李宇霞 王霞 張敏 邱悅 張袁菲 梁慧 梁麗琴 陳惠

摘要：荊條具有生態(tài)、觀賞、藥用及實用等方面的價值，但在荊條快速繁殖體系的建立中發(fā)現(xiàn)，種子在無菌萌發(fā)過程中污染率極高，達50%～75%。為降低荊條種子無菌萌發(fā)過程中的污染率，試驗通過鑒定其主要污染菌株，篩選出有效抑菌劑，并利用組織分離法對污染菌進行分離和純化；同時，通過光學顯微鏡和掃描電鏡對污染菌的分生孢子進行細胞學觀察，然后采用真菌rDNA 基因的ITS 序列通用引物進行分子生物學鑒定，最后選擇百菌清、代森錳鋅、多菌靈、氟嗎錳鋅4 種殺菌劑添加到PDA 培養(yǎng)基中進行抑菌效果分析。結(jié)果表明，主要污染菌為種子表面附著的真菌，菌落呈絨狀黃綠色同心圓形，菌絲為有隔褐色分支狀菌，分生孢子為橄欖棕色、有隔、梭型；細胞學和分子生物學鑒定表明，該污染菌為鏈格孢菌。抑菌研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60% 氟嗎錳鋅對鏈鉻孢菌的抑制效果最佳，菌落直徑最小。將60% 氟嗎錳鋅稀釋1 400 倍添加到荊條種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基（水瓊脂培養(yǎng)基）中，污染率明顯下降到5.5%。荊條種子無菌萌發(fā)中主要污染菌為鏈格孢菌，60% 氟嗎錳鋅對其抑制效果最佳。

關(guān)鍵詞：荊條種子；無菌萌發(fā)；污染真菌；鏈格孢菌；氟嗎錳鋅

中圖分類號：S793.7 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）03?0249?08

荊條（Vitex negundo L. var. heterophylla（Franch.）Rehd）為馬鞭草科牡荊亞科的落葉灌木或小喬木，是黃荊的一個變種。荊條在我國分布較廣，從北到南的13 個省份均有分布，如遼寧、甘肅、山西、安徽、貴州等；日本也有分布[1]。荊條常生長于山坡路旁，植株比較抗旱、耐寒，在惡劣的環(huán)境下也能生長。由于荊條的根能夠分泌出將堅固的巖石腐蝕分解成土壤的一種植物酸，因此，可作為水土保持的優(yōu)勢樹種，在山西可作為廢棄煤礦礦區(qū)植被恢復的優(yōu)選樹種，具有一定的生態(tài)價值。荊條還可以制作盆景，荊條的幼枝被用來編籃筐，枝葉用來驅(qū)蚊。

荊條花芳香味濃，是優(yōu)良的蜜源植物，荊條蜜含有益菌、活性酶、有機酸等，具有潤腸通便、促進胃腸蠕動助消化等功能。荊條是重要的中草藥，其根、莖、葉、果實均可入藥，鮮葉治療風寒感冒、急性胃腸炎等。其提取物在消炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、治療關(guān)節(jié)炎[4]、癌癥[5]以及婦科疾病[6]等方面有療效；還可用作抗氧化劑[7]、抗真菌劑[8]、驅(qū)蟲劑[9]，并具有抗病毒等作用[10]，基于荊條廣泛的生物學作用，研究人員對荊條的研究越來越廣泛和深入。

目前，荊條主要依靠播種和移苗繁殖。對于荊條種子的萌發(fā)研究，大都采用種子浸種萌發(fā)法[11-13]。

關(guān)于荊條的組織培養(yǎng)研究，國內(nèi)外尚屬空白。由于落葉灌木自然繁殖率低，眾多研究者關(guān)注于其種子萌發(fā)的研究，如郭麗等[14]研究了不同消毒程序?qū)σ吧∑つ痉N子萌發(fā)的影響。關(guān)于荊條種子的無菌萌發(fā)還未見報道。前期研究發(fā)現(xiàn)，荊條種子經(jīng)常規(guī)消毒后，極易受到一種黃綠色真菌的污染，且污染率很高，致使荊條組織培養(yǎng)嚴重受阻。要進行荊條的組織培養(yǎng)，第一步是無菌材料的建立，而荊條種子試管中無菌萌發(fā)是獲得無菌材料的有效途徑。

本研究首先比較了不同消毒程序的消毒效果，并對該污染真菌進行分離、純化與細胞學觀察及分子生物鑒定，以確定污染菌的種類，并將百菌清、代森錳鋅、多菌靈、氟嗎錳鋅等抑菌劑添加到PDA 平板上觀察它們對污染真菌的抑制效果，最后挑選最佳的抑菌劑加進荊條種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，觀察其抑菌效果，旨在為荊條快速繁殖體系的建立打下良好的基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 試驗材料

荊條種子于2017 年9、12 月采摘自山西省臨汾市堯都區(qū)野生荊條樹上。將種子在簸萁中反復揉搓，簸去宿存的花萼等雜物后，裝入塑料瓶，于4 ℃存儲。荊條種子千粒質(zhì)量為5.845 0 g，種子長徑與短徑分別為3.000、2.563 mm。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

真菌培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，無菌種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS（Murashige and skoog）培養(yǎng)基（無糖，瓊脂8 g/L，pH 值5.8）。

真菌菌絲DNA 提取試劑為CTAB 改良液[15]；供試藥劑為75% 百菌清可濕性粉劑（利民化工股份有限公司）、80% 多菌靈可濕性粉劑（江蘇速達農(nóng)化科技有限公司）、80% 代森錳鋅可濕性粉劑（北京中衛(wèi)生物科技有限公司）、60% 氟嗎錳鋅可濕性粉劑（德國拜客（西安）作物保護股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 荊條種子3 種消毒程序消毒效果的比較 將去皮去雜后的荊條種子分別用3 種程序進行消毒處理。

70% 乙醇消毒5 min→0.1% 升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）消毒10 min→ 無菌水沖洗3～5 次；0.25%（m/V）洗衣粉（奇強牌無磷洗衣粉）水浸泡5 min→自來水沖洗7 min →70% 乙醇消毒5 min→0.1% 升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）消毒10 min→無菌水沖洗3～5 次；0.25%（m/V）洗衣粉水浸泡5 min→自來水沖洗7 min→70% 乙醇消毒5 min→10% 的次氯酸鈉分別消毒10、20、30 min→無菌水沖洗3～5 次。

1.3.2 荊條種子附著菌的分離培養(yǎng)與光學顯微鏡觀察 將消毒處理后的荊條種子接種于含MS 培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中培養(yǎng)，每瓶接種15 粒，3 個重復，培養(yǎng)條件：25 ℃，光周期12 h/12 h（光照/黑暗）。7～10 d 后培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃綠色的菌落，用接種針挑取邊緣菌絲于PDA 培養(yǎng)基中，進行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。7 d 時觀察菌落、菌絲及孢子的形態(tài)、大小、顏色，并攝片（光學顯微鏡OLYMPUSB5X1型）。

1.3.3 荊條種子附著菌的分子生物學鑒定與進化發(fā)育樹的構(gòu)建1.3.3.1 菌絲DNA 的提取 在超凈工作臺中，用無菌接種針刮取約300 mg 菌絲，置于1.5 mL 無菌EP 管中，將EP 管放置在冰上，菌絲材料用塑料研磨杵快速搗碎至勻漿。采取改良的CTAB 法提取真菌基因組DNA[15]。

1.3.3.2 PCR 擴增 采用真菌rDNA 基因ITS（InternalTranscribed Spacer）序列的通用引物ITS1（5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）? 和ITS2（5?-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3?）（北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成）進行PCR 擴增。

PCR 反應體系（25 μL）：Taq DNA polymerase0.5 μL（合肥博美生物科技有限公司）；10×PCRbuffer 2.5 μL；dNTP mix（2.5 mmol/L） 2.0 μL（天根生物科技有限公司）；ITS1（10 μmol/L）與ITS2（10 μmol/L）各1 μL；DNA 模板1～10 ng，補充ddH2O 至25 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，54 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，30 次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.3.3 測序及序列比對與分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將有目標條帶的PCR 產(chǎn)物純化，送北京天一輝遠生物科技有限公司測序。測序后的序列經(jīng)過人工校正后在NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST 比對，尋找與其同源序列相似度達99% 的已知真菌的相關(guān)序列12 條，以鑒定污染真菌的分類地位。利用MEGA 7.0 軟件進行多序列比對，然后采用最大簡約法（Maximumparsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自檢法（bootstrap）進行檢測，共循環(huán)2 000 次，對污染荊條種子無菌萌發(fā)的真菌進行鑒定。

1.3.4 種子表面附著菌的洗脫液與干種子掃描電鏡的觀察 將荊條種子約150 粒放入20 mL 蒸餾水中，加入1 滴吐溫-20，攪拌后，取1 滴溶液滴在干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。同時，將干種子噴金后在掃描電鏡（JSM-7500F 型日本電子株式會社（JEOL））下觀察。

1.3.5 抑菌劑對鏈鉻孢菌抑制效應的比較 將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200 g 馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用2 層紗布過濾，加熱，加15 g 瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20 g 蔗糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌20 min。將抑菌劑加入培養(yǎng)基中使其最終稀釋倍數(shù)分別為：80% 代森錳鋅700、800、900 倍；75%百菌清600、700、800 倍；80% 多菌靈800、1 200、1 600 倍；60% 氟嗎錳鋅1 200、1 400、1 600 倍，然后倒平板，待其冷卻后挑取單一菌落邊緣菌絲少許接菌，25～28 ℃培養(yǎng)7 d 后觀察，利用十字交叉法測定菌落直徑大小，求出各抑菌劑同一濃度下的菌落直徑的平均值，并將抑菌劑處理的平均菌落直徑和空白對照組對比，計算4 種抑菌劑的系列濃度對菌絲體的生長抑制率即抑菌率。

抑菌率=（（對照菌落直徑-原菌絲塊直徑）-（處理菌落直徑- 原菌絲塊直徑））/（對照菌落直徑-原菌絲塊直徑）×100% （1）

1.3.6 培養(yǎng)基中添加抑菌劑對荊條種子污染率的影響 采用第3 種消毒程序消毒后將種子接種于含稀釋1 400 倍和1 600 倍的氟嗎錳鋅于1/2 MS 無糖培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基上，置于（25±2）℃溫室，光周期為12 h/12 h（光照/黑暗），相對濕度為60%的條件下培養(yǎng)，每瓶接種4 粒，5 個重復，7～8 d 后觀察生長情況，計算污染率和種子萌發(fā)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013 和SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計與分析。

2結(jié)果與分析

2.1 荊條種子最佳消毒方法的選擇

為了確保荊條種子的無菌培養(yǎng)，采用3 種消毒程序?qū)ηG條種子（圖1-A）進行消毒處理，并接種到MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示（表1），10% 次氯酸鈉消毒劑處理程序3 隨著消毒時間的延長（10～30 min），污染率由75.00% 下降到了58.69%，但不如相應地0.1% 升汞處理程序2；在0.1% 升汞消毒之前增加洗衣粉漂洗程序，可以顯著降低污染率，洗衣粉漂洗后水呈現(xiàn)黃綠色（圖2），說明種子表面的真菌孢子被洗脫了下來?？傊?，第2 種消毒程序最佳。

采用第1 種消毒程序?qū)ηG條種子消毒處理后，將種子接種培養(yǎng)7 d 后，發(fā)現(xiàn)錐形瓶內(nèi)長出多個黃綠色菌落，菌落之間重疊嚴重，但采用第2 種消毒程序后，菌落數(shù)明顯減少，一個錐形瓶只長出2～3 個污染菌的菌落，且該菌落也呈黃綠色，質(zhì)地均勻絨狀（圖1-B）。

2.2 荊條種子無菌萌發(fā)過程中污染真菌的進一步分離純化培養(yǎng)與細胞學觀察

荊條種子表面真菌菌落、菌絲及分生孢子如圖3 所示。

挑取2.1 中圖1-B 荊條種子表面長出的黃綠色真菌菌落邊緣的菌絲，經(jīng)PDA 平板純化培養(yǎng)，10 d后菌落直徑長到6.3 cm×6.1 cm，菌落正面的顏色仍為黃綠色（圖3-A），反面為黑灰色（圖3-B）。菌落邊緣平整，質(zhì)地絨狀。該菌的菌絲在光學顯微鏡下觀察為有隔菌絲，褐色，菌絲直徑為7～8 μm（圖3-C），分生孢子呈橄欖棕色，有隔梭型，大小為35～40 μm×15～20 μm（圖3-D）。

2.3 荊條種子附著菌的分子生物學鑒定

2.3.1 荊條種子附著菌DNA 的PCR 擴增 利用通用引物ITS1 和ITS2 序列擴增污染真菌rDNAITS 序列，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像結(jié)果顯示，菌株ITS 序列的PCR 產(chǎn)物長約650 bp，條帶清晰（圖4）。

2.3.2 菌株ITS 的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將2.3.1 中PCR 產(chǎn)物送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序，序列利用DNAMAN 軟件進行人工校正比對后，遞交NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/），登錄號為MK229186，經(jīng)BLAST 序列比對，選取相似度為99% 的序列12 條，并以同科即孢腔菌科（Pleosporaceae）不同屬的枯葉格孢腔菌（Pleospora herbarum）作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明（圖5），本試驗菌MK229186 與Alternaria alternata 最鄰近，從而確定荊條種子無菌萌發(fā)過程中污染的真菌為半知菌綱鏈格孢屬的鏈格孢菌（Alternaria alternata）。

2.4 荊條種子洗脫液及干種子掃描電鏡觀察

在光學顯微鏡下，觀察荊條種子吐溫-20 洗脫液，發(fā)現(xiàn)每滴洗脫液中有若干個手雷狀的分生孢子，其形態(tài)與分離純化的污染菌的分生孢子（圖3-D）一致。掃描電鏡下觀察到干種子表面有梭形的分生孢子和分支狀的菌絲（圖6），再此證明鏈格孢菌確實是荊條種子表面的附著菌。

2.5 4 種抑菌劑對鏈鉻孢菌的毒力測定結(jié)果

應用Excel 軟件，將抑菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成以10 為底的對數(shù)x，查抑菌率與概率值換算表，將抑菌率轉(zhuǎn)換為抑菌概率值y。根據(jù)抑菌劑質(zhì)量濃度x和抑菌概率值y，應用SPSS 軟件，分析得出4 種抑菌劑的毒力回歸方程y＝ax+b，以及相關(guān)系數(shù)和抑菌劑有效抑制中濃度（EC50）[16]，結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，4 種抑菌劑對荊條種子宿生菌鏈格孢菌的生長都具有一定的抑制作用，但抑菌效果有較明顯的差異，藥效各不相同。4 種抑菌劑的毒力效果具有明顯差異，由強到弱排序依次為60%氟嗎錳鋅>80% 多菌靈>80% 代森錳鋅>75% 百菌清，因此，初步篩選60% 氟嗎錳鋅為有效防控荊條種子宿生菌鏈格孢菌污染的最佳藥劑。

2.6 培養(yǎng)基中添加抑菌劑對荊條種子污染率及萌發(fā)率的影響

為了進一步降低荊條種子萌發(fā)過程中的污染率和提高萌發(fā)率，試驗將水引發(fā)2 d 回干1 d 的荊條種子經(jīng)最佳消毒程序消毒后分別接種于含有稀釋1 600 倍和1 400 倍氟嗎錳鋅的1/2 MS 無糖培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基中，溫度為（25±2）℃ ，光周期12 h/12 h 下培養(yǎng)，7 d 后統(tǒng)計污染率以及萌發(fā)率，結(jié)果如圖7 所示。由圖7 和表3 可知，對照組污染嚴重，培養(yǎng)基上種子周圍有發(fā)黑的菌落，水瓊脂培養(yǎng)基菌落顏色比1/2 MS 無糖培養(yǎng)基上的淺，污染率也低，添加氟嗎錳鋅的2 種培養(yǎng)基不僅表現(xiàn)為污染率顯著降低，而且觀察到種子萌發(fā)。表明添加氟嗎錳鋅不僅可以顯著降低污染率，而且顯著促進種子萌發(fā)，其中，添加60% 氟嗎錳鋅可濕性粉劑稀釋1 400 倍在水瓊脂培養(yǎng)基上的種子污染率能降低到5.5%。

3結(jié)論與討論

3.1 洗衣粉水浸泡對荊條種子無菌萌發(fā)的影響

為了在試管中進行荊條種子的無菌萌發(fā)獲得無菌苗，本研究采用了3 種外植體消毒程序，結(jié)果表明，第2 種消毒程序效果最佳，關(guān)鍵步驟是荊條種子消毒前先用0.25% 洗衣粉水浸泡5 min，然后流水沖洗7 min，接著用70% 乙醇浸泡5 min，0.1%升汞（吐溫-20，4～5 滴/L）浸泡10 min，無菌水沖洗3～5 次進行消毒。結(jié)果表明，真菌污染率由75.57%下降到了47.14%。其原因可能是由于增加了0.25%洗衣粉水浸泡時間和流水沖洗的時間，洗衣粉中的去污劑有效成分SDS，能將包裹在荊條種子表面的霉菌孢子清除一大部分，有效降低培養(yǎng)過程中的真菌污染率。延長洗衣粉水處理時間可能效果會更佳，還有待進一步改進。此外，在試驗中還發(fā)現(xiàn)，污染率與取材的時間和地點也有一定關(guān)系，如12 月取材比9 月采集的污染率高，這可能是荊條種子在樹上多掛2～3 個月，期間雨淋次數(shù)增加，導致真菌孢子載量增加。此外，從山坳處生長的荊條樹上采集的種子比開闊地帶生長的荊條樹上采集的種子污染率高，可能是由于山坳處的潮濕環(huán)境有利于霉菌的繁殖使荊條種子表面載有的真菌孢子量大的緣故。

3.2 鏈格孢菌對荊條種子無菌萌發(fā)及其他植物的影響

為了探明引起荊條種子無菌萌發(fā)污染的真菌種類，本研究挑取了荊條種子周圍的黃綠色真菌菌絲對其進行了分離純化培養(yǎng)，并提取其菌絲DNA，采用真菌rDNA 序列及ITS 序列的特異引物ITS1與ITS2，對其進行了PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)公司測序后，在NCBI 網(wǎng)站經(jīng)同源序列比對并構(gòu)建了該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)分子生物學鑒定和光學顯微鏡下的細胞形態(tài)學觀察，確定了荊條種子表面附著菌為鏈格孢菌。同時，本研究將荊條種子用吐溫-20 洗脫液置于光學顯微鏡下觀察，以及掃描電鏡下對干種子表面進行觀察，結(jié)果表明，引起荊條種子無菌萌發(fā)極難去除的污染菌為鏈格孢菌。

鏈格孢菌通常是植物常見的致病菌，可引起多種農(nóng)作物產(chǎn)生輪斑病、黑斑病、褐斑病等[17-20]。在組織培養(yǎng)過程中常見的污染菌分為2 類，一類為細菌，主要為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬；另一類為真菌，有芽枝霉（Cladosporium spp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillum spp）和酵母等[21]。荊條種子無菌萌發(fā)中發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌在其他物種組培污染菌中還鮮有報道。

3.3 60% 氟嗎錳鋅對鏈格孢菌的抑制作用

為了進一步控制荊條種子無菌萌發(fā)過程中的污染，本研究進行了平板抑菌試驗，結(jié)果表明，60%氟嗎錳鋅、75% 百菌清、80% 多菌靈、80% 代森錳鋅分別稀釋不同的倍數(shù)，對鏈格孢菌菌絲均有抑制效果，最高抑菌率分別為100%、82.88%、82.19%和47.95%。4 種抑菌劑中75% 百菌清抑菌效果最差，抑菌率在41.10%～47.95%；高樹廣等[22]測定了5 種殺菌劑對芝麻鏈格孢菌的抑制效果，張曉翔等[23]測定了8 種殺菌劑對牡丹花鏈格孢菌的毒力，結(jié)果均表明，百菌清對鏈格孢菌的抑制效果最差，與本研究所得結(jié)果相一致。75% 多菌靈較好，抑菌率在58.90%～82.88%，80% 代森錳鋅抑菌率在60.96%～82.19%，抑菌效果較好。且75% 多菌靈和80% 代森錳鋅的EC50大于80% 多菌靈的致死中濃度EC50，毒力較強，但藺經(jīng)等[24]、王春明等[25]的研究結(jié)果表明，鏈格孢菌對多菌靈的敏感性更低，與本研究結(jié)果相反，推測可能是因為鏈格孢菌的生理小種之間寄主不同，藥劑的生產(chǎn)公司不同，測定結(jié)果出現(xiàn)差異。氟嗎錳鋅可濕性粉劑是氟嗎啉與代森錳鋅的復合制劑。已有研究表明，氟嗎錳鋅對葡萄、馬鈴薯和番茄上的卵菌綱，尤其是霜霉科和疫霉屬菌有殺菌效力。水瓊脂培養(yǎng)基上的荊條種子周圍污染菌落顏色比1/2 MS 培養(yǎng)基上的菌落顏色淺，可能是1/2 MS 培養(yǎng)基中的無機營養(yǎng)有利于真菌的菌絲生長。本研究結(jié)果表明，60% 氟嗎錳鋅稀釋1 400～1 600 倍對鏈鉻孢菌的抑菌率為100%，且有利于荊條種子的試管萌發(fā)獲得無菌苗。

綜上所述，在分離、純化荊條種子污染菌的基礎(chǔ)上，經(jīng)細胞學、分子生物學鑒定污染菌為鏈格孢屬的一種真菌，通過抑菌試驗篩選出最佳抑菌劑為培養(yǎng)基中添加60% 氟嗎錳鋅稀釋倍數(shù)為1 400～1 600 倍，可有效降低荊條種子的污染率，并獲得無菌試管苗，為荊條的無性快速繁殖體系的建立打下良好基礎(chǔ)。

參考文獻：

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志：第四十二

卷，第一分冊[M]. 北京：科學出版社，1993：145-146.

Editorial Committee of Chinese Flora，Chinese Academy of Sciences.

Flora of China[M]. Beijing：Science Press，1993：145-146.

［2］ XU J M，HU B C，YUAN L，et al. Labdanes and megastigmanes

from Vitex negundo var. heterophylla[J]. Fitoterapia，

2019，137：104265.

［3］ DHARMASIRI M G，JAYAKODY J C，GALHENA G，et al.

Anti-inflammatory and analgesic activities of mature fresh leaves

of Vitex negundo[J]. Journal of Ethnopharmacology，2003，87

（2/3）：199-206.

［4］ JING R，BAN Y，XU W，et al. Therapeutic effects of the total

lignans from Vitex negundo seeds on collagen-induced arthritis

in rats[J]. Phytomedicine，2019，58：152825.

［5］ AWALE S，LINN T Z，LI F，et al. Identification of chrysoplenetin

from Vitex negundo as a potential cytotoxic agent against

PANC-1 and a panel of 39 human cancer cell lines（JFCR-39）

[J]. Phytotherapy Research，2011，25（12）：1770-1775.

［6］ VISHWANATHAN A S，BASAVARAJU R. A review on Vi?

tex negundo L.：a medicinally important plant[J]. Environmental

Science，2010，3（1）：30-42.

［7］ KULKARNI R R，VIRKAR A D，D?MELLO P. Antioxidant

and antiinflammatory activity of Vitex negundo[J]. Indian Journal

of Pharmaceutical Sciences，2008，70（6）：838-840.

［8］ SATHIAMOORTHY B，GUPTA P，KUMAR M，et al. New

antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo[J]. Bioorganic

& Medicinal Chemistry Letters，2007，17（1）：239-242.

［9］ KARUNAMOORTHI K，RAMANUJAM S，RATHINASAM

Y R. Evaluation of leaf extracts of Vitex negundo L.（Family：

Verbenaceae） against larvae of Culex tritaeniorhynchus and repellent

activity on adult vector mosquitoes[J]. Parasitology Research，

2008，103（3）：545-550.

［10］ SUNDARAM R，NARESH R，SHANTHI P，et al. Antihyperglycemic

effect of iridoid glucoside，isolated from the leaves

of Vitex negundo in streptozotocin-induced diabetic rats with

special reference to glycoprotein components[J]. Phytomedicine，

2012，19（3/4）：211-216.

［11］ 邱悅，李依蓉，張敏，等. 野生荊條種子休眠原因及兩個采摘

時期萌發(fā)條件的探究[J]. 植物學研究，2019（5）：416-423.

QIU Y，LI Y R，ZHANG M，et al. Study on the reasons of dormancy

of wild Vitex negundo var. heterophylla seeds and the

germination conditions of two picking periods[J]. Botanical Research，

2019（5）：416-423.

［12］ 李義強，宋桂龍，郭宇. 水浸與赤霉素處理對荊條種子萌發(fā)影

響研究[J]. 種子，2012，31（3）：10-13.

LI Y Q，SONG G L，GUO Y. Study on effect of water immersion

and gibberellin treatments on seed germination of Vitex ne?

gundo var. heterophylla[J]. Seed，2012，31（3）：10-13.

［13］ 張寧，張壯，張瑋康，等. 濃硫酸浸種對荊條種子發(fā)芽率的影

響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（12）：143-146.

ZHANG N，ZHANG Z，ZHANG W K，et al. Effects of soaking

seeds with concentrated sulfuric acid on seed germination

rate of vitex[J]. Modern Agricultural Science and Technology，

2018（12）：143-146.

［14］ 郭麗，索素敏，徐明輝. 組織培養(yǎng)中不同消毒處理對野生薄皮

木種子萌發(fā)的影響[J]. 分子植物育種，2022，20（4）：1325-1330.

GUO L，SUO S M，XU M H. Effects of different disinfection

treatments on seed germination of wild Leptodermis oblonga

bge. in tissue culture[J]. Molecular Plant Breeding，2022，20

（4）：1325-1330.

［15］ 李煥宇，付婷婷，張云，等. 5 種方法提取真菌基因組DNA 作

為PCR 模板效果的比較[J]. 中國農(nóng)學通報，2017，33（16）：

28-35.

LI H Y，F(xiàn)U T T，ZHANG Y，et al. Effect comparison of five

methods to extract fungal genomic DNA as PCR templates[J].

Chinese Agricultural Science Bulletin，2017，33（16）：28-35.

［16］ 馮連榮，彭儒勝，周宏民，等. 楊樹上一株鏈格孢菌的分離、鑒

定及室內(nèi)防治藥劑篩選[J]. 西部林業(yè)科學，2018，47（6）：

106-111.

FENG L R，PENG R S，ZHOU H M，et al. Isolation and identification

of a strain of Alternaria alternata on Populus Russki

and screening of fungicides[J]. Journal of West China Forestry

Science，2018，47（6）：106-111.

［17］ DENG J X，LI M J，PAUL N C，et al. Alternaria brassicifolii

sp. nov. isolated from Brassica rapa subsp. pekinensis in Korea

[J]. Mycobiology，2018，46（2）：172-176.

［18］ DENG J X，CHO H S，PAUL N C，et al. A novel Alternaria

species isolated from Peucedanum japonicum in Korea[J]. Mycobiology，

2014，42（1）：12-16.

［19］ 常纓，王義權(quán)，強勝. 鏈格孢菌菌株致病性及其遺傳差異性

[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2005，11（4）：486-489.

CHANG Y，WANG Y Q，QIANG S. Pathogenicity and genetic

diversity of Alternaria alternata strains[J]. Chinese Journal of

Applied and Environmental Biology，2005，11（4）：486-489.

［20］ 崔迪，王繼華，陳捷，等. 鏈格孢屬真菌對農(nóng)作物的危害[J]. 哈

爾濱師范大學自然科學學報，2005，21（4）：87-91.

CUI D，WANG J H，CHEN J，et al. The danger of alternaria

to the crops[J]. Natural Science Journal of Harbin Normal University，

2005，21（4）：87-91.

［21］ 方麗，王連平，茹水江，等. 植物組培過程中污染微生物種類

及其季節(jié)性的變化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2013，25（2）：284-287.

FANG L，WANG L P，RU S J，et al. Varieties and seasonal

characters of pollution microflora in plant tissue culture[J].

Acta Agriculturae Zhejiangensis，2013，25（2）：284-287.

［22］ 高樹廣，徐博涵，李偉峰，等. 殺菌劑對芝麻鏈格孢的毒力測

定[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2016（6）：162-164.

GAO S G，XU B H，LI W F，et al. Toxicity determination of

fungicides to Alternaria sesame[J]. Bulletin of Agricultural Science

and Technology，2016（6）：162-164.

［23］ 張曉翔，劉微，范文忠. 不同藥劑對牡丹花鏈格孢菌葉斑病病

菌的室內(nèi)毒力[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（12）：5286，5301.

ZHANG X X，LIU W，F(xiàn)AN W Z. Laboratory toxicity of different

fungicides against Paeonia suffruticosa Alternaria leaf spot

[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2013，41（12）：

5286，5301.

［24］ 藺經(jīng)，楊青松，李曉剛，等. 嘧霉胺對梨黑斑病菌（Alternaria

alternata）的毒力及其藥效評價[J]. 植物保護，2009，35（4）：

162-163，167.

LIN J，YANG Q S，LI X G，et al. Evaluation of the fungitoxicity

of pyrimethanil against Alternaria alternata on pears[J].

Plant Protection，2009，35（4）：162-163，167.

［25］ 王春明，韓青梅，黃麗麗，等. 3 種殺菌劑對小麥黑胚病菌的毒

力測定及病害防治作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科

學版），2006，34（7）：55-60.

WANG C M，HAN Q M，HUANG L L，et al. Control of 3

fungicides against wheat black point in vitro and in vivo[J].

Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and

Forestry（Natural Science Edition），2006，34（7）：55-60.