姜建喜 孫洪亮 劉春嬌 王雁林 李清春

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603

近年來(lái)興起的時(shí)差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging, TLI)能對(duì)胚胎發(fā)育情況進(jìn)行全程監(jiān)控,可提供大量的胚胎發(fā)育信息,為胚胎篩選提供了新的可能。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以記錄胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育的全過(guò)程,無(wú)需反復(fù)打開培養(yǎng)箱,為胚胎發(fā)育提供更加穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境[1]。本研究創(chuàng)新性地將同周期同患者的受精卵隨機(jī)置于時(shí)差成像系統(tǒng)和桌面培養(yǎng)箱中進(jìn)行卵裂期胚胎培養(yǎng),并對(duì)集合培養(yǎng)形成的囊胚首次復(fù)蘇周期移植臨床結(jié)局進(jìn)行了對(duì)比分析,探討時(shí)差成像系統(tǒng)培養(yǎng)和篩選胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年7月至2022年1月間,選取在本中心接受體外受精(in vitro fertilization,IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療的患者,共113個(gè)周期,將同一周期同一患者獲得的受精卵隨機(jī)分成兩組進(jìn)行卵裂期胚胎培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)A組(113周期) 為受精卵置于時(shí)差成像系統(tǒng)中,對(duì)照B組(113周期)為受精卵置于桌面培養(yǎng)箱中;進(jìn)一步對(duì)上述兩組無(wú)新鮮周期移植、并第一次行復(fù)蘇周期單囊胚移植(第五天優(yōu)質(zhì)囊胚)的患者分組比較,實(shí)驗(yàn)C組(42周期)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)A組的患者,對(duì)照D組(33周期)來(lái)源于對(duì)照B組的患者。排除因素:成熟卵子數(shù)(MII卵數(shù))<5 個(gè);行補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射(rescue-intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng) 本中心全部患者采用常規(guī)促排卵方案,注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)36 h后行卵泡穿刺術(shù),將獲得的卵冠丘復(fù)合物(oocyte coroma cumulus complex,OCCC)置于G-IVF培養(yǎng)液中等待受精。注射hCG后39～40 h進(jìn)行常規(guī)受精或ICSI,精卵共孵育4～5 h后脫顆粒。ICSI后的卵子隨機(jī)轉(zhuǎn)移至含G-1的35 mm培養(yǎng)皿液滴中和含G-1的Culture Coin專用培養(yǎng)皿中;而常規(guī)受精后的卵子繼續(xù)置于含G-IVF的四孔皿中過(guò)夜,受精后約18 h評(píng)估原核,再將受精卵隨機(jī)轉(zhuǎn)移至兩種培養(yǎng)皿中。G-1培養(yǎng)皿置于桌面培養(yǎng)箱(COOK公司)培養(yǎng),含G-1的Culture Coin專用培養(yǎng)皿置于時(shí)差成像系統(tǒng)(ESCO公司)中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境均為37℃、6%CO2、5%O2。

1.2.1.1 時(shí)差成像系統(tǒng)培養(yǎng) 本研究使用ESCO Miri TL時(shí)差成像系統(tǒng),圖像采集頻率為10 min/次,每小時(shí)進(jìn)行一次7個(gè)等焦距平面掃描。培養(yǎng)采用14孔Culture Coin專用培養(yǎng)皿,每孔均有標(biāo)記。第3天對(duì)胚胎進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)評(píng)分,待胚胎移植或冷凍后,將剩余胚胎移出,移入含G-2的35 mm培養(yǎng)皿液滴中進(jìn)行集合培養(yǎng),置于桌面培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至第5～6天,對(duì)囊胚進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)。

1.2.1.2 桌面培養(yǎng)箱培養(yǎng) 第3天對(duì)胚胎處理方式及囊胚培養(yǎng)方式同時(shí)差成像系統(tǒng)。

1.2.2 胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 受精后第3天(D3)對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分,根據(jù)分裂速度和碎片比例分為4個(gè)等級(jí),分別為:Ⅰ級(jí),胚胎發(fā)育速度正常,卵裂球大小、數(shù)目均等,胞質(zhì)均勻、無(wú)空泡,碎片不超過(guò)5%;Ⅱ級(jí),胚胎發(fā)育速度正常,卵裂球大小、數(shù)目均等或大致均等,胞質(zhì)均勻、無(wú)空泡,碎片6%～20%;Ⅲ級(jí),胚胎發(fā)育速度大致正常,卵裂球大小、數(shù)目均勻或不均勻,胞質(zhì)有少量空泡,碎片21%～50%;Ⅳ級(jí),胚胎發(fā)育速度異常,卵裂球大小、數(shù)目不均等,胞質(zhì)不均勻、有大量空泡,碎片大于50%。以上Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎統(tǒng)稱為優(yōu)質(zhì)胚胎,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)胚胎統(tǒng)稱為可利用胚胎。

1.2.3 囊胚評(píng)級(jí) 受精后第5～6天對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)級(jí),根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵化將囊胚的發(fā)育分為6期,其中3期及以上囊胚根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行分級(jí),分為A、B、C 3級(jí),將3期及3期以上評(píng)分為AA、AB、BA、BB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚,將3期及3期以上評(píng)分為AA、AB、BA、BB、BC的囊胚定義為可利用囊胚。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞不同時(shí)含C的囊胚均冷凍保存。

1.2.4 囊胚冷凍、復(fù)蘇和移植 所有可用囊胚使用商品化的冷凍和復(fù)蘇液,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行囊胚的冷凍和復(fù)蘇。分析納入研究的113周期患者冷凍囊胚復(fù)蘇情況,選擇第一次行復(fù)蘇周期第五天(D5)單優(yōu)質(zhì)囊胚移植的患者進(jìn)行分組,最終實(shí)驗(yàn)C組納入42周期,對(duì)照D組納入33周期。所有復(fù)蘇周期均采用人工周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜。復(fù)蘇后囊胚轉(zhuǎn)入G-2培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h后等待移植。入組要求:第一次復(fù)蘇胚胎移植、移植1枚第5天囊胚、囊胚評(píng)級(jí)≥4 BB;截止到2022年1月25日。

1.3 觀察指標(biāo) 主要的觀察指標(biāo)為2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率。2PN卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)×100%;D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=3期及3期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;可利用囊胚形成率=可利用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%;臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;流產(chǎn)率=早期自然流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100% 。臨床妊娠是以移植后5 w通過(guò)超聲檢查探及宮內(nèi)孕囊為標(biāo)準(zhǔn)。早期自然流產(chǎn)是指臨床妊娠12 w之前的妊娠丟失。

2 結(jié)果

2.1 新鮮周期實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 同一患者同一周期受精卵隨機(jī)分組培養(yǎng),根據(jù)不同受精方式和年齡進(jìn)行分層比較,結(jié)果顯示,A組和B組在2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率方面比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1、2、3。因?yàn)?ICSI方案、年齡>35歲的僅有2周期,所以兩組間未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 IVF方案、年齡≤35歲,A組和B組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較/%

表2 IVF方案、年齡>35歲,A組和B組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 /%

表3 ICSI方案、年齡≤35歲,A組和B組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較/%

2.2 復(fù)蘇周期妊娠結(jié)局的比較 對(duì)納入研究的75個(gè)復(fù)蘇周期患者進(jìn)行隨訪,實(shí)驗(yàn)C組與對(duì)照D組患者年齡、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度及流產(chǎn)率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但實(shí)驗(yàn)C組臨床妊娠率和著床率顯著高于對(duì)照D組,P<0.05,見表4。

表4 C組和D組患者一般情況及妊娠結(jié)局的比較/%

3 討論

生理狀態(tài)下,胚胎在體內(nèi)處于恒溫、恒濕、低氧、避光的環(huán)境,為了模擬體內(nèi)胚胎的培養(yǎng)環(huán)境,良好穩(wěn)定的培養(yǎng)箱對(duì)體外胚胎培養(yǎng)至關(guān)重要。目前大多數(shù)中心仍然采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)箱,可為配子和胚胎發(fā)育提供理想的溫度、濕度和氣體濃度[2]。然而,由于需要頻繁打開培養(yǎng)箱評(píng)估胚胎發(fā)育情況,使得胚胎長(zhǎng)期暴露于培養(yǎng)箱外,會(huì)改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度及氣體濃度。時(shí)差成像培養(yǎng)系統(tǒng)的引入,使胚胎觀察和評(píng)分無(wú)需再將胚胎從培養(yǎng)箱中取出,從而在胚胎發(fā)育期間保持穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境[3]。

多數(shù)研究認(rèn)為,與傳統(tǒng)培養(yǎng)箱相比,時(shí)差成像系統(tǒng)的應(yīng)用有利于胚胎發(fā)育和改善妊娠結(jié)局[4-8],但其他研究[9-12]認(rèn)為兩者之間并無(wú)顯著差異。目前多數(shù)研究為回顧性分析,旨在比較傳統(tǒng)培養(yǎng)箱和時(shí)差成像系統(tǒng)兩組間培養(yǎng)效果的差異。本研究將同一患者同一周期的受精卵隨機(jī)置于兩種培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),有效地控制了患者的基本情況,消除了兩組間基線資料的差異,對(duì)兩組間培養(yǎng)效果進(jìn)行了前瞻性的分析。另外,本研究根據(jù)不同受精方式和不同年齡進(jìn)行分層分析,發(fā)現(xiàn)兩組間2PN卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。王世凱等[13]研究認(rèn)為,TL組(time-lapse 培養(yǎng)組)的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于CO組(常規(guī)培養(yǎng)組)(45.21% vs 41.92%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但兩組間在2PN卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高洋等[14]研究認(rèn)為TLI系統(tǒng)和傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)間的2PN卵裂率、囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率比較無(wú)顯著性差異。這兩個(gè)研究均未按照受精方式和年齡的不同進(jìn)行詳細(xì)的分層分析,可能造成研究結(jié)果的偏倚。紀(jì)冰等[15]將TLI培養(yǎng)的473個(gè)IVF周期和同期行常規(guī)培養(yǎng)的347個(gè)IVF周期作為研究對(duì)象,每組中按年齡分為<37歲組和≥37歲組,比較兩組間卵裂率和優(yōu)質(zhì)囊胚率等均無(wú)差異,與本研究的研究思路相似,研究結(jié)論一致。

由于納入研究的113個(gè)周期患者新鮮胚胎移植病例數(shù)較少,也為了減少新鮮胚胎周期卵巢刺激、血激素水平[16]及內(nèi)膜因素[17]的干擾,本研究對(duì)這些患者的復(fù)蘇周期胚胎移植情況進(jìn)行了隨訪,并且將研究對(duì)象限定為:第一次復(fù)蘇周期移植、單個(gè)優(yōu)質(zhì)D5囊胚。充分考慮到了凍胚移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)目、移植胚胎天數(shù)、移植胚胎形態(tài)等混雜因素對(duì)結(jié)果的影響,降低了研究偏倚。本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)C組臨床妊娠率和種植率顯著高于對(duì)照D組(83.33% vs 60.61%),而流產(chǎn)率間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與高洋等[14]的研究結(jié)論較為一致。

本研究創(chuàng)新之處在于將同一患者同一周期的胚胎隨機(jī)分組培養(yǎng),前瞻性的研究并按照受精方式和年齡分層分析兩組間培養(yǎng)效果的差異。另外,復(fù)蘇囊胚移植周期中,限定了移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)目、移植胚胎天數(shù)、移植胚胎形態(tài)等因素,盡量減少混雜因素的干擾,使兩組間妊娠結(jié)局比較更具有可信性。

本研究也存在不足之處,首先,為了比較兩種不同培養(yǎng)體系在同一胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)下,培養(yǎng)效果及妊娠結(jié)局方面的差異,本研究時(shí)差成像系統(tǒng)胚胎評(píng)分仍采用形態(tài)學(xué)評(píng)分的方法,未同時(shí)結(jié)合胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)篩選胚胎,未能發(fā)揮出該系統(tǒng)在胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)、卵裂模式分析等方面的優(yōu)勢(shì)。其次,本研究中時(shí)差成像系統(tǒng)僅進(jìn)行了卵裂期胚胎培養(yǎng),囊胚培養(yǎng)全部在桌面培養(yǎng)箱中進(jìn)行,并按照同一來(lái)源胚胎同一液滴集合培養(yǎng),這也可能會(huì)對(duì)結(jié)果分析產(chǎn)生影響。再次,本研究納入的樣本數(shù)較少,下一步在積累足夠數(shù)量病例的前提下,逐步構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室的胚胎評(píng)價(jià)體系和移植胚胎模型,便于快速有效的選擇胚胎。

綜上所述,時(shí)差成像系統(tǒng)確實(shí)能提供較為穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境,并能對(duì)胚胎進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估,提高胚胎的優(yōu)選和鑒別能力,可能改善患者的妊娠結(jié)局。