王丹 任偉 岑鳳

【摘要】? 目的? ? 探討NLRP3、PD-L1、FoxP3和HPV在宮頸病變免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中的表達(dá)特征。方法? ? 選取2019年11月—2021年10月德安縣中醫(yī)院145例患者作為研究對(duì)象，分為宮頸癌組76例，CIN（宮頸上皮內(nèi)瘤變）組39例，子宮肌瘤手術(shù)后證實(shí)無(wú)宮頸病變組30例，分別取3組患者的宮頸癌組織、CIN組織、子宮肌瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果? ? NLRP3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)水平隨宮頸病變程度的加重而降低；PD-L1為棕黃色顆粒，表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞；FoxP3為黑色顆粒，位于細(xì)胞核，表達(dá)于宮頸癌間質(zhì)中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞無(wú)表達(dá)；NLRP3、PD-L1FoxP3、HPV在宮頸癌組織中表達(dá)與子宮肌瘤組、CIN組有顯著差異（P<0.05）。結(jié)論? ? NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中隨病變加重出現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)癌癥發(fā)生、發(fā)展有一定作用，可將其作為治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】? 宮頸病變；免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)；NLRP3；PD-L1；FoxP3；HPV

Expression characteristics of NLRP3，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and HPV in immune microenvironment regulation of cervical lesions

Wang Dan，Ren Wei，Cen Feng.The Traditional Chinese Medicine Hospital of Dean County，Dean，Jiangxi? 330400

【Abstract】? Objective? ? To investigate the expression characteristics of NLRP3，PD-L1，F(xiàn)oxp3 and HPV in the immune microenvironment regulation of cervical lesions.Methods? ? 145 patients in our hospital from November 2019 to October 2021 were selected as the research objects. They were divided into 76 cases of cervical cancer group， 39 cases of CIN （cervical intraepithelial neoplasia） group and 30 cases of no cervical lesions confirmed after hysteromyoma surgery. The cervical cancer tissues， CIN tissues and hysteromyoma tissues of the three groups were detected by immunohistochemistry.Results? ? NLRP3 was expressed in the cytoplasm， and its expression level decreased with the aggravation of cervical lesions； PD-L1 is a brownish yellow granule， which is expressed in cervical cancer cells and tumor infiltrating lymphocytes； Foxp3 is a black granule， located in the nucleus and expressed in tumor infiltrating lymphocytes in the stroma of cervical cancer， but not in cervical cancer cells； The expressions of NLRP3， pd-l1foxp3 and HPV in cervical cancer were significantly different from those in hysteromyoma group and CIN group （P<0.05）.Conclusion? ? NLRP3， PD-L1， Foxp3 and HPV are highly expressed in the regulation of immune microenvironment of cervical lesions with the aggravation of lesions， which plays a certain role in the occurrence and development of cancer and can be used as therapeutic targets.

【Key Words】? Cervical lesions；Immune microenvironment；NLRP3；PD-L1；FoxP3；HPV

中圖分類號(hào)：R711.74? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1672-1721（2023）14-0020-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.14.007

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤疾病，且隨著生活水平的提高，其發(fā)病越來(lái)越年輕化，嚴(yán)重影響患者身心健康及生活質(zhì)量[1]。人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，其感染多發(fā)生在性生活活躍女性，<50歲女性中多有HPV感染史，大多2年內(nèi)會(huì)清除，少部分持續(xù)感染，侵犯于未分化宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞及分化出逃避免疫應(yīng)答清除分子[2]。臨床上對(duì)HPV感染無(wú)特效藥，多是針對(duì)宮頸疾病病變進(jìn)行治療。有相關(guān)研究指出，宮頸腫瘤的發(fā)生、病變及轉(zhuǎn)移與宮頸內(nèi)的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境因素關(guān)系密切[3]。所以，開展對(duì)HPV感染的宮頸病變免疫逃逸因子研究，以及早發(fā)現(xiàn)宮頸病變，對(duì)阻斷宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展意義重大。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中的表達(dá)特征，旨在分析其與宮頸病變的關(guān)系，報(bào)道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選取德安縣中醫(yī)院2019年11月—2021年10月婦科收治的145例患者為研究對(duì)象，其中宮頸癌76例，CIN 39例，子宮肌瘤手術(shù)后證實(shí)無(wú)宮頸病變30例，本研究項(xiàng)目已經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)初診及手術(shù)治療、宮頸活檢病理診斷確診；無(wú)化療史；臨床資料完整；均自愿參加此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心肝腎嚴(yán)重疾病者；急性炎癥者；自身免疫系統(tǒng)疾病及造血系統(tǒng)疾病者；伴有動(dòng)脈粥樣硬化及其他腫瘤者；精神障礙者。宮頸癌組：年齡31～62歲，平均年齡（47.2±4.8）歲；根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期21例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例；組織分化程度：低分化26例，中分化31例，高分化19例。CIN組：年齡30～62歲，平均年齡（48.5±4.2）歲；CIN分級(jí)：Ⅰ級(jí)9例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ15級(jí)。子宮肌瘤組：年齡31～63歲，平均年齡（47.8±4.7）歲。3組一般資料無(wú)明顯差異（P>0.05）。

1.2? ? 方法? ? 取3組患者的組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，包括NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV。進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5 μm，脫蠟處理，經(jīng)微波抗原，進(jìn)行SP免疫組織化學(xué)，操作方法按照試劑的相關(guān)說(shuō)明書進(jìn)行?？贵w于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，標(biāo)記二抗工作液室溫孵育30 min，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染3～5 min，梯度酒精脫水，熒光倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。染色均設(shè)置陽(yáng)性陰性對(duì)照，將已證實(shí)的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性參照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? 對(duì)細(xì)胞膜上、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性染色細(xì)胞的個(gè)數(shù)進(jìn)行陽(yáng)性判讀，檢測(cè)NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV的表達(dá)情況。擇取切片細(xì)胞數(shù)量最多的5個(gè)高倍視野，每視野取數(shù)細(xì)胞100個(gè)，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富讀片醫(yī)師進(jìn)行觀察，綜合分析染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占比。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：沒有著色0分，淡黃/淡黑1分，棕黃/棕黑2分，棕褐色/黑色3分；陽(yáng)性細(xì)胞占比標(biāo)準(zhǔn)：0%～24%計(jì)0分，25%～49%計(jì)1分，50%及以上計(jì)2分。陽(yáng)性判定：染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分，0～1分為陰性，陽(yáng)性為2～6分。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

NLRP3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)水平隨宮頸病變程度的加重而降低；PD-L1為棕黃色顆粒，表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞；FoxP3為黑色顆粒，位于細(xì)胞核，表達(dá)于宮頸癌間質(zhì)中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞無(wú)表達(dá)；NLRP3、PD-L1FoxP3、HPV在宮頸癌組織中表達(dá)與子宮肌瘤組、CIN組有顯著差異（P<0.05），見表1。

3? ? 討論

宮頸病變是高發(fā)女性疾病，其早期臨床表現(xiàn)不明顯，易被忽視，進(jìn)展到一定程度后形成癌癥，嚴(yán)重影響女性身心健康及生命安全。所以，對(duì)宮頸病變的檢查防治非常重要。臨床相關(guān)研究顯示，生殖道HPV感染非常普遍，感染率達(dá)30%～40%；也有研究顯示，宮頸癌患者中約有90%的感染HPV，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的啟動(dòng)因子，臨床普遍認(rèn)為HPV持續(xù)感染和宮頸局部免疫微環(huán)境改變的疊加作用促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生[4]。不同類型的HPV感染和宮頸癌病變及病情有較大的關(guān)系，有研究指出，高危HPV大多在2年內(nèi)會(huì)被自然清除，少數(shù)會(huì)進(jìn)展為宮頸癌，認(rèn)為HPV持續(xù)感染引發(fā)宮頸癌與HPV抑制機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)[5]。當(dāng)細(xì)胞因子、促炎因子、免疫細(xì)胞形成的腫瘤免疫微環(huán)境的免疫抑制作用高于免疫應(yīng)答時(shí)，病毒就會(huì)無(wú)法清除，進(jìn)而持續(xù)存在而誘發(fā)宮頸局部的免疫微環(huán)境出現(xiàn)失衡。所以，加強(qiáng)腫瘤微環(huán)境對(duì)話網(wǎng)絡(luò)中決定性環(huán)節(jié)的研究，能為免疫治療阻斷宮頸癌的發(fā)生發(fā)展提供有效依據(jù)。

HPV感染后出現(xiàn)的疾病轉(zhuǎn)歸和機(jī)體免疫功能有關(guān)，尤其是和宮頸局部微環(huán)境免疫功能密切相關(guān)。免疫抑制細(xì)胞構(gòu)成免疫抑制微環(huán)境，經(jīng)免疫耐受和免疫逃逸機(jī)制促進(jìn)宮頸病變的發(fā)展。盡管在宮頸癌階段腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)，但機(jī)體內(nèi)部仍會(huì)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，因腫瘤免疫抑制微環(huán)境控制無(wú)法發(fā)揮生物效用，所以免疫抑制微環(huán)境非常重要。宮頸微環(huán)境免疫監(jiān)視功能及免疫逃逸對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。免疫系統(tǒng)中，免疫監(jiān)視是重要功能，能起到識(shí)別和抑制異常細(xì)胞的作用，宮頸微環(huán)境中的腫瘤抑制性免疫細(xì)胞因子能減弱機(jī)體免疫功能，降低清除受損DNA、異常細(xì)胞能力，使受損DNA持續(xù)復(fù)制、異常細(xì)胞增殖，引起癌癥發(fā)生及發(fā)展[6]。NLRP3是模式識(shí)別受體一員，對(duì)機(jī)體先天免疫應(yīng)答有重要作用，能識(shí)別病原分子模式、危險(xiǎn)分子模式，促進(jìn)產(chǎn)生分泌炎性介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)應(yīng)答，NLRP3還能調(diào)節(jié)caspase-1依賴的細(xì)胞凋亡，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。有研究顯示，婦科疾病、宮內(nèi)膜癌均與NLRP3均有密切關(guān)系[7]。程序性死亡配體-1（PD-L1）又稱為B7-H1，是PD-1受體中的一員，屬于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4受體，是免疫反應(yīng)中的協(xié)同分子，起到腫瘤微環(huán)境免疫耐受主導(dǎo)性作用；分為膜型和可溶型兩種，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞核非造血細(xì)胞及浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中，如活化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及活化的髓系細(xì)胞（單核細(xì)胞、NK細(xì)胞）。有多個(gè)臨床研究顯示，PD-L1在肺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌中均有組成性表達(dá)，是腫瘤組織表達(dá)預(yù)后不良的因素[8]。在肺癌、食管癌、卵巢癌中表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜中，在宮頸癌中則表達(dá)于細(xì)胞胞漿中。吳雪燕等研究顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌的組織中，PD-L1有升高現(xiàn)象[9]。提示PD-L1在惡性腫瘤中異常高表達(dá)，與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的PD-1一起抑制周圍淋巴細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞避開了免疫系統(tǒng)監(jiān)視及攻擊。本文研究結(jié)果顯示，宮頸癌組的PD-L1表達(dá)均比子宮肌瘤組和CIN組更高（P<0.05），與吳雪燕研究結(jié)果一致。說(shuō)明異常分化細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)隨宮頸細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程而增多，其可能參與宮頸細(xì)胞的惡性分化。表明異常分化細(xì)胞過(guò)表達(dá)和宮頸病變進(jìn)程及腫瘤細(xì)胞分化的程度有一定關(guān)系，推測(cè)異常分化宮頸細(xì)胞過(guò)表達(dá)PD-L1會(huì)賦予細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)，使腫瘤免疫微環(huán)境出現(xiàn)免疫抑制強(qiáng)于免疫應(yīng)答的狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸病變進(jìn)程。

Treg是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫體系的細(xì)胞，于惡性腫瘤中高表達(dá)，對(duì)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展作用較大。FoxP3叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子是Treg的重要標(biāo)志，參與Treg細(xì)胞的激活功能，是動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)免疫的因子，有一定的免疫抑制性，和其他細(xì)胞接觸分泌出抑制性細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制免疫細(xì)胞活化[10]。FoxP3主要表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，整體蛋白構(gòu)成為431個(gè)氨基酸，是CD4、CD25、Treg發(fā)生功能關(guān)鍵因子，是Treg可靠表面標(biāo)志物，在腫瘤局部免疫微環(huán)境中有重要的作用。有多個(gè)臨床研究顯示，F(xiàn)oxP3在乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌等中均在腫瘤細(xì)胞或Treg中表達(dá)，是腫瘤預(yù)后不良的重要因素。本文研究顯示，宮頸癌組的FoxP3表達(dá)陽(yáng)性率均比子宮肌瘤組和CIN組高，CIN組的FoxP3陽(yáng)性表達(dá)率高于子宮肌瘤組（P<0.05）。結(jié)果說(shuō)明，宮頸癌組織中的FoxP3表達(dá)出升高趨勢(shì)。Treg抑制細(xì)胞活化，阻滯免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能，使腫瘤抗原抗體無(wú)法發(fā)生免疫反應(yīng)，創(chuàng)造腫瘤細(xì)胞免疫逃逸條件，加速腫瘤發(fā)展。FoxP3和PD-L1的異常分化細(xì)胞在宮頸免疫微環(huán)境中具有協(xié)同作用，提示存在FoxP3激活PD-L1信號(hào)通路，發(fā)揮免疫抑制的作用，可為宮頸病變的治療及宮頸癌的預(yù)防提供新思路。

綜述所述，NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中，隨病變加重出現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)癌癥發(fā)生、發(fā)展有一定作用，可將其作為治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2023-02-10）