏基因組測序等［7］。這些方法有優(yōu)勢的同時也存在明顯不足，比如結(jié)果容易受干擾、假陰性高，測序讀長相對較短，設(shè)備成本高昂、體積大，操作復(fù)雜，應(yīng)用受到限制，特別是報告病原學(xué)檢測結(jié)果的時間一般會超過24 h。近年來迅速發(fā)展的納米孔測序技術(shù)很好地解決這些問題，由于其具有測序讀長較長、數(shù)據(jù)實時產(chǎn)出（“邊解鏈邊測序”）等特點，為快速檢測病原微生物提供了可能，本文就納米孔測序技術(shù)在BSI病原微生物檢測中的應(yīng)用進行綜述。

測序技術(shù)的發(fā)展及在病原檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

1977年，Sanger等［8］描述了一種測定 DNA 核苷酸序列的方法——雙脫氧末端終止法，即Sanger法。這種方法現(xiàn)在稱為一代測序，在后來的人類基因組研究計劃中起到了主導(dǎo)作用。但一代測序能夠測定的DNA序列長度（即讀長：是測序反應(yīng)所能測得序列的長度，如果DNA序列長度高于讀長，那么必須把DNA序列分割成長度在讀長以內(nèi)短序列才能測序）和范圍都很有限，且費用高昂。2004年，美國國家人類基因研究所提出了在10年內(nèi)達成以1000美元成本對人類基因組測序的目標(biāo)，促進了新一代測序（next generation sequencing，NGS）的研發(fā)。NGS也稱為二代測序、高通量測序、深度測序等，NGS能實現(xiàn)更大范圍基因組的檢測，在一次運行中能夠并行進行數(shù)百萬至數(shù)萬億次測定［9-10］；目前，二代宏基因組測序病原檢測方法實現(xiàn)了對臨床樣本中病原微生物的快速直接檢測，無需進行病原培養(yǎng)，可在24～36 h左右獲得檢測結(jié)果，極大推進了臨床感染性疾病的精準(zhǔn)診斷，在控制感染和疾病暴發(fā)方面效果明顯。但由于NGS設(shè)備成本高昂、體積大，操作維護復(fù)雜，在臨床微生物學(xué)實驗室的應(yīng)用受到限制，此外由于NGS讀長相對較短，在病原微生物檢測中一般采用單端75 bp測序方案，因此序列特異性相對較低，且NGS設(shè)備單次運行時間目前約需10 h，已相對穩(wěn)定，因此檢測時間難以進一步縮短［11］。而具有邊解鏈邊測序特性和長讀長特點的納米孔測序技術(shù)能很好解決這些問題。

納米孔測序的原理及主要亮點

雖然早在1980年就出現(xiàn)了納米孔測序技術(shù)的概念，但直到2014年才出現(xiàn)第1個實用化的納米測序技術(shù)產(chǎn)品，由牛津納米孔技術(shù)公司推出的MinION納米測序儀，體積只有60 cm 重量只有90 g，可以通過USB接口與控制計算機連接并受其控制［12］。MinION納米測序儀主要由運動蛋白、通道蛋白、特定的集成電路板組成。在運動蛋白作用下雙鏈DNA（或RNA-DNA雙鏈）分子被解開，單鏈的DNA或RNA通過通道蛋白會引起特征性的電流變化，而不同的電流變化對應(yīng)的堿基序列不同，集成電路板能測量電流變化并轉(zhuǎn)換輸出成fastq格式序列文件，從而被特定的軟件識別分析［13］。納米孔測序主要有以下幾方面的優(yōu)勢：（1）檢測速度快：在感染性疾病中，納米孔測序平臺進行擴增子測序能夠在10 min確定病原體，其快速實時檢測病原體的優(yōu)勢得到了充分發(fā)揮，此外其對于快速準(zhǔn)確檢測細(xì)菌、真菌耐藥基因及點突變也具有優(yōu)勢［13］。（2）實時測序：能夠在測序開始后持續(xù)獲得測序結(jié)果，結(jié)合同時開展的快速分析，能夠極大縮短病原體檢測時間，這些優(yōu)勢促使了納米孔測序儀在基礎(chǔ)研究和現(xiàn)場測序中得到了廣泛應(yīng)用。（3）長讀取長度：讀段長度范圍在數(shù)百bp到數(shù)Mb之間，因此為在鑒別病原體的同時也為有效檢測細(xì)菌耐藥基因、毒力基因等提供了可靠依據(jù)。（4）原生單分子檢測：能夠在單分子水平上實現(xiàn)DNA/RNA及修飾的直接檢測，直接組裝RNA病毒基因組。（5）MinION納米測序儀體積小、攜帶方便、單次運行成本低，便于臨床檢驗實驗室使用。

納米孔測序在BSI病原體檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

應(yīng)用納米孔測序快速檢測BSI病原體 因為納米孔測序可以實時產(chǎn)出數(shù)據(jù)，所以搭配實時病原識別軟件后，即可對實時獲得的序列進行分析從而快速解析樣本中的病原信息。納米孔測序技術(shù)實用化后，即被嘗試應(yīng)用于BSI病原快速檢測，顯示了實時測序所帶來的時效性優(yōu)勢。2015年，Greninger等［14］首次使用MinION納米孔測序儀和新開發(fā)的實時生物學(xué)分析管道MatePORE在6 h內(nèi)完成了4份病毒感染患者血液樣本的核酸提取到病原體鑒定。在107～108 copies/ml的滴度下，來自2例急性出血熱患者的埃博拉病毒讀數(shù)和來自1名無癥狀獻血者的基孔肯雅病毒讀數(shù)在數(shù)據(jù)采集的4～10 min內(nèi)被檢測出來，而較低滴度的丙型肝炎病毒（1×105 copies/ml）在40 min內(nèi)被檢測出來。這項研究首次展示了納米孔測序在BSI病原快速檢測中潛在的優(yōu)勢。

此后，更多研究者對納米孔測序檢測各類BSI病原的時效性和準(zhǔn)確性進行了深入驗證。2018年，Ashikawa等［15］使用MinION平臺對血培養(yǎng)獲得的細(xì)菌、真菌進行了16SrRNA基因和ITS序列擴增檢測，在測序10 min后即可鑒定病原菌。與MALDI-TOF MS質(zhì)譜檢測結(jié)果比對顯示，除了2種細(xì)菌由于16SrRNA測序的局限被錯誤鑒定，其余檢測到的細(xì)菌和真菌同MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析的結(jié)果一致。和一代測序?qū)Ρ龋?0個標(biāo)本在測序10 min時的平均序列一致性高達99.03%。這項研究證明了納米孔測序在檢測導(dǎo)致BSI的臨床常見細(xì)菌和真菌時的準(zhǔn)確性。

同時，納米孔測序檢測也被嘗試應(yīng)用于指導(dǎo)常規(guī)方法難以診斷的罕見病原感染的臨床治療。2019年，Bialasiewicz等［16］報道，1例62歲的女性患者，在被狗咬傷后的第6天因為膿毒癥休克和多器官功能衰竭收入重癥監(jiān)護病房，根據(jù)其被狗咬傷的病史和中性粒細(xì)胞中棒狀包裹體的顯微外觀，懷疑是細(xì)菌病因?qū)е碌腂SI，但作為金標(biāo)準(zhǔn)的血培養(yǎng)法3 d依然是陰性結(jié)果，隨后使用MinION平臺對患者的血液樣本進行強化檢測，在19 h后就確定了病原菌是犬嗜二氧化碳嗜血桿菌，而檢測出的弓形蟲考慮污染所致。該患者最初接受了哌拉西林-他唑巴坦、林可霉素和多西環(huán)素的治療，隨后根據(jù)MinION檢測的陽性結(jié)果，調(diào)整后續(xù)14 d的用藥為美羅培南，并在使用美羅培南3 d后病情好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)出重癥監(jiān)護病房，隨后順利出院。犬嗜二氧化碳嗜血桿菌是BSI罕見的病原體，該案例提示納米孔實時檢測使快速確定罕見、血培養(yǎng)陰性的病原體成為可能，在改善診斷流程，優(yōu)化臨床抗菌藥物的使用以及降低BSI患者的病死率、改善預(yù)后等方面具有巨大潛能。

應(yīng)用納米孔測序檢測BSI病原體及其耐藥性和毒力特征 除實時獲取數(shù)據(jù)外，納米孔測序還具有長讀長的特點，因此相對于短讀長的NGS，在完整基因序列的獲取和分析中更具優(yōu)勢，能夠從臨床樣本中直接獲得更為完整的耐藥基因、毒力基因等序列，為臨床治療提供更豐富的信息。Sakai等［17］較為系統(tǒng)地評價了納米孔測序在血液樣本中直接檢測導(dǎo)致BSI的細(xì)菌及其耐藥基因中的效果。使用MinION測序儀及對38個陽性血培養(yǎng)瓶中的樣本進行了納米孔測序，使用WIMP軟件檢測病原，ARMA軟件檢測耐藥基因，并依據(jù)培養(yǎng)獲得菌株的16SrRNA測序、MALdI-ToF MS質(zhì)譜分析和藥敏鑒定結(jié)果進行比較驗證。納米孔測序30 min獲得的序列分析結(jié)果顯示，18份革蘭陰性細(xì)菌感染樣本均被正確鑒定，但對于20份革蘭陽性菌感染樣本，由于受人源化核酸背景干擾，被鑒定為病原的序列讀段比例較低，革蘭陽性菌感染樣本鑒定的正確率僅有60%，提示需優(yōu)化革蘭陽性菌的核酸提取方法。此外，在2份樣本中檢測到超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因，與基因PCR擴增和藥敏試驗結(jié)果一致，但對四環(huán)素、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素耐藥基因的檢測結(jié)果與藥敏表型并不相符。

Zhou等［18］使用MinION測序儀，在2 h內(nèi)實現(xiàn)了對含有高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌樣本進行宏基因組測序分析；其中3個樣本為混入肺炎克雷伯菌的模擬BSI樣本，細(xì)菌濃度是30 CFU/ml（樣本1），將10 ml的模擬血樣分別加入到厭氧血培養(yǎng)瓶（樣本2）和需氧血培養(yǎng)瓶（樣本3）中培養(yǎng)直到陽性，并以純菌落作為對照（樣本4）。在使用MinION測序2 h后對1～3號樣本都實現(xiàn)檢出，并檢測到了20余條支持耐藥基因和毒力基因鑒定的讀段；測序20 h后，對樣本2～4的耐藥基因檢出率達到了82.4%，該研究中毒力基因檢出率更是高達96.1%。

值得注意的是，部分研究中使用的是基于網(wǎng)絡(luò)的免費開放軟件WIMP，與不同數(shù)據(jù)庫比對就能自動識別細(xì)菌種類并預(yù)測對抗菌藥物的敏感性，整個檢測過程可以用1個由筆記本計算機控制的便攜式設(shè)備進行，初始成本低，適用于不同層級的醫(yī)療機構(gòu)，具有很強的普適性。早期明確感染病原的耐藥性和毒力，對于降低BSI發(fā)病率、病死率，縮短住院時長，降低住院費用，減少國家醫(yī)療財政支出具有重要作用。以上結(jié)果顯示納米孔測序在BSI病原檢測中能夠具有較好的輔助臨床診療效果和較高的衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)效益，但仍需在實驗技術(shù)和結(jié)果解讀中進行更進一步優(yōu)化。

應(yīng)用納米孔測序精確分析BSI病原基因組特征 通過納米孔測序獲得長讀長序列，進而進行病原基因組組裝，能夠獲得BSI感染病原體的完整基因組，這對明確病原基因組特征、更好識別耐藥基因、毒力基因及其所在的基因環(huán)境具有重要意義。Zheng等［19］從BSI患者血液中培養(yǎng)得到1株多重耐藥的大腸埃希菌2D菌株，該菌株具有對氨基糖苷類、第3代頭孢菌素類、碳青霉烯類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物的多藥耐藥特性。該研究采用MinION和Illumina測序平臺進行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌株擁有6個耐藥基因，最具特點的是此菌株的耐藥基因blaNDM-5位于質(zhì)粒上，blaCTX-M-14同時存在染色體和質(zhì)粒中；測序結(jié)果解釋了細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子機制，并通過基因組分析揭示了該菌的耐藥性動態(tài)變化過程。除了耐藥基因，明確病原體編碼毒力基因的基因元件序列特點也具有重要的公共衛(wèi)生意義。Gu等［20］在全基因組水平對耐碳青霉烯類藥物的高毒力肺炎克雷伯菌進行了流行病學(xué)研究，表明經(jīng)典的ST11型肺炎克雷伯菌在獲得了1個約170 kbp的毒力質(zhì)粒后，具有了高致病性、多重耐藥性和高傳播力的特性，引起了經(jīng)呼吸道傳播的醫(yī)院獲得性肺炎暴發(fā)，從分子水平上揭示了該菌株的高毒力和高耐藥的產(chǎn)生機制。

以上研究顯示了納米孔測序技術(shù)在BSI病原基因組測序、耐藥和毒力分子機制研究等方面的前沿應(yīng)用，同時展示出了該技術(shù)在臨床病原體監(jiān)測、指導(dǎo)臨床實踐、促進公共健康方面的廣闊應(yīng)用前景。

不足和展望

納米孔測序技術(shù)及平臺具有以上優(yōu)勢，但依然存在以下不足：（1）當(dāng)前測序錯誤率（6%～15%）仍然顯著高于NGS平臺（0.1%～1%）；（2）文庫構(gòu)建（在核苷酸片段兩端連接上特定序列的接頭，讓文庫在測序平臺上進行測序）需要的樣本核酸投入量較大，限制了對部分臨床樣本的直接測序［13］；（3）在相同測序數(shù)據(jù)量下，納米孔宏基因組測序的病原基因組覆蓋率通常較低［17］；（4）盡管納米孔測序單次運行成本低，但由于單次測序通量較NGS偏低，目前和NGS相比在獲得相同數(shù)據(jù)量時運行成本更高，限制了納米孔測序的廣泛使用。

錯誤率高是納米孔測序的突出問題，可能導(dǎo)致將測序讀段錯誤識別為基因組序列相似的病原體［17］，不過隨著納米孔測序技術(shù)的更新，測序準(zhǔn)確率正在得到不斷提高，例如近期牛津納米孔技術(shù)公司推出的R10.4納米孔和Kit12試劑盒，其原始讀長準(zhǔn)確度可超過99%，并且還可以根據(jù)需求選擇不同的堿基識別方式——快速模式、高精度識別模式、超高精度識別模式，從而獲得最高的準(zhǔn)確度。在文庫構(gòu)建核酸投入量問題上，可以聯(lián)合PCR技術(shù)，對樣本擴增產(chǎn)物進行測序分析，如Ashikawa等［15］在研究中使用了PCR擴增，并預(yù)先使用了QIAamp PowerFecal DNA試劑盒，結(jié)合磁珠純化系統(tǒng)預(yù)處理，提取和純化DNA，進而很好地解決了病原體核酸量少以及PCR抑制劑的問題。

目前以牛津納米孔平臺為代表的納米孔測序技術(shù)依然是此領(lǐng)域主導(dǎo)產(chǎn)品，我國也已經(jīng)在自主研發(fā)納米孔測序技術(shù)領(lǐng)域取得重大突破。2021年12月10日，中國成都齊碳科技有限公司發(fā)布了我國自主研發(fā)的量產(chǎn)納米孔單分子基因測序儀、配套芯片和試劑公告。從成本上分析，隨著納米測序技術(shù)的進一步成熟及納米孔測序技術(shù)國產(chǎn)化平臺的推出，單次測序成本能得到顯著下降［21］。

納米孔測序技術(shù)快速檢測病原體的能力已在實驗研究中得到證實，但由于納米孔測序技術(shù)在臨床實際應(yīng)用時間較短，目前積累臨床測序原始樣本仍較少，其臨床實際應(yīng)用效果還有待進一步驗證。相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷革新完善，納米孔測序有望成為一種可靠的臨床常規(guī)使用病原學(xué)檢測方法，改變感染性疾病的診斷和治療實踐。

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（收稿日期：2022-03-21）

基金項目：清華大學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科研計劃（QT201901）和北京市自然科學(xué)基金‐海淀原始創(chuàng)新聯(lián)合基金（前沿項目）（L192069）