王瓏 劉小軍 苗倩倩 肖雨晨 李雨容 趙靜

(西安新潤藥業(yè)有限公司藥物研發(fā)中心,陜西 西安 710003)

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝炎向肝硬化、肝癌發(fā)展的中間過程,有效阻止其發(fā)生發(fā)展對肝硬化及肝癌的控制起到至關(guān)重要的作用[1-2]。目前認(rèn)為,TGF-β1/Smads 信號通路在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1) 是促肝纖維化的關(guān)鍵因子,α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)是肝纖維化活化的標(biāo)志物[3-6]。連夏保肝顆粒(Lianxia Baogan Granule,LBG)由連翹、夏枯草、白芍、黃芪、金錢草、五味子、山萸肉、丹參、生地和甘草十味藥材組成,具有滋陰疏肝、化瘀通絡(luò)、散結(jié)之功效,臨床用于瘀阻肝絡(luò)證,為治療肝纖維化的中藥制劑,在臨床使用多年,其作用機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)旨在探討LBG對TGF-β1/Smads信號通路的影響,為LBG臨床治療肝纖維化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 ALT測定試劑盒(批號20180841)、AST測定試劑盒(批號20180791)、γ-GT測定試劑盒(批號20180606)均購自中生北控生物科技股份有限公司;大鼠ColⅠ ELISA試劑盒(EXP 15Feb20)、大鼠ColⅢ ELISA試劑盒(EXP 21JAN20)、Rat hyaluronic acid ELISA試劑盒(EXP 20Feb20)均購自美國Amresco公司;大鼠CTGF ELISA試劑盒(批號191201)、大鼠TGFβ1 ELISA試劑盒(批號191106)均購自上海西唐生物科技有限公司);一抗小鼠a-SMA(批號201808)、大鼠Smad2/3(批號201803)、Smad7(批號201708)、β-actin(批號201812)、TGFβ-RⅠ(批號201710)、TGFβ-RⅡ(批號201801)、TGFβ1(批號201701)、大鼠p-smad2(批號201905)均購自武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(批號73540)、山羊抗鼠IgG/辣根酶標(biāo)記(批號73750)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL Plas超敏發(fā)光液(批號19190503,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);BCA檢測試劑盒(P0012)、RAPI組織細(xì)胞裂解液(P0013B)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;四氯化碳CCl4(批號GB688-92,天津市化學(xué)試劑六廠三分廠);連夏保肝顆粒(批號20190901,西安新潤藥業(yè)有限公司自制,制劑標(biāo)示量:每克顆粒相當(dāng)于0.91 g生藥)。

1.2儀器 MD100全自動生化分析儀(美國Bio-Rad公司);170-3940半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);Model 680酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad model公司);AlPha FCQ數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(美國HP公司);RM2016轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(日本Leica公司);5418R高速冷凍離心機(jī)(德國Centrifuge公司);DM2000光學(xué)顯微鏡(日本Leica公司);BP190S1/1000天平(Sarlorius公司);MiasPro圖像分析軟件(四川大學(xué)計(jì)算機(jī)圖像圖形研究所);UV-2501PC紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3動物 SPF級雄性SD大鼠,體重(230±10)g,西安市交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,醫(yī)動證字SCXK(陜)2018-001。

1.4造模、分組與給藥 72只大鼠,隨機(jī)取60只大鼠皮下注射40%CCl4香油溶液1 mL·kg-1,每隔3 d注射一次,10%白酒自由飲用,連續(xù)造模42天[7-10]。剩余12只大鼠作為空白對照組皮下注射生理鹽水1 mL·kg-1,常規(guī)飼養(yǎng)。造模42天開始給藥治療,60只造模大鼠隨機(jī)分為模型組、安洛化纖丸組(3 g·kg-1)、LBG各劑量組(3 g,1.5 g,0.75 g生藥·kg-1),每組12只,分別灌胃給予相應(yīng)的受試藥物;空白對照組灌胃給予10 mL·kg-1蒸餾水,2次/d,連續(xù)給藥治療35天;給藥治療期間空白對照組常規(guī)飼養(yǎng),其余5組大鼠仍每天飲用5%白酒,每隔7 d皮下注射40% CCl4香油溶液1 mL·kg-1[11]。

1.5指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠禁食給水過夜,腹主動脈取血并分離血清,測定大鼠血清AST、ALT和γ-GT的含量[12],及肝纖維化指標(biāo)HA、PⅢP、LN[13-14],CTGF[15]和TGF-β1[15]。肝大葉取材3份,第1份4%多聚甲醛固定,用于HE和天狼星紅染色,光鏡下觀察肝細(xì)胞變性、膠原纖維增生程度[16-17];第2份冰凍切片,免疫熒光法檢測肝組織α-SMA[18]、TGF-β1[18]水平;第3份肝組織用于Western blot法測定Smad2/3、p-Smad2、Smad7、TβRⅠ、TβRⅡ[2,19]基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1肝纖維化大鼠肝臟病理組織變化 HE染色結(jié)果顯示,空白對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀排列。模型組大鼠肝組織不同程度損傷,肝細(xì)胞脂肪性病變并伴有纖維縱膈成大小不同的假小葉。LBG各劑量組及安絡(luò)化纖丸組大鼠肝組織損傷不同程度減輕,LBG各劑量組大鼠肝細(xì)胞脂肪性病變程度與劑量呈正相關(guān),纖維縱膈形成程度與劑量呈負(fù)相關(guān);安絡(luò)化纖丸組大鼠肝組織肝細(xì)胞脂肪性病變及纖維縱膈形成程度顯著減輕。結(jié)果見圖1。

天狼猩紅染色結(jié)果顯示,空白對照組大鼠肝組織天狼猩紅染色陽性僅表達(dá)位于血管壁。模型組大鼠肝組織天狼猩紅染色陽性表達(dá)位于匯管區(qū)及纖維化形成的纖維絲,纖維絲相互累積可見明顯的纖維縱膈形成,纖維縱膈沿匯管區(qū)向肝組織小葉內(nèi)延伸,相互連接形成假小葉。LBG各劑量組及安絡(luò)化纖丸組肝組織天狼猩紅染色陽性表達(dá)主要在匯管區(qū)及少量形成的纖維絲,纖維絲相互累積從匯管區(qū)延伸向肝組織小葉內(nèi),但無纖維縱膈連接成片形成的假小葉。結(jié)果見圖2。

2.2連夏保肝顆粒對肝纖維化大鼠血清酶(ALT、AST、γ-GT)水平的影響 與空白對照組比較,模型組血清ALT、AST、γ-GT水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,安洛化纖丸組血清ALT、γ-GT水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,LBG各劑量組血清ALT、AST、γ-GT水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表1。

圖1 大鼠肝臟組織HE染色(100倍×)

圖2 大鼠肝組織天狼猩紅染色觀察結(jié)果(100倍×)

表1 連夏保肝顆粒對肝纖維化大鼠血清酶AST、ALT、γ-GT濃度的影響

2.3連夏保肝顆粒對肝纖維化大鼠血清HA、PⅢP、LN、CTGF、TGF-β1含量的影響 與空白對照組比較,模型組HA、LN、PⅢP、CTGF、TGF-β1水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型對照組比較,安洛化纖丸組LN、PⅢP、TGF-β1水平均下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型對照組比較,LBG各劑量組HA、LN、PⅢP、TGF-β1水平均下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見表2。

表2 LBG對肝纖維化大鼠血清HA、PⅢP、LN、CTGF、TGF-β1含量的影響

2.4連夏保肝顆粒對肝纖維化大鼠肝臟α-SMA和TGF-β1表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,α-SMA為紅色熒光,陽性表達(dá)于肝組織血管壁及纖維縱;TGF-β1為綠色熒光,陽性表達(dá)于肝小葉內(nèi)細(xì)胞胞漿,DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光?？瞻讓φ战M大鼠肝組織α-SMA陽性表達(dá)于肝組織血管壁,TGF-β1陽性表達(dá)于肝小葉內(nèi)細(xì)胞胞漿。模型組大鼠肝組織α-SMA強(qiáng)陽性表達(dá)于肝組織纖維縱膈,TGF-β1陽性表達(dá)于肝小葉內(nèi)細(xì)胞胞漿,陽性表達(dá)強(qiáng)度高于空白對照組。LBG各劑量組及安絡(luò)化纖丸大鼠肝組織α-SMA和TGF-β1表達(dá)弱于模型組,結(jié)果見圖3。

圖3 α-SMA和TGF-β1在大鼠肝臟組織中的表達(dá)(100倍×)

2.5連夏保肝顆粒對肝纖維化大鼠肝臟Smad2/3、p-Smad2、Smad7、TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較,模型組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、p-smad2、Smad7蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。與模型組比較,陽性藥對照組和LBG各劑量組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、p-smad2、Smad7蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表3,圖4。

表3 LBG對肝纖維化大鼠肝臟smad2/3、p-smad2、smad7、TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)的影響

A.空白對照組;B.模型組;C.LBG3 g生藥·kg-1;D.LBG 1.5 g生藥·kg-1;E.LBG 0.75 g生藥·kg-1;F.安絡(luò)化纖丸組

3 討論

肝組織細(xì)胞外基質(zhì)ECM合成增加或降解減少、纖維組織大量沉積并以肝內(nèi)結(jié)締組織非正常增生為主要特征的病理生理過程[20-21]被稱之為肝纖維化。CCl4具有增加TGF-β1的表達(dá)而誘導(dǎo)HSC激活的能力,其促進(jìn)HSC增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast,MFB),最終發(fā)展為肝纖維化[1]。乙醇在肝臟代謝產(chǎn)生乙醛[22],乙醛可直接刺激膠原蛋白的合成;且乙醇可使肝臟的氧消耗增加[23-24],減少小葉中心肝細(xì)胞供氧,引起小葉中心肝細(xì)胞的炎癥和壞死,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。故本次試驗(yàn)采用CCl4、乙醇來復(fù)制肝纖維化大鼠模型[25]。

ALT、AST及γ-GT是評價(jià)肝功能的重要指標(biāo),ALT主要在肝細(xì)胞漿中,肝細(xì)胞壞死可導(dǎo)致血清ALT水平升高;AST主要在肝細(xì)胞線粒體內(nèi),肝細(xì)胞壞死可導(dǎo)致血清AST水平明顯升高[5];γ-GT是微粒體中的一種跨膜蛋白質(zhì),肝損傷可導(dǎo)致血清γ-GT水平升高[26]。本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示在乙醇與CCl4的影響下,大鼠血清ALT、AST、γ-GT水平指標(biāo)均顯著升高,表明大鼠肝纖維化模型制作成功。給予LBG后ALT、AST、γ-GT含量均顯著降低,提示LBG對肝纖維化有明顯的降酶保肝作用。

HA、LN、CⅣ、PCⅢ、CTGF與肝纖維化程度密切相關(guān),PCⅢ含量與肝纖維化程度一致,可反映肝Ⅲ型膠原的合成[27];CⅣ可反映基底膜膠原更新,是構(gòu)成基底膜的主要成份;LN與肝纖維化活動呈正相關(guān),是基底膜總特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白;HA可反映肝內(nèi)生成纖維量及肝細(xì)胞受損情況。CTGF是致纖維化因子,能直接刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MFB并異常表達(dá)ECM,參與纖維化過程[28]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示在LBG的作用下大鼠血清HA、LN、CⅣ、PⅢP、CTGF、TGF-β1水平均顯著降低,提示LBG對肝纖維化有明顯的抑制作用。LBG高、中、低劑量及安絡(luò)化纖丸大鼠肝組織ɑ-SMA和TGF-β1表達(dá)顯著弱于模型組,提示在LBG的干預(yù)下TGF-β1的表達(dá)出現(xiàn)不同程度減輕。

TGF-β1/Smads信號通路是最經(jīng)典的參與肝纖維化的信號通路,由細(xì)胞膜外TGF-β1、膜上TβR受體以及膜內(nèi)Smads蛋白三部分組成。TGF-β1是激活HSC強(qiáng)有力的細(xì)胞因子,TβR為信號傳遞受體,Smad是TGF-β1的下游信號分子,其中Smad2、Smad3起促進(jìn)肝纖維化作用,Smad7起抑制肝纖維化的作用[29-30]。Western blot結(jié)果表明LBG可顯著下調(diào)Smad2/3、p-Smad2、Smad7、TβRⅠ和TβRⅡ表達(dá),提示LBG可抑制TGF-β1激活HSC內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路,主要作用位點(diǎn)與下調(diào)TGF-β1與TβRⅠ、TβRⅡ結(jié)合和降低Smad2磷酸化有關(guān)。本試驗(yàn)觀察模型組Smad7對TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無負(fù)性調(diào)節(jié)作用,可能是HSC轉(zhuǎn)化為MFB后失去了TGF-β1誘導(dǎo)Smad7表達(dá)上調(diào)的敏感性,導(dǎo)致Smad2/3持續(xù)磷酸化且不被Smad7所抑制,TGF-β1/Smad信號下轉(zhuǎn),又直接介導(dǎo)HSC向MFB的轉(zhuǎn)化并分泌TGF-β1,提示LBG抑制TGF-β1激活TGF-β/Smad信號通路作用與Smad7無關(guān)。