張向卉 郭曉曉 田洪成 梅娟娟 翟清亮 王雁林

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256003

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是引起排卵障礙性不孕癥的常見的生殖內(nèi)分泌疾病,對于調(diào)整生活方式、促排卵或手術(shù)治療后失敗,以及合并其他不孕因素的患者可嘗試輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)助孕。多中心隨機對照研究證實,PCOS患者凍融周期移植(frozen embryo transfer,FET)與新鮮周期移植比較有更高的活產(chǎn)率,而且流產(chǎn)及卵巢過度刺激綜合征發(fā)生率更低[1]。本研究旨在篩選PCOS患者首次FET后活產(chǎn)率的影響因素,并構(gòu)建可視化的諾莫預(yù)測模型。

1 資料與方法

1.1 研究對象 于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心2018年5月—2020年3月行ART的PCOS患者,納入標(biāo)準(zhǔn):①根據(jù)2018年《多囊卵巢綜合征中國診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的PCOS患者;②全胚冷凍后首次凍融移植周期;③年齡20～45歲。排除標(biāo)準(zhǔn):子宮畸形、粘膜下肌瘤及宮腔粘連;夫婦雙方中有染色體異常;子宮內(nèi)膜異位癥;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及分析的指標(biāo)不完整者。該研究經(jīng)倫理委員會同意,所有患者已簽署知情同意書。

1.2 ART過程

1.2.1 冷凍胚胎準(zhǔn)備 新鮮周期取卵后行常規(guī)體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射及胚胎培養(yǎng),對于可移植胚胎于取卵后第3、5或6天行全胚冷凍,胚胎冷凍方法為玻璃化冷凍,胚胎移植前均行輔助孵化。

1.2.2 胚胎質(zhì)量評價 以復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量為準(zhǔn),卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎定義為細胞數(shù)7～9個,細胞大小符合發(fā)育階段,碎片程度<10%,無多核。優(yōu)質(zhì)囊胚則為3期及3期以上且內(nèi)細胞團及滋養(yǎng)層評分不含C的囊胚。

1.2.3 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備 本研究中包括人工周期、促排卵周期和自然周期,常規(guī)陰超監(jiān)測卵泡發(fā)育,子宮內(nèi)膜厚度、血流及形態(tài)。人工周期為內(nèi)膜≥8 mm且雌激素應(yīng)用超過14 d后加用孕激素。

1.2.4 黃體支持 自然周期及促排卵周期肌注黃體酮40～60 mg/d或黃體酮軟膠囊400～600 mg/d或黃體酮凝膠 90 mg/d,超聲可見胎心后逐漸減量,至孕10周停藥;人工周期移植后肌注黃體酮 40 mg/d或黃體酮軟膠囊600 mg/d或黃體酮凝膠 90 mg/d,移植后28～35 d孕激素逐漸減量,用藥至10～12 w。

1.2.5 妊娠及活產(chǎn)確定 超聲檢查觀察到一個或多個孕囊診斷為臨床妊娠,包括正常宮內(nèi)妊娠、異位妊娠、宮內(nèi)外同時妊娠,可以僅見孕囊未見胎心。妊娠不足28 w、胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止妊娠,稱為流產(chǎn)?；町a(chǎn)是指每移植周期中取得至少1例活產(chǎn)的分娩數(shù)。

1.3 其他指標(biāo)的確定 身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)為體質(zhì)量/身高2(kg/m2),根據(jù)《中國成人超重和肥胖癥預(yù)防與控制指南》分類,BMI<24 kg/m2為體重正常組,≥24 kg/m2為超重及肥胖組。血脂異常的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》,即血清膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白四項指標(biāo)中,任意一項異常便為血脂異常組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

1.4.1 統(tǒng)計軟件 數(shù)據(jù)分析通過SPSS 21.0及R軟件 4.0.5完成,定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。定性資料以例數(shù)(百分比)表示,數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗。諾莫模型的構(gòu)建及驗證通過R軟件程序包“VIM”“rms”“pROC”及“Formula”。

1.4.2 模型構(gòu)建 諾莫模型通過2018年5月—2019年8月的129例PCOS患者構(gòu)建,首要觀察指標(biāo)為FET后的活產(chǎn)率,單因素分析篩選影響活產(chǎn)率的影響因素(P<0.1),進入二元logistic多因素回歸分析,確定獨立的影響因素并計算回歸系數(shù),然后通過R軟件繪制諾莫預(yù)測圖。

1.4.3 模型評價 預(yù)測模型的評價包括內(nèi)部驗證和外部驗證,驗證內(nèi)容為區(qū)分度及校準(zhǔn)度,區(qū)分度(discrimination)是指模型區(qū)分結(jié)局事件發(fā)生率高和低不同人群的能力,而校準(zhǔn)度(calibration)是評價模型預(yù)測個體發(fā)生結(jié)局事件概率準(zhǔn)確性的指標(biāo),反映的是模型預(yù)測風(fēng)險與實際發(fā)生風(fēng)險的一致程度。模型構(gòu)建的訓(xùn)練集驗證為內(nèi)部驗證,而外部驗證則為模型的實戰(zhàn),利用不同醫(yī)療中心或不同時段的數(shù)據(jù)證明模型的延展性及準(zhǔn)確度。本研究選用2019年9月—2020年3月61例患者為非同期外部驗證人群,利用ROC曲線下面積(area under the curve ,AUC)評價預(yù)測模型的區(qū)分度。通過模型校準(zhǔn)圖判斷校準(zhǔn)度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究中訓(xùn)練集及驗證集人群平均年齡均在30歲以內(nèi),超重及肥胖占比、不孕年限、不孕類型、不孕因素及血脂異常占比無統(tǒng)計學(xué)差異,移植的胚胎類型和內(nèi)膜厚度亦無差別,但驗證集中平均移植胚胎個數(shù)顯著小于訓(xùn)練集且有統(tǒng)計學(xué)意義。訓(xùn)練集及驗證集患者一般情況見表1。

表1 患者一般情況

2.2 單因素及多因素篩選 以是否活產(chǎn)作為因變量,年齡、BMI、FSH、胚胎數(shù)目、胚胎類型、是否有優(yōu)質(zhì)胚胎、內(nèi)膜厚度、AMH、不孕年限及是否血脂異常作為自變量進行單因素及多因素回歸分析,變量賦值見表2。通過多因素篩選,PCOS首次FET后的活產(chǎn)率與是否有優(yōu)質(zhì)胚胎、移植胚胎數(shù)目、體重指數(shù)及血脂是否異常密切相關(guān)。血脂異常、超重及肥胖、單胚胎移植以及無優(yōu)質(zhì)胚胎者移植術(shù)后活產(chǎn)率明顯下降。單因素及多因素篩選的結(jié)果見表3。

表2 因變量及自變量賦值表

表3 單因素及多因素二元logistic回歸分析

2.3 模型構(gòu)建 基于上述單因素及多因素分析結(jié)果,構(gòu)建預(yù)測PCOS患者首次FET后活產(chǎn)率的諾莫模型,通過數(shù)據(jù)分析患者年齡對活產(chǎn)率的影響無統(tǒng)計學(xué)意義,但基于臨床經(jīng)驗及既往研究納入模型。圖1即為構(gòu)建的諾莫預(yù)測模型,比如28歲PCOS患者,胚胎類型為優(yōu)質(zhì)囊胚,得分100分, BMI 23.45 kg/m2得分38分,血脂異常不得分,囊胚移植2枚得分41分,年齡對應(yīng)分值為36分,共計總分為215分,則活產(chǎn)率為76%。

圖1 諾莫預(yù)測模型

2.4 模型驗證 圖2為評價區(qū)分度的ROC曲線AUC,訓(xùn)練集和驗證集的AUC均>0.7,提示模型有良好的區(qū)分度。圖3為校準(zhǔn)圖,圖中對角線為標(biāo)準(zhǔn)線,代表模型預(yù)測值與實際值吻合,內(nèi)部驗證和外部驗證的預(yù)測值及校正值(bias-corrected)都靠近標(biāo)準(zhǔn)線,表示預(yù)測數(shù)和實際觀測數(shù)差別不大,模型校準(zhǔn)度滿意。

圖2 內(nèi)部驗證及外部驗證的ROC曲線

圖3 內(nèi)部驗證及外部驗證的校準(zhǔn)圖

3 討論

諾莫模型最早用于惡性腫瘤患者的預(yù)后估計,篩選各個影響因素之后通過回歸系數(shù)計算權(quán)重及得分,不同的匯總分值對應(yīng)相應(yīng)的生存率,并為患者及醫(yī)生提供簡單可視的圖形[2-3]。Gao等[4]通過178名PCOS患者構(gòu)建諾莫模型,預(yù)測首次移植(新鮮周期或凍融周期)后的活產(chǎn)率,發(fā)現(xiàn)血清膽固醇水平,BMI及基礎(chǔ)FSH是活產(chǎn)的獨立影響因素。鑒于新鮮周期與凍融周期患者體內(nèi)激素水平及生理特征的差異,本研究以全胚冷凍后首次凍融周期移植的患者為研究對象,最終構(gòu)建以年齡、是否有優(yōu)質(zhì)胚胎、BMI、移植胚胎數(shù)目及是否血脂異常為基礎(chǔ)的諾莫預(yù)測模型,具有良好的區(qū)分度和校準(zhǔn)度,對首次凍融周期移植的PCOS患者做出妊娠率及活產(chǎn)率的評估,指導(dǎo)臨床醫(yī)師做出移植決策及后續(xù)診療方案。

本研究中PCOS患者高脂血癥的發(fā)生率為51.76%。血脂水平異常的患者不但不孕癥發(fā)生率高,妊娠早期及晚期并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險也明顯增加[5]。高松城等[6]發(fā)現(xiàn),血甘油三酯及膽固醇水平與受精率、卵裂率和優(yōu)胚率呈負相關(guān)關(guān)系,認為監(jiān)測血脂水平可用于評估胚胎質(zhì)量。對于合并血脂異常的PCOS患者,初次超促排卵后的累積妊娠率明顯下降[7],而助孕前降脂藥物應(yīng)用則可明顯提高胚胎移植后的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率[8]。動物實驗提示高脂水平通過改變基因表達、促進細胞凋亡等機制影響卵母細胞的發(fā)育潛能及胚胎的質(zhì)量[9]。血脂水平異?？赏ㄟ^改變卵母細胞及胚胎質(zhì)量影響胚胎植入,引起不孕癥及妊娠丟失的發(fā)生。

BMI對ART妊娠結(jié)局的影響尚有爭議。本研究表明,BMI與PCOS患者首次凍融周期移植后的活產(chǎn)率呈負相關(guān)關(guān)系。PCOS患者超重及肥胖的發(fā)生率明顯高于其他人群,既往有多項研究發(fā)現(xiàn)隨著BMI的升高,PCOS患者的妊娠率或活產(chǎn)率隨之下降[4,10]。體重增加與血脂障礙、胰島素抵抗、高尿酸、血糖升高及糖尿病等代謝性疾病互為因果,體重增加相關(guān)的代謝異常會改變卵泡液的營養(yǎng)構(gòu)成,超重患者卵泡液中脂蛋白及總蛋白的水平高于體重正常者,而敏感的卵母細胞會受到微環(huán)境中代謝異常的影響,進而降低胚胎的發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局[11-12]。體重增加還會對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生影響。Bellver等[13]在種植窗期間行子宮內(nèi)膜活檢提示,肥胖患者的基因表達與正常體重者存在差異,合并PCOS的肥胖患者異常表達基因與生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)及生長因子調(diào)控等方面相關(guān)。除此之外,部分基因與胚胎種植及不孕原因不孕癥相關(guān)[14-15]。對9 000多個供卵周期的研究發(fā)現(xiàn),移植前胚胎數(shù)據(jù)無差異基礎(chǔ)下,隨著體重的增加,妊娠率及活產(chǎn)率均呈下降趨勢,提示超重及肥胖患者可能通過降低子宮內(nèi)膜的容受性而影響妊娠結(jié)局[16]。

年齡對ART成功率的影響眾所周知,隨著年齡增加,臨床妊娠率及活產(chǎn)率均明顯降低[17]。美國大數(shù)據(jù)調(diào)查提示,小于35歲患者ART后活產(chǎn)率為40.1%,超過42歲患者則僅為4.5%[18]。本研究中年齡與活產(chǎn)率無明確相關(guān)性,考慮原因如下,一為人群問題,本研究患者的平均年齡29.72歲,高齡患者占比較少,而年齡主要通過影響卵巢儲備功能而降低妊娠率,本研究中人群為PCOS患者,卵巢功能良好。除此之外,樣本量偏小也是其中的原因。

隨著移植胚胎數(shù)目的增加,活產(chǎn)率相應(yīng)增加,但多胎妊娠問題隨之而來,因此國內(nèi)指南推薦在基本不影響胚胎著床率和妊娠率的基礎(chǔ)上,減少胚胎移植數(shù)目,持續(xù)關(guān)注減少多胎妊娠。本研究建議關(guān)于胚胎移植數(shù)目,應(yīng)該讓患者充分知情同意,對于諾莫預(yù)測活產(chǎn)率較高的患者,可積極推行單胚胎移植,但對于評分不高或胚胎質(zhì)量較差者,在告知多胎妊娠母嬰風(fēng)險基礎(chǔ)上可移植2枚胚胎。

樣本量和回顧性性質(zhì)使本文有一定局限性,但對于首次FET的PCOS患者,本研究構(gòu)建的諾莫模型可以個體化、量化及可視化地預(yù)測活產(chǎn)率,便于醫(yī)患溝通及臨床決策的實施,同時強調(diào)了BMI和血脂異常對妊娠結(jié)局的影響,為助孕前的體重干預(yù)及糾正代謝異常提供理論依據(jù)。