黃丕苗，蘇愛華，崔春

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

慢性失眠癥、短期失眠癥及其他類型的失眠癥均為典型的睡眠障礙癥狀[1]。睡眠是生命的基本需要，睡眠不僅可以消除疲勞、恢復(fù)精力，而且可以保護(hù)大腦、增強(qiáng)機(jī)體免疫力。長時間睡眠不足會破壞身體多個系統(tǒng)的功能，而健康豐富的睡眠有助于身心健康。據(jù)《2022中國國民健康睡眠白皮書》顯示，我國老年人自我認(rèn)知睡眠質(zhì)量非常差，42%的老年人入睡時長超過半小時，失眠發(fā)生率高達(dá)21%，而成人中患有不同程度失眠癥高達(dá)57%，且睡眠質(zhì)量差發(fā)生率有隨年齡增長而上升的趨勢，故我國國民失眠率亦可能逐年升高。因此，對提高睡眠、改善失眠的研究也就顯尤為迫切[2]。

酸棗仁（Ziziphus jujuba）為鼠李科棗屬植物干燥的種子，主要活性成分包括皂苷、三萜類化合物、黃酮類化合物等，具有寧心安神、提高免疫力、養(yǎng)肝、鎮(zhèn)靜催眠的作用[3,4]，被稱為“東方睡果”。酸棗仁提取物是臨床上中醫(yī)藥治療失眠癥狀的首選藥物[5,6]。龍眼肉提取物（Longan Aril Extract）主要提取自龍眼干的部分假種皮，其主要化學(xué)成分包括揮發(fā)性成分萜類、甾醇、磷脂、鞣質(zhì)、多糖等化合物，具有養(yǎng)血安神、調(diào)節(jié)失眠、抗應(yīng)激等功效[7]，可以作為醫(yī)藥保健品和飲料食品添加劑。γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是以L-谷氨酸鈉為原料，經(jīng)短乳桿菌發(fā)酵、純化、過濾濃縮、結(jié)晶、分離，噴霧干燥等工藝而制成。作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起到分子信號的作用，GABA可進(jìn)入下丘腦周圍區(qū)域等缺乏血腦屏障的大腦外周神經(jīng)系統(tǒng)，抑制大腦神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，從而改善失眠癥狀[8]，2009年就將被列入新資源食品原料[9]。

有鑒于此，本研究根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）對酸棗仁提取物、龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸改善小鼠睡眠功能的效果進(jìn)行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級ICR健康雄性小鼠120只，體質(zhì)量18～22 g。小鼠購于南京君科生物工程有限公司（許可證號SCXK（豫）2020-0005），飼料購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2 材料

龍眼肉提取物（水提物）：購于黃山華綠園生物科技有限公司提供，多糖含量≥30%；酸棗仁提取物，自制，經(jīng)粉碎、水提、濃縮、噴霧干燥（加糊精），黃酮含量≥20%、多糖含量≥35%；3 g酸棗仁可制得1 g提取物；γ-氨基丁酸：購于南通勵成生物工程有限公司（純度≥95%）。

1.3 試劑

巴比妥鈉和戊巴比妥鈉（分析純）：北京華美生物科技技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器與設(shè)備

Coleparmer秒表購于廣州市賽拓儀器科技有限公司；XPR226DR/AC電子天平梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

1.5 方法

依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[10]對小鼠直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗進(jìn)行檢測。

1.5.1 延長戊巴比妥鈉睡眠時間預(yù)試驗

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時間預(yù)實驗。參考酸棗仁提取物成人日推薦量為2.4 g[11]，龍眼肉提取物成人日推薦量為3 g，γ-氨基丁酸成人日推薦量為小于500 mg[9]，成人體質(zhì)量以60 kg計，即酸棗仁提取物相當(dāng)于40 mg/(kg·d)，龍眼肉提取物相當(dāng)于50 mg/(kg·d)，γ-氨基丁酸相當(dāng)于8.33 mg/(kg·d)。取正常飼喂小鼠40只，將動物的體質(zhì)量均勻分配，以8只為一組分成5組，選擇一系列劑量（40、45、50、55和60 mg/kg）進(jìn)行預(yù)試驗，注射劑量為0.2 mL，完成動物分組和劑量計算后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，觀察出現(xiàn)的癥狀并記錄。使用55 mg/kg的注射劑量可以使實驗小鼠全部進(jìn)入睡眠狀態(tài)，且其平均睡眠時間控制在60 min以內(nèi)，是研究供試品延長戊巴比妥鈉睡眠時間的最合適劑量。

1.5.2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠預(yù)試驗

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠預(yù)實驗。取正常飼喂小鼠40只，將動物的體質(zhì)量均勻分配，以12只為一組分成4組，選擇一系列劑量（18、22、26和30 mg/kg）進(jìn)行預(yù)試驗，注射劑量為0.2 mL，完成動物分組和劑量計算后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，觀察出現(xiàn)的癥狀并記錄。確定使用30 mg/kg的注射劑量可以使16%的實驗小鼠翻正反射消失。

1.5.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期預(yù)試驗

取正常飼喂小鼠36只，將動物的體質(zhì)量均勻分配，以6只為一組分成6組，選擇一系列劑量（44、48、52、56和60 mg/kg）進(jìn)行預(yù)試驗，注射劑量為0.2 mL。確定注射量為200 mg/kg可以使100%的實驗小鼠入睡，且入睡潛伏期為5.09 min，為實驗可操作的合適范圍。

1.5.4 酸棗仁提取物、龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸劑量

酸棗仁提取物高（H）、中（M）、低（L）劑量分別為110、55和27.5 mg/(kg·d)；龍眼肉提取物H、M、L劑量分別為266、133和66.5 mg/(kg·d)；γ-氨基丁酸H、M、L劑量分別為33.3、16.7和8.3 mg/(kg·d)。

1.5.5 受試物給予方式

每組動物每天進(jìn)行稱質(zhì)量，并按2.0 mL/100 g體質(zhì)量經(jīng)口灌胃給予不同濃度的受試物及蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。

1.6 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種功能因子對小鼠直接睡眠作用觀察結(jié)果

由表1可知，酸棗仁提取物、龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸在高中低3個劑量組對實驗小鼠直接睡眠作用均無差異，且與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，3種功能因子高中低劑量組小鼠體質(zhì)量差異無顯著性；給予受試物后各組小鼠的生活狀態(tài)正常，毛發(fā)光亮，未觀察到直接睡眠作用。

表1 3種功能因子對小鼠直接睡眠作用觀察結(jié)果(x±s)Table 1 The effect of three functional factors on the direct sleep of mice

2.2 3種功能因子對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響

由表2可知，γ-氨基丁酸高中低劑量、酸棗仁提取物高中劑量和龍眼肉低劑量組均可顯著延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中酸棗仁提取物高劑量組對延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的作用最好，睡眠時間能達(dá)到3 538.35 s，但酸棗仁低劑量組和龍眼肉提取物高中劑量和對延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。黃遠(yuǎn)英等[12]研究酪蛋白水解物與γ-氨基丁酸復(fù)配制劑對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響時發(fā)現(xiàn)，復(fù)配制劑高劑量和中劑量可顯著延長其睡眠時間10%左右。與之對比，本實驗酸棗仁高劑量組和γ-氨基丁酸高劑量組可將戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間延長1倍以上；酸棗仁中劑量組和γ-氨基丁酸中劑量組可延長睡眠時間50%左右。兩者的差異可能是本實驗用量略高于黃遠(yuǎn)英等。3種功能因子對小鼠體質(zhì)量均無顯著影響。

表2 3種功能因子對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響(x±s)Table 2 The Effects of three functional factors on sleep time of mice induced by pentobarbital sodium

2.3 三種功能因子對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

由表3可知，3種功能因子中γ-氨基丁酸對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用最大，12只小鼠中高中低劑量均有2只入睡，睡眠發(fā)生率達(dá)到16.67%；酸棗仁提取物高劑量和低劑量對12只小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用時均只有1只入睡；龍眼肉提取物高劑量對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用時，12只小鼠中有1只入睡，睡眠發(fā)生率只有8.33%。三種功能因子的高中低劑量組動物入睡數(shù)與對照組進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但γ-氨基丁酸提高閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠發(fā)生率作用略高于酸棗仁提取物和龍眼肉提取物。袁根良等[13]研究天麻酸棗仁復(fù)合膠囊對閾下劑量戊巴比妥納誘導(dǎo)睡眠發(fā)生率的影響時發(fā)現(xiàn)，對照組相比，復(fù)合膠囊高中低劑量對小鼠的睡眠發(fā)生率的差異不顯著，且無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這與本研究得出的酸棗仁提取物對閾下劑量戊巴比妥納誘導(dǎo)的小鼠睡眠發(fā)生率無明顯作用相符。劉春芳等[14]研究靈芝多糖γ-氨基丁酸片制劑對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用時發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖γ-氨基丁酸片高低劑量作用時12只小鼠中有3只入睡，中劑量有2只入睡，證實該片劑對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗與對照組相比無顯著性差異，其結(jié)論與本實驗的結(jié)果一致。

表3 三種功能因子對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響(x±s)Table 3 The effects of three functional factors on hypnotisubthreshold pentobarbital sodium in mice

2.4 三種功能因子對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠入睡潛伏期的影響

由表4可知，酸棗仁提取物高中低劑量組均可縮短巴比妥鈉催眠的小鼠的入睡潛伏期，但只有高、中劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸還延長了巴比妥鈉催眠的小鼠的入睡潛伏期，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。陳希民等[15]研究酸棗仁提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸復(fù)合配方產(chǎn)品對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響時發(fā)現(xiàn)，復(fù)合配方低、中、高劑量組的小鼠入睡潛伏期時間分別縮短12.48%、24.19%、24.07%，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與之相比，本論文中巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期實驗，酸棗仁提取物中、高劑量組（55、110 mg/kg·d）作用后，小鼠入睡潛伏期分別為177.20、145.06 s，與對照組相比，中、高劑量組小鼠入睡潛伏期時間分別縮短44.33%、51.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著劑量的增加，小鼠入睡潛伏期也逐漸縮短，說明酸棗仁提取物縮短小鼠入睡潛伏期功效具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。兩者結(jié)果的差異可能是本實驗是單獨使用酸棗仁提取物，而黃遠(yuǎn)英等[12]是將酸棗仁提取物與茶氨酸、γ-氨基丁酸進(jìn)行復(fù)配，從而也說明在此劑量下，酸棗仁提取物單獨使用的功效高于與茶氨酸、γ-氨基丁復(fù)配使用。

表4 三種功能因子對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠入睡潛伏期的影響（x±s）Table 4 The effect of sample on the latency of mice induced by sodium sodium

3 結(jié)論

采用經(jīng)口灌胃法給予小鼠不同劑量的酸棗仁提取物、龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸30 d后，γ-氨基丁酸高中低劑量、酸棗仁提取物高中劑量和龍眼肉低劑量組均可顯著延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間，其中酸棗仁高劑量組和γ-氨基丁酸高劑量組可將戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間延長1倍以上；酸棗仁中劑量組和γ-氨基丁酸中劑量組可延長睡眠時間50%左右。此外，酸棗仁提取物高中低劑量組均可縮短巴比妥鈉催眠的小鼠的入睡潛伏期，但僅高劑量組和中劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，酸棗仁提取物、龍眼肉提取物和γ-氨基丁酸的所有劑量組對小鼠體質(zhì)量無顯著性影響，給予受試物后各組小鼠活動正常，毛發(fā)光亮，都對直接睡眠無明顯作用。

本論文可為酸棗仁提取物、龍眼肉提取物與γ-氨基丁酸復(fù)配生產(chǎn)改善睡眠產(chǎn)品研究奠定基礎(chǔ)。