趙孟斌，顧華蓉，穆洪濤，高向陽(yáng)*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）（2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303）

鮮味，是繼酸、甜、苦、咸味后，第五個(gè)被確定的基本味覺(jué)，具有增加食物口感豐富性和令人舒服愉快的特點(diǎn)[1]。引起鮮味的物質(zhì)根據(jù)化學(xué)成分可分為氨基酸類(lèi)、核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、有機(jī)堿類(lèi)和鮮味肽[2]，其中鮮味肽是一種分子量約為150～3 000 u的小分子肽，具有增鮮、增香及增強(qiáng)食品整體味感作用，并且有良好的加工特性、熱穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。鮮味肽不僅具有鮮味，而且可以掩蓋和減弱苦味以改善食品風(fēng)味[3]，與其他物質(zhì)協(xié)同增鮮還可減少食鹽和谷氨酸鈉的攝入[4]。1978年，Yamasaki等[5]首次從木瓜蛋白酶水解的牛肉水解液中分離純化得到氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala的鮮味肽，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鮮味肽在魚(yú)類(lèi)[6]、雞湯[7]、火腿[8]和菌類(lèi)[9]等許多食品中廣泛存在，是食品中重要的呈味物質(zhì)。現(xiàn)階段對(duì)鮮味肽的研究主要集中在分離鑒定等方面，具體的呈鮮機(jī)理與構(gòu)效關(guān)系尚不明確。鮮味在人體的感知主要依靠異源二聚體味覺(jué)受體第一家族亞型1/3（Taste Receptor Type 1/3，T1R1/T1R3）[10]、味型代謝性谷氨酸受體4（Metabotropic Glutamate Receptor 4，mGluR4）[11]、胞外鈣敏感受體（Calcium-sensing Receptor，CaSR）[12]和G蛋白偶聯(lián)受體C家族6組A亞型（G Protein-coupled Receptor Family C Group 6 Member A Receptor，GPRC6A）[13]，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的C亞族，可廣泛感知多種鮮味物質(zhì)，將鮮味信號(hào)傳遞至大腦[14]，但人類(lèi)鮮味受體的晶體結(jié)果尚未被完全解析[15]，因此有必要通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來(lái)獲得其三維結(jié)構(gòu)，利用計(jì)算機(jī)輔助受體-配體結(jié)合的分子對(duì)接技術(shù)，從小分子（配體）及蛋白大分子（受體）各自的三維結(jié)構(gòu)入手，檢驗(yàn)兩者結(jié)合能力，預(yù)測(cè)其結(jié)合模式及關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，分析鮮味肽與受體間的相互作用，有助于闡明鮮味肽呈鮮機(jī)制。

本研究以魚(yú)露中鑒定得到的脯氨酸二肽和谷氨酸二肽[16]為研究對(duì)象，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)表征二肽與T1R1、T1R3及CaSR鮮味受體的結(jié)合模式，尋找二肽與鮮味受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合二肽的呈鮮強(qiáng)度與閾值來(lái)探究其呈鮮機(jī)理與構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與數(shù)據(jù)庫(kù)

谷氨酸鈉、蔗糖、檸檬酸、氯化鈉均為食品級(jí)，購(gòu)自廣州利成實(shí)業(yè)有限公司?？鼘帲荷V純，購(gòu)自廣州叢源儀器有限公司。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)分離鑒定得到的魚(yú)露寡肽序列[17]，從中選取12個(gè)二肽：絲氨酸-脯氨酸（Serine-proline，Ser-Pro）、脯氨酸-絲氨酸（Proline-serine，Pro-Ser）、丙氨酸-脯氨酸（Alanine-proline，Ala-Pro）、脯氨酸-丙氨酸（Proline-alanine，Pro-Ala）、纈氨酸-脯氨酸（Valine-proline，Val-Pro）、脯氨酸-纈氨酸（Proline-valine，Pro-Val）、γ-谷氨酸-蛋氨酸（γ-Glutamic Acid-methionine，γ-Glu-Met）、蛋氨酸-谷氨酸（Methionine-glutamic Acid，Met-Glu）、γ-谷氨酸-甘氨酸（γ-Glutamic Acid-glycine，γ-Glu-Gly）、甘氨酸-谷氨酸（Glycine-glutamic Acid，Gly-Glu）、γ-谷氨酸-亮氨酸（γ-Glutamic Acid-leucine，γ-Glu-Leu）和亮氨酸-谷氨酸（Leucine-glutamic Acid，Leu-Glu），采用固相合成法合成以上二肽，并進(jìn)行脫鹽處理，使純度≥98%，委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

鮮味受體蛋白均來(lái)自Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）：T1R1、T1R3和CaSR的檢索號(hào)分別為Q7RTX1、Q7RTX0、P41180。模板蛋白來(lái)自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org）。

序列對(duì)比、同源建模及模型評(píng)估涉及的平臺(tái)：SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、SAVES v6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)小組由20名味覺(jué)正常人員組成（10女10男，20～25歲），并依據(jù)GB/T 16291.1-2012[18]接受了感官培訓(xùn)以辨別五種基本味覺(jué)（酸、甜、苦、咸、鮮）。參考叢艷君等[19]分別以檸檬酸（0.8 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、奎寧（0.8 mg/mL）、氯化鈉（3.5 mg/mL）和谷氨酸鈉（3.5 mg/mL）作為酸、甜、苦、咸、鮮的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，配制2 mg/mL合成肽供評(píng)價(jià)小組進(jìn)行感官描述。采用三角試驗(yàn)法[20]確定二肽的呈鮮閾值，樣品用超純水溶解，將起始質(zhì)量濃度為2 mg/mL的合成肽溶液逐級(jí)稀釋，至評(píng)價(jià)小組無(wú)法品嘗出溶液中的鮮味，則該合成肽的呈鮮閾值即為倒數(shù)第2個(gè)合成肽溶液的質(zhì)量濃度值。采用各感官評(píng)價(jià)員評(píng)定結(jié)果的平均值，且每個(gè)評(píng)定員之間的誤差應(yīng)不超過(guò)2個(gè)稀釋水平。感官評(píng)價(jià)在恒定溫度（24±1）℃下進(jìn)行。

1.2.2 鮮味受體同源建模與能量?jī)?yōu)化

獲取目標(biāo)蛋白序列后，于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行protein blast比對(duì)，以序列覆蓋率較高、E值小于10-5以及序列相似性大于30%為標(biāo)準(zhǔn)[21]，選取打分較高的蛋白作為備選模板。利用SYBYL-X 2.0將模板與目標(biāo)蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，選取序列一致性最高且RMSD值最小的模板，利用SWISS-MODEL進(jìn)行建模。利用SYBYL-X 2.0軟件中的Powell法對(duì)模型進(jìn)行能量最小化（Minimize）處理。

1.2.3 模型評(píng)估

利用拉氏圖與Verify 3D對(duì)優(yōu)化后的模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)評(píng)估。

1.2.4 Pro、Glu二肽與鮮味受體的分子對(duì)接

1.2.4.1 小分子配體的準(zhǔn)備

通過(guò)SYBYL-X 2.0中的sketch模塊與蛋白質(zhì)自動(dòng)生成模塊建立目標(biāo)二肽結(jié)構(gòu)，采用tripos力場(chǎng)對(duì)二肽分子進(jìn)行能量最小化處理。

1.2.4.2 分子對(duì)接

采用Docking suite模塊準(zhǔn)備模塊蛋白與二肽分子。對(duì)模塊蛋白進(jìn)行末端殘基修復(fù)與加氫處理后，Automatic模式生成活性口袋，Surflex for searching模式對(duì)二肽分子進(jìn)行準(zhǔn)備處理，最后利用Surflex-Dock Screen模式進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算受體與配體的對(duì)接分值并預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，綜合考慮打分函數(shù)的一致性，選擇對(duì)接總評(píng)分最高的構(gòu)象以進(jìn)行后續(xù)分析研究。

1.2.4.3 配體-受體相互作用研究

利用SYBYL-X 2.0中的Merge功能將配體的最優(yōu)對(duì)接構(gòu)象與受體進(jìn)行合并，得到配體-受體復(fù)合物，再利用Proteins Plus中的PoseView 2D interaction diagrams模塊做出配體與受體的相互作用模式圖。利用SYBYL-X 2.0中的MOLCAD模塊創(chuàng)建分子表面。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

分子對(duì)接所用軟件為SYBYL-X 2.0。二肽與鮮味受體結(jié)合的2D模式圖利用在線服務(wù)器Proteins Plus（https:proteins.plus/）得出。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pro、Glu二肽的感官評(píng)價(jià)

對(duì)合成Pro、Glu二肽進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。除Pro-Ser、Val-Pro和Leu-Glu不呈鮮，其余二肽的呈鮮閾值均低于谷氨酸鈉閾值（0.3 mg/mL）。其中γ-Glu-Met和Gly-Glu的呈鮮閾值最低，為0.07 mg/mL，說(shuō)明其鮮味強(qiáng)度最高，Pro-Ala的呈鮮閾值最高，為0.21 mg/mL，說(shuō)明其鮮味強(qiáng)度最低。呈鮮閾值較低的肽如γ-Glu-Met、Gly-Glu、Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala和Pro-Val等具有較強(qiáng)的鮮味。所有二肽均未表現(xiàn)出苦味，表明含有疏水性氨基酸的二肽不一定呈現(xiàn)苦味，可能是由于部分疏水性基團(tuán)對(duì)呈鮮起輔助作用[22]。呈鮮味的二肽都伴隨著一定的酸味和甜味，Zhang等[23]也發(fā)現(xiàn)鮮味肽除了呈鮮味，也呈酸味、苦味和甜味，證明鮮味肽并不是呈單一鮮味，而是具有以鮮味為主的多種呈味效果，對(duì)鮮味肽呈鮮起重要作用。具有相同氨基酸但排列順序不同的二肽呈鮮閾值有差異，當(dāng)Pro位于肽鏈C端時(shí)，二肽呈鮮閾值相對(duì)較低，表明鮮味肽的鮮味與其氨基酸排列順序及肽鏈的構(gòu)效有關(guān)。γ-Glu-Met和Gly-Glu均比其相反氨基酸序列二肽的呈鮮閾值低，可能是由于相反序列導(dǎo)致二肽空間構(gòu)效差異，改變肽與受體的相互作用，影響肽與受體的結(jié)合位置，使其產(chǎn)生不同的呈鮮效果。

表1 二肽的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 The sensory evaluation of dipeptides

2.2 鮮味受體同源建模

T1R1、T1R3及CaSR受體同源模板結(jié)果如表2～4所示，T1R1和T1R3模板序列覆蓋率均≥54.00%，E值均接近于0。E值越低則打分結(jié)果越可靠[21]。序列相似性大于30%表明模型可靠[21]，CaSR模板序列一致性≥64.00%，同源性較高。RMSD表示模板蛋白與目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)一致性，該值越小則蛋白的結(jié)構(gòu)一致性越強(qiáng)。因此T1R1、T1R3建模模板為5x2m，CaSR建模模板為5fbh，其他學(xué)者也采用了5x2m[21]和5fbh[24]作為建模模板。

表2 T1R1同源模板序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequence alignment results of T1R1 homologous template

表3 T1R3同源模板序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Sequence alignment results of T1R3 homologous template

表4 CaSR同源模板序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Sequence alignment results of CaSR homologous template

表5 二肽與T1R1、T1R3及CaSR受體的分子對(duì)接評(píng)分Table 5 Molecular docking score of dipeptides with T1R1,T1R3 and CaSR receptors

2.3 模型評(píng)估

T1R1、T1R3和CaSR受體的模型圖、拉氏圖與Verify 3D打分結(jié)果如圖1、圖2所示，圖1中a、c為受體蛋白模型圖，b、d為拉氏圖，e、f和圖2c為Verify 3D評(píng)分圖。

圖1 T1R1（a、b、e），T1R3（c、d、f）模型結(jié)構(gòu)與模型評(píng)估Fig.1 T1R1 (a, b, e), T1R3 (c, d, f) model structure and model evaluation

圖2 CaSR模型結(jié)構(gòu)與模型評(píng)估Fig.2 CaSR model structure and model evaluation

拉氏圖中的圓點(diǎn)代表蛋白的氨基酸殘基，綠色越深則氨基酸殘基構(gòu)象越合理，白色區(qū)域?yàn)椴豢山邮軈^(qū)[25]。結(jié)果顯示，T1R1模型中99.13%的氨基酸處于合理區(qū)，其中94.14%處于最適區(qū)，4.99%處于可接受區(qū)；T1R3模型中98.07%的氨基酸處于合理區(qū)，其中92.70%處于最適區(qū)，5.37%處于可接受區(qū)；CaSR模型中99.12%的氨基酸處于合理區(qū)，其中95.71%處于最適區(qū)，3.41%處于可接受區(qū)。當(dāng)不低于90%的ψ，φ二面角分布在可接受區(qū)則表明模型合理[26]，因此3個(gè)模型均合理。Verify 3D打分顯示模型均具有超過(guò)90%的氨基酸殘基3D/1D值大于0.2，表明模型質(zhì)量合格。三個(gè)受體蛋白的配體結(jié)合口袋如受體模型圖中綠色區(qū)域所示，均位于受體中心的空腔區(qū)域，位置與前人研究結(jié)果基本一致[24,27,28]。

2.4 二肽與鮮味受體的分子對(duì)接

2.4.1 對(duì)接評(píng)分

選擇感官評(píng)價(jià)結(jié)果中呈鮮的4個(gè)Pro二肽和5個(gè)Glu二肽及鮮味基準(zhǔn)物谷氨酸鈉（MSG）與T1R1、T1R3及CaSR受體進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)分，考慮了分子極性、疏水性、焓和溶劑化等因素，對(duì)配體與受體的結(jié)合親和程度，一般認(rèn)為評(píng)分≥7表示受體與配體結(jié)合能力強(qiáng)，小于4則結(jié)合能力弱[29]。

Pro二肽與T1R1對(duì)接評(píng)分均高于與T1R3和CaSR的評(píng)分，與T1R1結(jié)合較為緊密，顧華蓉等[30]在Pro二肽呈鮮特性中也發(fā)現(xiàn)T1R1可能是Pro二肽呈鮮的重要受體。

Glu二肽與受體的對(duì)接評(píng)分均大于6.90，同時(shí)也均大于MSG的相應(yīng)對(duì)接評(píng)分，大多數(shù)超過(guò)8分，肽與受體的親和程度較高。除Gly-Glu和γ-Glu-Leu，其余Glu二肽與T1R1和CaSR的對(duì)接評(píng)分高于T1R3，提示Glu二肽主要與T1R1和CaSR結(jié)合呈鮮，可能與T1R3受體特殊的結(jié)合構(gòu)象有關(guān)[31]。與T1R1和CaSR的對(duì)接評(píng)分顯示，N-γ-Glu二肽的評(píng)分均高于相同氨基酸組成的C-Glu二肽，與T1R1和CaSR結(jié)合更為緊密，進(jìn)一步說(shuō)明鮮味肽呈鮮效果與氨基酸排列順序有關(guān)，Masahiro等[32]發(fā)現(xiàn)二肽氨基酸順序排列相反時(shí)，Lys-Glu不具有鮮味，Glu-Lys具有鮮味，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

2.4.2 二肽與鮮味受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基分析

表6為二肽與鮮味受體的對(duì)接能量。Glu二肽的對(duì)接能量整體大于Pro二肽，對(duì)接能量越低，肽與受體結(jié)合的親和力越強(qiáng)，說(shuō)明Glu二肽更易與受體結(jié)合。其中γ-Glu-Met和Gly-Glu進(jìn)入T1R1、T1R3和CaSR結(jié)合腔所需能量最低，結(jié)合的親和力最強(qiáng)，可能是由于能更嵌入到受體的結(jié)合口袋部位，最終導(dǎo)致γ-Glu-Met和Gly-Glu的呈鮮閾值低。

表6 二肽與鮮味受體的對(duì)接能量（kcal/mol）Table 6 The docking energies of dipeptides with umami receptors

表7中結(jié)合位點(diǎn)Asp147和Arg277出現(xiàn)頻率和成鍵數(shù)量均較多，可能是二肽與T1R1的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。Thr149和Ser172出現(xiàn)4次，與T1R1形成氫鍵的均為Glu二肽，同時(shí)Thr149是MSG與T1R1的結(jié)合位點(diǎn)，Thr149和Ser172可能是Glu二肽與T1R1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[26,33]，T1R1是Glu二肽呈鮮的重要受體。Liu等[28]和Zhang等[33]鑒定出T1R1的關(guān)鍵氨基酸殘基有D147、S148、T149、S172、Y220、R277、Q278、A302，S385，除Ala302外，其余殘基也在本研究中Pro、Glu二肽與T1R1的對(duì)接位點(diǎn)，進(jìn)一步證明其具有呈鮮特性。

表7 二肽與T1R1受體的結(jié)合位點(diǎn)Table 7 Binding sites of dipeptides to T1R1 receptor

表8中Glu45、Ser147、Val277和His278出現(xiàn)頻率和成鍵數(shù)量較多，Ser147同時(shí)是MSG與T1R3的結(jié)合位點(diǎn)，這些殘基可能是二肽與T1R3的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。與Ser147結(jié)合的均為N-γ-Glu二肽，而谷氨酸位于C端的二肽，除Gly-Glu外其余均不能與Ser147結(jié)合，Ser147可能是N-γ-Glu二肽與T1R3的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。Pro、Glu二肽均能在His145、Ser147、Ser170和Gly168結(jié)合T1R3，Cascales等[34]發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)是T1R3上的關(guān)鍵氨基酸殘基，進(jìn)一步表明二肽可通過(guò)T1R3受體呈鮮。

表8 二肽與T1R3受體的結(jié)合位點(diǎn)Table 8 Binding sites of dipeptides to T1R3 receptor

表9顯示Leu173、Asn176、Gln179、Arg220和Ser244是Pro、Glu二肽與CaSR結(jié)合較多的位點(diǎn)，其中在Asn176、Gln179殘基處對(duì)接的肽有5個(gè)，成鍵數(shù)也較多，這些位點(diǎn)可能是二肽與CaSR的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。Pro二肽中的Pro-Ala與Ser-Pro分別在Asp275處與受體形成3或4個(gè)氫鍵，主要原因是其引起鮮味受體細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)[30]，產(chǎn)生較多的氫鍵結(jié)合；除Gln179和Asp275位點(diǎn)外，其余4個(gè)位點(diǎn)主要結(jié)合Glu二肽，氫鍵數(shù)也較多，說(shuō)明相比于Pro二肽，Glu二肽更易與CaSR結(jié)合。Asn102、Asp216、Ser272、Asp275是CaSR激活劑與CaSR的相互作用位點(diǎn)[24]，部分二肽可在這些位點(diǎn)與CaSR形成氫鍵，進(jìn)一步驗(yàn)證Pro、Glu二肽也能通過(guò)與上述殘基結(jié)合激活CaSR受體。

表9 二肽與CaSR受體的結(jié)合位點(diǎn)Table 9 Binding sites of dipeptides to CaSR receptor

2.4.3 Pro、Glu二肽的呈鮮構(gòu)效關(guān)系

Pro、Glu二肽與T1R1、T1R3和CaSR不同的結(jié)合能力影響鮮味閾值和呈鮮強(qiáng)度，主要與二肽與受體間的構(gòu)效關(guān)系有關(guān)，因此分析了Pro、Glu二肽及其潛在鮮味受體的構(gòu)效關(guān)系，同時(shí)分別將未呈鮮二肽Pro-Ser、Val-Pro和Leu-Glu的受體-配體結(jié)合情況與鮮味較強(qiáng)的Ser-Pro、Pro-Val和Glu-Leu進(jìn)行對(duì)比，探究導(dǎo)致其呈鮮效果差異的原因。

圖3顯示Ser-Pro與T1R1受體上的Ser107、Ser148、Asp218、Arg277及Gln278 殘基形成氫鍵，與Gln278存在疏水相互作用。圖4中Pro-Ser的對(duì)接位點(diǎn)為T(mén)hr149、Asn150、Ser216及Ser276，比Ser-Pro少結(jié)合一個(gè)殘基且不存在疏水接觸。疏水相互作用是受體-配體結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力[35,36]，當(dāng)配體與受體的疏水區(qū)發(fā)生相互作用時(shí)，其間的水分子從疏水區(qū)排出，增加配體與受體的結(jié)合親和力，Ser-Pro與T1R1的疏水接觸使結(jié)合更加穩(wěn)定；Ser-Pro中絲氨酸位于N端有一個(gè)游離的氨基與受體形成氫鍵，而Pro-Ser中N端脯氨酸的亞氨基未能與受體形成氫鍵，因此Pro-Ser與T1R1的結(jié)合力相較于Ser-Pro更弱，Ser-Pro呈鮮閾值低，呈現(xiàn)較強(qiáng)鮮味，Pro-Ser不能呈鮮。

圖3 Ser-Pro與T1R1受體結(jié)合模式圖Fig.3 Binding pattern of Ser-Pro to T1R1 receptor

圖4 Pro-Ser與T1R1受體結(jié)合模式圖Fig.4 Binding pattern of Pro-Ser to T1R1 receptor

如圖5和圖6所示，Ala-Pro及Pro-Ala與T1R1均在Ser107與Asp147處對(duì)接，但Pro-Ala與Ala302殘基間存在疏水接觸，與T1R1的結(jié)合相對(duì)緊密。Ala-Pro及Pro-Ala與CaSR的結(jié)合位點(diǎn)完全不同，但均能形成氫鍵，丙氨酸是分子量?jī)H大于甘氨酸的氨基酸，僅含有一個(gè)甲基，Ala-Pro與Pro-Ala由于分子量小、體積小更易與鮮味受體結(jié)合，Ala-Pro中的丙氨酸殘基比Pro-Ala更接近受體活性口袋，因此Ala-Pro表現(xiàn)出較低的呈鮮閾值和較強(qiáng)鮮味，Dang等[37]報(bào)道在鮮味肽與鮮味受體研究中也發(fā)現(xiàn)小分子量的二肽或三肽更易與受體結(jié)合。

圖5 Ala-Pro與T1R1(a)、CaSR(b)受體結(jié)合模式圖Fig.5 Binding pattern of Ala-Pro to T1R1 (a), CaSR (b) receptor

圖6 Pro-Ala與T1R1(a)、CaSR(b)受體結(jié)合模式圖Fig.6 Binding pattern of Pro-Ala to T1R1 (a), CaSR (b) receptor

由圖7可知，Pro-Val和Val-Pro與T1R1均有3個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，其中Pro-Val與Arg277結(jié)合形成兩個(gè)氫鍵，Arg277是報(bào)道的關(guān)鍵氨基酸殘基[26]；Val-Pro與Ser276形成氫鍵，與Ser148及Ser276存在疏水相互作用，3D圖顯示Val-Pro的親水區(qū)域暴露于受體外，未能與受體產(chǎn)生相互作用，可能與溶劑水結(jié)合，導(dǎo)致與T1R1的結(jié)合親和力減弱。

圖7 Pro-Val與T1R1(a)、T1R3(b)受體結(jié)合模式圖Fig.7 Binding pattern of Pro-Val to T1R1 (a), T1R3 (b) receptor

Pro-Val和Val-Pro與T1R3之間均形成多個(gè)氫鍵且存在疏水接觸，其中Pro-Val與Glu45及Val277均形成兩個(gè)氫鍵，其疏水區(qū)被包裹在受體空腔內(nèi)部，配體-受體復(fù)合物更加穩(wěn)定；Val-Pro與圖8中結(jié)合口袋左側(cè)部分僅與His145的1個(gè)氫鍵連接，對(duì)接位置相比于Pro-Val更淺，疏水區(qū)域更接近結(jié)合口袋表面，導(dǎo)致Val-Pro與受體結(jié)合穩(wěn)定性差，未能呈鮮。鮮味肽與T1R3的結(jié)合歸因于C端氨基酸與受體關(guān)鍵氨基酸殘基之間的靜電相互作用、氫鍵等[38]，不同的C端氨基酸殘基使其產(chǎn)生有差異的結(jié)合力，導(dǎo)致Pro-Val和Val-Pro相反的呈味效果。

圖9所示，γ-Glu-Met與CaSR有5個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，形成8個(gè)氫鍵，其中與Asn176形成3個(gè)氫鍵，與Tyr246存在疏水接觸。γ-Glu-Met分子各部分均可與CaSR形成相互作用，Glu殘基嵌入受體深處，與受體結(jié)合更緊密，呈鮮閾值低至0.07 mg/mL。莊金達(dá)[39]研究發(fā)現(xiàn)鮮味肽與受體形成的疏水相互作用可增強(qiáng)二者的親和力，與本研究結(jié)果一致。Met-Glu與CaSR有5個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，形成9個(gè)氫鍵，從3D圖可見(jiàn)Met-Glu的親水區(qū)Glu殘基朝向受體表面，易與溶劑水結(jié)合導(dǎo)致與受體親和力減弱，與CaSR的對(duì)接評(píng)分（8.80）小于γ-Glu-Met，呈鮮閾值也高于γ-Glu-Met兩倍多，故Met-Glu鮮味程度小于γ-Glu-Met，從受體與分子的角度表明γ-Glu-Met可通過(guò)結(jié)合CaSR受體呈現(xiàn)較強(qiáng)鮮味。

圖9 γ-Glu-Met(a)、Met-Glu(b)與CaSR受體結(jié)合模式圖Fig.9 Binding pattern of γ-Glu-Met (a), Met-Glu (b) to CaSR receptor

圖10和11可知，Gly-Glu與多個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵，均完全嵌于兩個(gè)受體結(jié)合口袋內(nèi)部，可能與分子大小有關(guān)[37]，Gly-Glu中甘氨酸的R基僅為一個(gè)氫原子，Gly-Glu分子更易進(jìn)入受體的結(jié)合口袋。γ-Glu-Gly與T1R1、T1R3分別有5個(gè)或6個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，氫鍵數(shù)較多，但呈味強(qiáng)度弱于Gly-Glu，可能與二肽與受體的結(jié)合位置有關(guān)：與T1R1的結(jié)合圖可知，γ-Glu-Gly的親水區(qū)趨向受體外表面，易與水分子親和而減弱二肽與受體的結(jié)合力；在與T1R3結(jié)合時(shí)，γ-Glu-Gly分子整體位于結(jié)合口袋的淺表處，疏水區(qū)域暴露于受體表面，水溶液中的配體與受體結(jié)合不穩(wěn)定，阮仕艷[40]發(fā)現(xiàn)鮮味肽與T1R3受體氫鍵數(shù)越多，距離越短，越能結(jié)合受體口袋，本研究中位于結(jié)合口袋淺表處的γ-Glu-Gly可能由于與受體口袋中心距離較遠(yuǎn)，使γ-Glu-Gly呈味強(qiáng)度弱于Gly-Glu。

圖10 Gly-Glu與T1R1(a)、T1R3(b)受體結(jié)合模式圖Fig.10 Binding pattern of Gly-Glu to T1R1 (a), T1R3 (b) receptor

圖11 γ-Glu-Gly與T1R1(a)、T1R3(b)受體結(jié)合模式圖Fig.11 Binding pattern of γ-Glu-Gly to T1R1 (a), T1R3 (b) receptor

圖12顯示γ-Glu-Leu、Leu-Glu與T1R1均存在多個(gè)對(duì)接位點(diǎn)且形成7個(gè)氫鍵，但Leu-Glu的對(duì)接評(píng)分（7.60）遠(yuǎn)低于γ-Glu-Leu（9.70），感官評(píng)價(jià)顯示Leu-Glu未呈鮮，上述結(jié)果表明Leu-Glu與T1R1的結(jié)合效果不理想，與二肽分子的對(duì)接位置有關(guān)。從3D圖可見(jiàn)，γ-Glu-Leu以水平向的狀態(tài)被包裹于受體結(jié)合口袋內(nèi)部較深的位置，而Leu-Glu是以豎直向狀態(tài)嵌于受體結(jié)合口袋，位置較淺，疏水區(qū)域暴露于受體表面，因此Leu-Glu與T1R1的結(jié)合穩(wěn)定性弱于γ-Glu-Leu，導(dǎo)致呈鮮能力弱。

圖12 γ-Glu-Leu(a)、Leu-Glu(b)與T1R1受體結(jié)合模式圖Fig.12 Binding pattern of γ-Glu-Leu (a), Leu-Glu (b) to T1R1 receptor

3 結(jié)論

本研究以感官評(píng)價(jià)為基礎(chǔ)，利用同源建模、分子對(duì)接技術(shù)研究Pro、Glu二肽與鮮味受體T1R1、T1R3和CaSR的構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明：除Pro-Ser、Val-Pro和Leu-Glu不呈鮮，其余二肽的呈鮮閾值均低于谷氨酸鈉閾值，γ-Glu-Met、Gly-Glu、Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala和Pro-Val等具有較強(qiáng)鮮味。二肽與T1R1的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)為Asp147、Thr149、Ser172和Arg277，T1R1是Glu二肽呈鮮的重要受體；與T1R3的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)為Glu45、Ser147、Val277和His278，Ser147是N-γ-Glu二肽與T1R3受體的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)；與CaSR的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)eu173、Asn176、Gln179、Arg220、Ser244和Asp275，Glu二肽比Pro二肽更易與CaSR受體結(jié)合。二肽與受體之間主要通過(guò)氫鍵與疏水相互作用結(jié)合，呈味較強(qiáng)的二肽在對(duì)接時(shí)多嵌于受體結(jié)合口袋的深處，或與受體間形成多個(gè)氫鍵及疏水接觸；呈味較弱的二肽有的位于結(jié)合口袋較淺的位置，有的肽疏水區(qū)或親水區(qū)暴露于受體表面，配體與受體結(jié)合不穩(wěn)定或易與溶劑水發(fā)生相互作用影響結(jié)合穩(wěn)定性。本研究明晰了Pro、Glu二肽呈鮮的構(gòu)效關(guān)系，有助于闡明二肽與T1R1、T1R3和CaSR鮮味受體分子相互作用機(jī)制，為鮮味肽呈鮮機(jī)理的研究提供了理論依據(jù)。