毛佳琪 張 敏 代文娟 秦加陽(yáng)

濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003

ε-聚賴氨酸(ε-polylysine,ε-PL)是25～35個(gè)L-賴氨酸的同型單體聚合物,具有熱穩(wěn)定好、水溶性高和pH耐受范圍廣等優(yōu)良特性,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、絕大多數(shù)真菌和一些病毒等都有良好的抑菌活性,是我國(guó)批準(zhǔn)使用的四種天然防腐劑之一(GB 2760-2014)[1-2]。近年來(lái),ε-PL在醫(yī)藥、化工、電子材料、生物工程等領(lǐng)域也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。ε-PL的工業(yè)生產(chǎn)方法主要為微生物發(fā)酵法,生產(chǎn)菌株為小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)突變株,通常以葡萄糖和甘油為底物,目前存在產(chǎn)量不高、生產(chǎn)速度慢和轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題,造成ε-PL生產(chǎn)成本較高,嚴(yán)重限制了其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用[3]。

基因工程是提高菌株生產(chǎn)能力的重要方法。目前,小白鏈霉菌中ε-PL的合成途徑研究較為清楚,其合成前體是L-賴氨酸,L-賴氨酸在ε-PL合成酶(polylysine synthetase,Pls)的作用下聚合生成ε-PL[5]。本課題組在研究前期利用基因工程方法在小白鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)了Pls的過(guò)量表達(dá),一定程度上提高了ε-PL的產(chǎn)量和生產(chǎn)速度[6]。在此基礎(chǔ)上,提高前體L-賴氨酸的供給是下一步基因工程改造的重要方向。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是L-賴氨酸合成途徑中重要的輔酶,通常合成1分子L-賴氨酸需要多達(dá)4分子NADPH[7]。因此,解決NADPH供給問(wèn)題可能是提高胞內(nèi)L-賴氨酸濃度的有效方法。

本研究化學(xué)合成了來(lái)自變異鏈球菌的一種特殊的依賴于NADP的三磷酸甘油醛脫氫酶(NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GapN),構(gòu)建了GapN誘導(dǎo)型表達(dá)的小白鏈霉菌基因工程菌,通過(guò)添加不同濃度的纖維二糖調(diào)控GapN的表達(dá)水平,提高胞內(nèi)NADPH濃度,研究其對(duì)ε-PL產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 本研究所用菌株、質(zhì)粒和引物見(jiàn)表1。

表1 本研究用到的菌株、質(zhì)粒和引物

1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L。MS固體培養(yǎng)基成分為甘露醇20 g/L,黃豆粉20 g/L,瓊脂粉20 g/L。種子培養(yǎng)基成分為甘露醇50 g/L,(NH4)2SO410 g/L,酵母粉5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO40.8 g/L,K2HPO41.36 g/L,FeSO4·7H2O 0.03 g/L,ZnSO4·7H2O 0.04 g/L,pH 6.8。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為種子培養(yǎng)基添加檸檬酸鈉5 g/L,纖維二糖0、0.007 5、0.03或0.6 mM。2×YT培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L和氯化鈉5 g/L?？剐跃昱囵B(yǎng)和篩選時(shí)添加抗生素的濃度分別為安普霉素80 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素50 μg/mL、萘啶酮酸25 μg/mL。

1.3 GapN誘導(dǎo)型表達(dá)菌株的構(gòu)建 以含有密碼子優(yōu)化的gapN基因的質(zhì)粒pUC57-gapN為模板,使用引物RS2-gapN-F和RS2-gapN-R(表1)擴(kuò)增得到gapN基因片段。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 15 s,55℃ 15 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán)。將gapN基因片段與NdeI和EcoR I雙酶切的pSET152-Cel-RS2-neo質(zhì)粒做無(wú)縫克隆后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選正確連接的轉(zhuǎn)化子并測(cè)序驗(yàn)證,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pSET152-Cel-RS2-gapN(圖1)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒利用接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入S.albulusCICC11022[6],置30℃培養(yǎng)約5～7 d后可看到抗性接合孢子,培養(yǎng)該孢子得到基因工程菌株S.albulusQ-gapN-Cel。

圖1 pSET152-Cel-RS2-gapN質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程

1.4 菌株培養(yǎng)和發(fā)酵比較 將S.albulusQ-gapN-Cel和對(duì)照菌株S.albulusQ-152分別在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d,收集孢子接種于50 mL 種子培養(yǎng)基中,在30℃和220 rpm下培養(yǎng)48 h得到種子培養(yǎng)液;然后按10%的接種比例將種子培養(yǎng)液接種于50 mL含有不同濃度纖維二糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30℃和220 rpm下培養(yǎng)96 h,收集菌體檢測(cè)gapN基因表達(dá)水平和胞內(nèi)NADPH濃度,并測(cè)定菌體生長(zhǎng)和ε-PL產(chǎn)量。

1.5gapN基因表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法研究不同纖維二糖添加量對(duì)gapN基因表達(dá)水平的影響[6]。收集菌體,使用RNAiso Plus(寶生物)提取總RNA;使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)獲得cDNA;qRT-PCR反應(yīng)使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Master Mix(翌圣)在LightCycler 96儀器(羅氏)上進(jìn)行。選擇RNA聚合酶sigma因子(hrdB)作為內(nèi)參基因。gapN和hrdB基因qRT-PCR的引物對(duì)分別為RT-gapN-F/RT-gapN-R和RT-hrdB-F/RT-hrdB-R(表1),反應(yīng)條件為95℃ 10 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。相對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析,所有的qRT-PCR檢測(cè)均采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行。

1.6 檢測(cè)和分析方法 使用WST-8 NADP+/NADPH檢測(cè)試劑盒(碧云天)測(cè)定胞內(nèi)NADPH濃度,使用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(碧云天)測(cè)定細(xì)胞的蛋白濃度,計(jì)算每微克蛋白質(zhì)的NADPH含量。通過(guò)在分光光度計(jì)中檢測(cè)樣品在600 nm的光密度來(lái)測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。采用甲基橙比色法檢測(cè)發(fā)酵液中ε-PL的產(chǎn)量[5]。采用SnapGene 5(GSL Biotech, www.snapgene.com)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、DNA序列分析和質(zhì)粒圖繪制等工作。采用GraphPad Prism 8繪制發(fā)酵柱狀圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 GapN誘導(dǎo)型表達(dá)小白鏈霉菌基因工程菌株的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增得到的gapN基因大小約為1.5 kb,利用NdeI/EcoR I雙酶切pSET152-Cel-RS2-neo后純化得到的載體框架約為8 kb(圖2A),均符合預(yù)期。無(wú)縫克隆后大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選結(jié)果如圖2B所示,所挑選的3個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶。提取3個(gè)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒后利用NdeI/EcoR I雙酶切驗(yàn)證,均出現(xiàn)了約8 kb的質(zhì)粒條帶和1.5 kb的gapN基因。將所得1號(hào)質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果與目標(biāo)序列100%一致。這表明:成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pSET152-Cel-RS2-gapN。接下來(lái),將該質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入E.coliET12567/pUZ8002,又利用接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入S.albulusCICC11022,所得菌株命名為S.albulusQ-gapN-Cel,即為GapN誘導(dǎo)型表達(dá)小白鏈霉菌基因工程菌,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A.gapN基因和載體框架的制備。泳道1為gapN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化結(jié)果;泳道2為Nde I/EcoR I雙酶切pSET152-Cel-RS2-neo后純化得到的載體框架。B.PCR和雙酶切方法篩選正確的轉(zhuǎn)化子。泳道1～3為挑選的三個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR結(jié)果;泳道4為PCR篩選的陽(yáng)性對(duì)照;泳道5為PCR篩選的陰性對(duì)照;泳道6～8為挑選的三個(gè)轉(zhuǎn)化子的雙酶切結(jié)果;泳道9為gapN基因雙酶切結(jié)果;泳道10為pSET152-Cel-RS2-neo質(zhì)粒雙酶切結(jié)果。

2.2 纖維二糖添加量對(duì)gapN基因表達(dá)和NADPH濃度的影響 將GapN誘導(dǎo)型表達(dá)菌株Q-gapN-Cel在不添加纖維二糖時(shí)gapN基因的表達(dá)量定義為1,添加0.007 5、0.03和0.6 mM纖維二糖時(shí)gapN基因的表達(dá)量分別為1.35、1.85和2.62(圖3A)。這表明,該菌株中g(shù)apN基因的表達(dá)水平與纖維二糖的添加量呈正相關(guān)。胞內(nèi)NADPH濃度檢測(cè)結(jié)果顯示:GapN誘導(dǎo)型表達(dá)菌株Q-gapN-Cel在添加不同濃度纖維二糖情況下胞內(nèi)NADPH濃度顯著高于對(duì)照菌株Q-152;添加0.03 mM纖維二糖時(shí)胞內(nèi)NADPH濃度最高,纖維二糖濃度增加到0.6 mM時(shí)胞內(nèi)NADPH濃度開(kāi)始下降,但仍高于對(duì)照菌株;不添加纖維二糖時(shí)Q-gapN-Cel胞內(nèi)NADPH濃度也高于對(duì)照菌株,這表明,該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)存在泄漏表達(dá)(圖3B)。

**P<0.01,****P<0.0001。

2.3gapN基因表達(dá)水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和ε-PL產(chǎn)量的影響 如圖4所示,GapN誘導(dǎo)型表達(dá)菌株S.albulusQ-gapN-Cel在添加0、0.007 5、0.03和0.6 mM纖維二糖時(shí)的OD值分別為14.62、14.73、15.22和13.98,均顯著低于對(duì)照菌株S.albulusQ-152的OD值17.95。雖然菌體生長(zhǎng)能力不如對(duì)照菌株,GapN誘導(dǎo)型表達(dá)菌株S.albulusQ-gapN-Cel在添加0、0.007 5和0.03 mM纖維二糖時(shí)ε-PL的產(chǎn)量分別為0.54、0.88和0.96 g/L,分別比對(duì)照菌株Q-152的產(chǎn)量0.38 g/L高42.1%、131.6%和152.6%,但是當(dāng)纖維二糖的添加量為0.6 mM時(shí),菌株Q-gapN-Cel的ε-PL產(chǎn)量?jī)H為0.14 g/L,比對(duì)照菌株低63.2%。這表明:GapN表達(dá)水平對(duì)小白鏈霉菌生產(chǎn)ε-PL有顯著影響,通過(guò)控制GapN的表達(dá)水平能夠有效提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的能力。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

3 討論

輔酶參與許多胞內(nèi)反應(yīng),并對(duì)氧化還原平衡和細(xì)胞代謝產(chǎn)生重要影響[9]。輔酶工程是微生物代謝工程的一個(gè)有效途徑,通常利用基因工程方法改變胞內(nèi)輔酶供應(yīng)或者修改酶的輔酶偏好性,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)[10]。在L-賴氨酸的生物合成途徑中,NADPH是一種重要的輔酶,通過(guò)提高胞內(nèi)NADPH供給或降低NADPH需求均能提高谷氨酸棒桿菌合成L-賴氨酸的能力[7,11-12]。L-賴氨酸是ε-PL生物合成的前體,在小白鏈霉菌提高NADPH的供給能否提高ε-PL的產(chǎn)量有待研究。

3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GapA)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一,它催化三磷酸甘油醛到1,3-二磷酸甘油酸的反應(yīng),同時(shí)將NAD還原為NADH。然而,在自然界一些物種如變異鏈球菌中存在一種特殊的依賴于NADP的三磷酸甘油醛脫氫酶GapN,其催化三磷酸甘油醛不可逆氧化為三磷酸甘油酸,并將NADP還原為NADPH[12]。本研究構(gòu)建了異源GapN誘導(dǎo)型表達(dá)的小白鏈霉菌基因工程菌株。本研究發(fā)現(xiàn),GapN表達(dá)能夠顯著提高胞內(nèi)NADPH濃度,隨著GapN表達(dá)水平的提高,ε-PL的產(chǎn)量先增加后降低。其可能的機(jī)制為,GapN能夠與胞內(nèi)原有的GapA競(jìng)爭(zhēng)底物3-磷酸甘油醛,從而提高胞內(nèi)NADPH的含量,同時(shí)會(huì)造成胞內(nèi)NADH含量的降低(圖5)。雖然NADPH含量的提高可能有利于L-賴氨酸的合成,但NADH可以經(jīng)過(guò)呼吸鏈產(chǎn)生ATP,NADH含量的降低可能影響ATP的再生,由于L-賴氨酸聚合為ε-PL需要較多ATP[3],因此,胞內(nèi)NADPH的濃度不宜過(guò)高,只有適當(dāng)提高胞內(nèi)NADPH濃度,同時(shí)不影響ε-PL聚合對(duì)ATP的需求時(shí)才能提高ε-PL的產(chǎn)量。

G3P,3-磷酸甘油醛;1,3-PG,1,3-二磷酸甘油酸;3PG,3-磷酸甘油酸;紅色虛線,本研究引入的代謝途徑;綠色實(shí)線,小白鏈霉菌原有代謝途徑

綜上所述,GapN表達(dá)水平對(duì)小白鏈霉菌生產(chǎn)ε-PL有顯著影響,通過(guò)控制GapN的表達(dá)水平能夠有效提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的能力。本研究為利用基因工程方法提高ε-PL的產(chǎn)量提供了新的靶點(diǎn)。