王翔 趙琛 閆舟 張琛浩 曹睿

摘要：為研究4 種薔薇屬植物（毛萼薔薇、大花香水月季、維西薔薇、麗江薔薇）的抗寒性差異，以篩選出耐寒性強的品種，利用低溫培養(yǎng)箱進行不同梯度低溫（0、-5、-10、-15 ℃）脅迫處理，測定4 種薔薇屬植物可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、脯氨酸（Pro）含量、SOD 活性、POD 活性及耐寒相關(guān)調(diào)控基因HSP90 的表達差異。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，4 種薔薇屬植物葉片可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、SOD 活性和POD 活性均隨低溫脅迫加劇呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。對4 種薔薇屬植物HSP90 基因的差異表達分析表明，該基因在4 種植物中的相對表達量隨低溫脅迫加劇呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其中，毛萼薔薇在0、-5、-10、-15 ℃低溫脅迫下HSP90 基因表達量均最高。表明4 種薔薇屬植物的抗寒性存在差異，其中，毛萼薔薇的抗寒性較好。

關(guān)鍵詞：薔薇屬；生理變化；低溫脅迫；基因差異表達

中圖分類號：S685.12 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）03?0241?08

月季（Rosa hybrida） 是薔薇屬（Rosa） 多年生木本花卉，素有“花中皇后”之美譽，因其花色豐富、品種繁多而深受人們喜愛。月季具有花期相對較長、適應(yīng)性廣的特征，讓其名列我國十大名花，在盆栽以及地栽等場景廣泛栽種，有著巨大的市場潛力。近些年，隨著現(xiàn)代月季品種性狀改良的不斷發(fā)展，低溫環(huán)境對于月季品質(zhì)所產(chǎn)生的影響不斷增加，諸如低溫會造成枝條發(fā)育受到限制、花瓣出現(xiàn)畸形等問題，給馴化和培育種植帶來了更多挑戰(zhàn)。當前，冬季環(huán)境下顯著偏低的溫度極大影響到花卉的品質(zhì)，因此，選擇和培育有耐寒特征的月季品種，是加強月季推廣的重要方式[1-6]。低溫會極大影響到植株的生長與分布，對于植物發(fā)育所產(chǎn)生的影響會顯著大于其他環(huán)境因素[7-9]。低溫脅迫一方面會顯著影響到植株生物量等關(guān)鍵因素，另一方面還會造成代謝紊亂，在超低溫的環(huán)境下還可能導致植株出現(xiàn)死亡[10]。有研究結(jié)果表明，植物在識別到外部環(huán)境溫度過低時，會自發(fā)啟動防御，隨之而促成細胞膜透性的提升，因此，產(chǎn)生活性氧，保護酶也較為快速地增多，滲透調(diào)控物質(zhì)SP、SS 與Pro[11]以及MDA含量增加[12]，而與代謝有密切聯(lián)系的生理活動會遭遇顯著抑制[13]。在植物抗寒性的分析中， LT50與相關(guān)生理指標通常被視為抗寒性的重要指標[14-15]。植物在低溫環(huán)境中的生理與生化表現(xiàn)可能會因各種基因的調(diào)控機制產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，并再度誘導相關(guān)基因的表達，進一步避免逆境損害的出現(xiàn)[16]。HSPs（熱激蛋白）對外界環(huán)境變化敏感，在逆境脅迫下高表達的HSPs 對細胞可能起到一定保護作用[17]，提高機體對逆境的適應(yīng)能力，從而增強抗逆性。也有學者研究發(fā)現(xiàn)，HSP 熱激蛋白會在相關(guān)脅迫中產(chǎn)生顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效果[18]。目前特定基因的表達研究在低溫響應(yīng)機制、重要基因挖掘等領(lǐng)域取得了很多成果，廣泛運用到擬南芥[19]、小麥[20]等各類作物的分析中。當前科學家尋找到數(shù)百個基因?qū)τ趹?yīng)答反應(yīng)會產(chǎn)生巨大的影響，XU 等[21]通過對野生山葡萄開展深度分析，得出其依靠管控相關(guān)基因的差異表達，進而應(yīng)對外界的寒冷環(huán)境。中外學者圍繞抗寒性的分析，多數(shù)是關(guān)于生理指標的對比性分析[22-23]，而圍繞抗寒機制開展分子水平研究顯著偏少。

為更加深入研究月季抗寒原理，本研究選擇4 種薔薇屬植物，分析低溫脅迫中HSP90 基因表達變化和相關(guān)生理指標差異，為探究分析月季抗寒機制與品種選育提供一定的數(shù)據(jù)支撐，以期為月季栽培推廣提供支持。

1材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用毛萼薔薇（R. lasiosepala）（編號S1）、大花香水月季（R. odorata. var. gigantea）（編號S2）、維西薔薇（R. weisiensis）（編號S3）和麗江薔薇（R. lichiangensis）（編號S4）4 種薔薇屬植物的盆栽苗為研究對象，均來自云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所薔薇屬種質(zhì)資源圃，為3 年生嫁接植株，植株生長健壯。

1.2 試驗方法

2020 年12 月，選定發(fā)育無異常、長勢較為接近的扦插苗54 株分別栽入到花盆，放在溫室（溫度設(shè)定為25 ℃，濕度設(shè)定為65%，光強為200 lx，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗）中持續(xù)培育14 d。每個處理選用3 株，每個處理3 次重復。分別在人工低溫氣候箱進行0、-5、-10、-15 ℃低溫下脅迫2 h，從各處理植株選取成熟葉片，用于半致死溫度和各相關(guān)生理指標的測定。同時迅速取各植株頂端幼嫩葉片裝入到離心管中，立即投入到液氮中降溫速凍后，置于-80 ℃ 冰箱中保存，用于RNA 的提取和qPCR 試驗。以上試驗重復3 次。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生理生化指標的測定 參考陳建勛等[24]方法測定丙二醛（MDA）含量、游離脯氨酸（Pro）含量、SOD 活性、POD 活性與可溶性糖（SS）含量、可溶性蛋白（SP）含量。

1.3.2 總RNA 提取與cDNA 合成 使用RNA ExtractionKit（大連Takara）提取得到各植株葉片的總RNA。使用NanoDrop 2000 測定獲得具體的RNA純度、完整性以及RIN 值。然后使用qPCR 逆轉(zhuǎn)錄盒PrimeScript TMRT reagent Kit（大連Takara）合成cDNA，具體流程詳見相應(yīng)說明書。

1.3.3 qPCR 候選基因與引物設(shè)計 參考李瑞雪等[25]所提出的方法，完成HSP90 基因差異表達研究，應(yīng)用qPCR 分析使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（大連Takara），結(jié)合說明書的流程穩(wěn)定推進。參照文獻[26]的方法計算基因相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Excel 2016、SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對薔薇屬植物LT50的影響

不同薔薇屬植物的LT50比較結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，4 種薔薇屬植物LT50 為-18.87～-10.52 ℃，而S1 與S2 的半致死溫度均低于-15 ℃，S3 與S4 的半致死溫度低于-10 ℃，但高于-15 ℃?？梢? 種薔薇屬植物的LT50 指標從小到大依次為S1

2.2 低溫脅迫對薔薇屬植物可溶性蛋白含量的影響

由圖2 可知，在0 ℃環(huán)境下開展低溫脅迫，4 種薔薇屬植物葉片的SP 指標差異顯著，可溶性蛋白含量隨著溫度降低呈現(xiàn)上升趨勢。S1、S2 與S3 的可溶性蛋白含量在-15 ℃脅迫下達到了峰值，S4 則是-10 ℃脅迫下達到峰值。在峰值時，SP 含量由高到低依次為S1>S2>S3>S4，與0 ℃ 低溫脅迫時相比，4 種植株增長最低為127%，最高為142%?？梢钥闯?，LT50更低的薔薇屬植物，其SP 指標的上升幅度更高。

2.3 低溫脅迫對薔薇屬植物可溶性糖含量的影響

低溫下4 種薔薇屬植物可溶性糖含量的變化如圖3 所示。

由圖3 可知，4 種薔薇屬植物葉片的SS 指標隨著脅迫溫度降低而逐漸升高。在0 ℃低溫脅迫時，各品種間的可溶性糖含量差異顯著（P<0.05），其中，S1 的SS 含量顯著高于其他薔薇屬植物。在-15 ℃脅迫下，4 種薔薇屬植物可溶性糖含量表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，與0 ℃低溫脅迫時相比，4 種薔薇屬植物最大增長47%，最小增長19%，可見，LT50更低的植株在低溫狀況下積累的SS 更多。

2.4 低溫脅迫對薔薇屬植物游離脯氨酸含量的影響

在低溫脅迫的影響下，4 種植株的Pro 含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢（圖4）。在-15 ℃時，Pro 含量均達到峰值，具體表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，和0 ℃低溫脅迫相比，4 種植株樣本最高增加了382%，最低增加了299%，可見不同的樣本在低溫脅迫下Pro含量有顯著差異（P<0.05）。

2.5 低溫脅迫對薔薇屬植物丙二醛含量的影響

低溫下4 種薔薇屬植物丙二醛含量的變化如圖5 所示。

由圖5 可知，4 種薔薇屬植物丙二醛含量表現(xiàn)出不斷上升的趨勢。低溫脅迫中，LT50 相對較低的植株MDA 含量更低。4 種薔薇屬植物在0 ℃低溫脅迫下的MDA 含量差異顯著（P<0.05）。并且隨著脅迫溫度的降低，MDA 含量也不斷增加，在-15 ℃ 脅迫下達到峰值；LT50 相對較高的植物在低溫脅迫下會有著更高的MDA 積累。在不同低溫脅迫下，MDA 含量均表現(xiàn)為S2

2.6 低溫脅迫對SOD 和POD 活性的影響

由圖6、7 可知，在低溫脅迫下，4 種植物SOD 與POD 活性的變化趨勢較為相似，表現(xiàn)為S1、S2 呈現(xiàn)持續(xù)上升，S3、S4 則是先上升后下降的變化趨勢，同時4 種植株的SOD 與POD 活性在接近LT50溫度會有顯著下降（P<0.05）。0 ℃低溫脅迫時，S1 的SOD與POD 活性顯著降低（P<0.05），并且4 種植物的差異顯著；在-5 ℃低溫脅迫下，仍表現(xiàn)為類似的變化趨勢，-10 ℃低溫脅迫下S2 與S3 的SOD 活性非常接近，相對于0 ℃ 下增幅分別為62% 與47%，而POD 活性相較于0 ℃時增幅分別為106% 與75%，S1、S2 的SOD、POD 活性在-15 ℃低溫脅迫下活性較高，S3、S4 的SOD 與POD 活性則出現(xiàn)了一定程度的下降，并且4 種植物的差異顯著（P<0.05）。

2.7 低溫脅迫對HSP90 基因表達差異的影響

從圖8 可以看出，低溫脅迫下HSP90 在4 種薔薇屬植物葉片中的具體表達會有持續(xù)提升的變化。0 ℃脅迫情況下，HSP90 基因的相對表達量在4 種植物間差距較?。辉?5 ℃ 脅迫下，4 種植物為更好地減少低溫負面影響，會開啟內(nèi)部的耐寒基因；接近-10 ℃脅迫下，4 種植物的實際表達會再度產(chǎn)生激活；而-15 ℃脅迫下，基因產(chǎn)生了深度的激活。相關(guān)低溫影響下，HSP90 的表達表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，可見4 種薔薇屬植物通過HSP90 的表達增強，進而更加有效地應(yīng)對低溫環(huán)境，而且該基因表達更高的植物會表現(xiàn)出越強的耐寒性。

3結(jié)論與討論

3.1 葉片低溫半致死溫度與抗寒性

低溫脅迫的影響下，植物會產(chǎn)生相關(guān)的生理生化變動，進一步更好地應(yīng)對外部的低溫環(huán)境[27-28]。LT50能夠較為精準地表現(xiàn)抗寒性能，該指標更低則意味著抗寒性更優(yōu)秀[29]。溫度低于LT50的情況下，植物細胞會產(chǎn)生較為迅速的結(jié)冰，生理代謝機制會產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，會有相關(guān)的凍害現(xiàn)象，使得植株遭遇的傷害也難以恢復[30]。因此，LT50 能夠充當作物遭遇無法逆轉(zhuǎn)損害的閾值。本研究表明，4 種薔薇屬植物LT50 在-18.87～ -10.52 ℃ ，從低至高的依次是S1

3.2 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與抗寒性

可溶性蛋白（SP）是植物必不可少的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，和植物耐寒性有著十分緊密的聯(lián)系[31]。有研究顯示，Hsp 家族熱激蛋白等的引導使得可溶性蛋白會出現(xiàn)一定的改變，在植物響應(yīng)低溫脅迫信號過程中具有極為關(guān)鍵的作用 [32]。而可溶性蛋白含量的提升可促使下游物質(zhì)合成進而為植物響應(yīng)低溫脅迫給予相應(yīng)的物質(zhì)以及能量，并有效地提升在低溫下的生存率[33]。在低溫環(huán)境下，糖類代謝往往是用于調(diào)控生物合成以及蛋白質(zhì)分解間的平衡，可溶性蛋白的水解要有非常多的蛋白水解酶如Clp蛋白酶和以及ATP 蛋白酶，從而讓多肽不可逆轉(zhuǎn)地去生成可溶性糖[34]。本研究表明，4 種薔薇屬植物可溶性蛋白含量在低溫脅迫中表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，抗寒性越強的材料在接收到外界環(huán)境的低溫信號下，對應(yīng)的蛋白質(zhì)增加幅度以及分解糖的效率會更高，這就意味著抗寒性越高的材料在接收到冷信號后可以迅速地提高細胞液濃度，并不斷把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成糖，經(jīng)過可溶性蛋白去帶動相應(yīng)的生理反應(yīng)，可溶性蛋白的轉(zhuǎn)移對其余物質(zhì)的合成有著十分關(guān)鍵的作用，使植物可以快速進行冷應(yīng)激反應(yīng)，并有效地適應(yīng)低溫環(huán)境，這和以往杜鵑[35]、鳶尾[36]、木蘭[25]等植物的研究結(jié)果是一致的。

植物在低溫環(huán)境中可以經(jīng)過降低游離Pro 含量，有效地提升自身抗寒性能[37]。在低溫脅迫之后，游離Pro 經(jīng)過對蛋白質(zhì)的水合作用， 能夠有效地確保其細胞空間結(jié)構(gòu)不會受到不利影響，從而完成對植物的有效保護[38]。XIN 等[39]對擬南芥的研究表明，高濃度脯氨酸是抗凍性提升的一個核心因素。在本研究中，4 種薔薇屬植物的Pro 含量伴隨溫度的下降表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，LT50 較低的S1和S2 其Pro 峰值位于-20 ℃左右，同時在低溫時期其游離脯氨酸含量要明顯的超過其余薔薇屬植株，這和李瑞雪等[25]所研究的低溫環(huán)境下植物生理行為變化的結(jié)論一致，LT50 產(chǎn)生時間越晚，植物所累積的Pro 就越多，耐寒性能就越高，但隨著低溫脅迫的不斷加大，酶系統(tǒng)遭到破壞，葉片Pro 合成速率下降或者其降解速率提高，進而會使得Pro 含量出現(xiàn)降低的變化。

植物在低溫情況下，經(jīng)過生成可溶性糖含量來提升細胞組織的滲透勢，從而讓結(jié)冰點降低，避免過度脫水，免受低溫影響[40]。本研究表明，伴隨溫度的不斷下降，4 種薔薇屬植物的SS 含量表現(xiàn)為不斷提高，這與在玉米、番茄[41]和甘蔗[42]上研究結(jié)論是相同的。LT50 最低的S1 對應(yīng)的SS 含量要明顯超過其余薔薇屬植物，抗寒性最高；第二為S2，而S4 的SS 最小，這意味著LT50 越低的品種低溫所生成的SS 越多，抗寒性能越高，這和李瑞雪等[25]在木蘭科植物上得到的研究結(jié)論相同。

3.3 葉片丙二醛和抗氧化酶活性與抗寒性

低溫脅迫能夠讓胞內(nèi)活性氧（ROS）迅速生成，從而誘導膜脂過氧化，并進一步導致丙二醛（MDA）不斷積累[43]。CAMPOS 等[44]研究表明，可將MDA 含量當做判斷植物受到低溫傷害程度的一個關(guān)鍵指標[45]。在本研究中，4 種薔薇屬植物葉片MDA 含量伴隨溫度的下降表現(xiàn)出持續(xù)提高的趨勢，可見植物膜質(zhì)過氧化程度逐漸加重，LT50 越低的植物對應(yīng)葉片MDA 含量提升的迅速越慢。LT50最低的S1 葉片在低溫階段MDA 一直保持在一個比較低的水平，這表明S1 在低溫脅迫下膜脂過氧化水平比較弱，也就是其抗寒性能較強。并且MDA增幅的程度和4 種植物抗寒性能具有負相關(guān)關(guān)系，這和鄧仁菊等[46]、WANG 等[47]和朱曉非等[22]得出的結(jié)論是相似的。SOD 以及POD 能夠有效去除氧自由基，從而維護植株的正常生理功能，并提高它們的抗寒能力[48]。此外，4 種薔薇屬植物整體表現(xiàn)出提升的變化趨勢，SOD 以及POD 活性的提升能夠有效地降低低溫環(huán)境對生物膜的損害，這意味著植株對低溫會出現(xiàn)相應(yīng)的響應(yīng)。不過MDA 含量的提升表明伴隨溫度的持續(xù)下降，葉片膜脂過氧化水平也越來越高。在-5～-10 ℃情況下，LT50 低的S1以及S2 葉片SOD、POD 活性較其余2 種薔薇屬植物更小，可能由于植株自身具有抵抗低溫的功能，并不需要憑借保護酶去提高對植株的保護。伴隨溫度的不斷下降，S1 以及S2 葉片中SOD、POD 活性被激活從而防御低溫傷害。這表明重度低溫脅迫會阻礙植株的抗氧化酶活性，進而讓細胞遭受損傷，在LT50 范圍內(nèi)SOD 以及POD 活性的提升能夠有效地防止低溫對細胞帶來的損害。

3.4 抗寒相關(guān)調(diào)節(jié)基因HSP90 與抗寒性

低溫是干擾植物生長發(fā)育的一個重要因素，植物具備不同的防御機制去抵御寒冷的傷害[47，49-50]。通過轉(zhuǎn)錄因子介導的信號傳導是最高效的防御應(yīng)答反應(yīng)之一，組成了植物復雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部分[51]。很多研究顯示，各種熱休克蛋白HSPs 轉(zhuǎn)錄因子在溫度感知以及信號處理中有著不可替代的關(guān)鍵作用，熱激轉(zhuǎn)錄因子HSP 在逆境脅迫下和熱激元件（HSE）識別并進行組合，進而帶動下游基因HSP 的轉(zhuǎn)錄以及表達[52]，對植物抵御逆境傷害以及其余生理行為有著重要意義。HSP90 為HSPs 的一部分，是類固醇受體的重要部分，可以促使目標蛋白的積累以及激酶的激活，整合質(zhì)體信號通路，調(diào)節(jié)CBF 和COR 表達[53]。有研究顯示，低溫環(huán)境可以有效地促使HSP90 基因表達，從而調(diào)整擬南芥幼苗的生長發(fā)育[47]。在低溫環(huán)境中，經(jīng)過促使HSP 基因過量表達去去除多余的活性氧，進而防止氧化脅迫帶來的影響[54]。本研究中，HSP90 基因相對表達量隨著低溫脅迫溫度的降低，整體表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，這種表達方式和SP、Pro、SOD、POD 在 4 種薔薇屬植株中的變化基本一致，意味著HSP90 會參加到目標蛋白的積累過程中。在0 ℃下，HSP90 基因在4 種植株間的表達量差異不太明顯，伴隨低溫脅迫的不斷加大，該基因在葉片中的表達也不斷提高。低溫時，耐寒種質(zhì)S1 以及S2 中HSP90 的表達量一直都位于最高。這意味著4 種薔薇屬植物抗寒性強度不同對低溫的應(yīng)答機制也就有所不同，耐寒性越高的植株為防范低溫帶來的損傷，會更加迅速地開啟低溫應(yīng)答機制，激活HSP90 進行表達，進一步讓下游和耐寒有關(guān)的基因完成表達，提高ROS 清除力度，降低氧化脅迫帶來的影響[55]，這種隨低溫脅迫時間不斷增加，轉(zhuǎn)錄因子表達越來越強的狀況在短枝木麻黃[26]和木蘭科植物[25]等研究中也有類似的結(jié)論。

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