王新斌,李 赟,馬睿玲,張 怡,王 蓉,李新梅,水蓉枝

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是一種腎小球損傷的組織形態(tài)學(xué)模式,涉及幾種完全不同的臨床疾病,以足細(xì)胞損傷作為主要病理特征[1]。其發(fā)病機制包括遺傳因素、足細(xì)胞損傷、循環(huán)因子等,其中足細(xì)胞損傷是引起FSGS事件的核心環(huán)節(jié)[2]。足細(xì)胞容易受到氧化應(yīng)激失衡的影響,從而發(fā)生功能障礙而引發(fā)蛋白尿[3]。最新的研究表明,Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)/Snail1信號通路在晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)/活性氧(ROS)介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用[4-9]。根據(jù)KDIGO指南[10],治療FSGS一線藥物常以激素和免疫抑制劑為主,但有大量患者的治療效果不佳,疾病最終發(fā)展為終末期腎衰竭,因此,迫切需要探索有效治療方案,尋找新的治療靶點。右歸丸源于六味地黃丸,化裁于金匱腎氣丸,以“益火之源,培補腎之元陽”[11]而名貫千古。近年來,有關(guān)右歸丸的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,右歸丸具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及下丘腦-垂體-靶腺軸、抗炎、抗氧化、保護(hù)肝腎功能等多種藥理活性[12]。本課題組前期的臨床研究[13]已證實,在激素治療FSGS時,輔以右歸丸治療,蛋白尿明顯下降,腎臟功能預(yù)后得到改善,但其對FSGS的影響及機制尚不明確。因此,本實驗通過尾靜脈注射阿霉素復(fù)制FSGS模型大鼠,探究右歸丸對FSGS大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,探討其對AOPPs介導(dǎo)ROS/Wnt/β-catenin/Snail1信號通路的影響,以期揭示右歸丸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD大鼠60只,雄性,8周齡,體質(zhì)量(220±10)g,購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物中心,動物生產(chǎn)許可證號和動物使用許可證號分別為SCXK(甘)2015-0002、SYXK(甘)2015-005。本實驗研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號L20150124)。大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實驗中心,溫度(22±4)℃,濕度(42±4)%。所投放的SPF級大鼠飼料均經(jīng)過輻照滅菌以保證無污染,自由飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器

右歸丸,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠產(chǎn)品,批號11030027;阿霉素,湖北鑫紅利化工有限公司產(chǎn)品,批號L12174。白蛋白(Alb)、尿肌酐(UCr)試劑盒,南京建成生物工程研究所產(chǎn)品,批號依次為A028-2-1、C011-2-1;ROS、AOPPs檢測試劑盒,美國西格瑪公司產(chǎn)品,批號依次為RAB0311、RAB0277;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體、羊抗鼠IgG、β-actin抗體,上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號依次為C0105S、A0239、A0192、AF5001;Snail1抗體、Wnt1抗體、β-catenin抗體,英國艾博抗公司產(chǎn)品,批號依次為ab31787、ab38449、ab32536。JEM-1400 Flash型透射電子顯微鏡,日本電子株式會社產(chǎn)品;EMUC7型超薄切片機,德國徠卡公司產(chǎn)品;GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡,日本尼康公司產(chǎn)品;TWK-FST32型組織勻漿儀,武漢泰普拓公司產(chǎn)品;FC型全自動多功能酶標(biāo)檢測儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;1658033型電泳儀,美國伯樂公司產(chǎn)品;Light Cycler 480型實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)儀,瑞士羅氏公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、醋酸潑尼松組和右歸丸高、中、低劑量組,每組10只。模型組和各藥物組均采用尾靜脈一次性注射阿霉素6.5 μg/g體質(zhì)量誘導(dǎo)法制備FSGS模型[14],空白組尾靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)9 g/L生理鹽水1 μL/g體質(zhì)量。以24 h尿蛋白>100 μg/g為FSGS造模成功標(biāo)準(zhǔn)。50只動物均造模成功。模型復(fù)制成功后,右歸丸低、中、高劑量組依次給予右歸丸混懸液2.8、5.6、11.2 g/(kg·d)灌胃,醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松混懸液6.3 μg/(g·d) 灌胃,空白組、模型組給予9 g/L生理鹽水10 μL/(g·d)灌胃,連續(xù)6周。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

末次給藥后禁食不禁水,用糞尿分離式代謝籠收集24 h尿液,收集的尿液分裝到加有0.1 g/L疊氮化鈉的EP管中,4 ℃保存,用于尿常規(guī)檢查;腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠,將大鼠仰置在操作臺上,在大鼠左側(cè)心尖搏動處垂直刺入采血針,用生化管收集血液6～8 mL,待檢;斷椎處死大鼠,摘除雙腎,一側(cè)腎臟用于HE染色和腎臟組織超微病理觀察;另一側(cè)腎臟進(jìn)行低溫勻漿, -80 ℃保存,用于免疫印跡法(Western blot)和real-time PCR檢測。

1.4.1 尿Alb、UCr與Alb/UCr比值

檢測時,尿液的樣本和試劑盒室溫放置20 min,按照試劑盒說明書檢測Alb、UCr,計算Alb/UCr(A/U)比值。

1.4.2 腎組織病理學(xué)形態(tài)

將腎組織固定于40 g/L多聚甲醛溶液中,經(jīng)0.1 mol/L PBS緩沖液洗滌,梯度乙醇、二甲苯脫水,石蠟包埋,縱向切片(厚4 μm),石蠟片經(jīng)二甲苯、梯度無水乙醇水化后用蘇木精-伊紅(HE)染色,在200倍倒置顯微鏡下觀察。

將腎組織放入10 mL/L 鋨酸中,4 ℃下固定3 h,用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水15 min,室溫下將脫水組織塊分別于純丙酮、丙酮-包埋樹脂(1∶1)和包埋樹脂中浸透3 h,轉(zhuǎn)移至裝滿包埋樹脂的硅膠膠囊模具中,60 ℃下固化約48 h,切割成70 nm厚度切片,鈾、鉛雙染色各5 min,室溫下干燥過夜,于透射電子顯微鏡下觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3 血清AOPPs含量

4 ℃下,以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心,取血清,按照試劑盒說明書檢測血清AOPPs含量。

1.4.4 腎組織ROS含量

于-80 ℃冰箱中取出腎組織,充分研磨,按照試劑盒說明書檢測腎組織ROS含量。

1.4.5 腎組織Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白水平

采用Western blot法檢測。將腎組織研磨,裂解后進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,蛋白濃度檢測采用BCA法試劑盒。隨后取變性后蛋白進(jìn)行上樣,10% SDS-PAGE凝膠電泳,后濕法轉(zhuǎn)膜;將膜暴露于封閉緩沖液中2 h,在4 ℃下與一級抗體Snail1( 1∶1 000)、Wnt1(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000) 孵育過夜;在室溫下加入對應(yīng)的羊抗兔 IgG(1∶2 000) 或羊抗鼠IgG(1∶5 000)孵育1 h,搖床搖晃上加TPBS洗滌3次,ECL顯色,顯影并拍照,選用ImageJ圖像處理軟件分別測得目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值,以兩者的比值反映各蛋白表達(dá)水平。

1.4.6 腎組織Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA水平

采用real-time PCR法檢測。取各組腎組織0.5 g,均加入Trizol 1 mL,置于冰上,研磨勻漿,振蕩后4 ℃下以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速15 000 r/min離心,取上清液,加入氯仿離心,水相和有機相兩相分離,異丙醇、乙醇提純,分光光度計260 nm/280 nm檢測總RNA純度,互補核糖核酸(cRNA)反轉(zhuǎn)錄互補脫氧核糖核酸(cDNA)操作過程嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。real-time PCR反應(yīng)體系2×SYBR?PremixExTaqTM10 μL,引物F、R各1 μL,無核酸無酶水2 μL,Cdna 2 μL。循環(huán)過程95 ℃10 min,第1次循環(huán)95 ℃ 2 min,后40次循環(huán)95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s。溶解曲線制備65 ℃升至95 ℃,0.5 ℃/s。以β-actin為參比基因,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對比

空白組大鼠精神、活動、飲水、飲食未見異常。模型組大鼠精神萎靡,活動減少,毛色枯槁,弓背聳肩,常蜷臥飼養(yǎng)籠一角,飲食、體質(zhì)量減少。右歸丸低、中、高劑量組和醋酸潑尼松組大鼠較模型組大鼠活動逐漸增加,皮毛光澤漸顯,飲食量略有增加,體質(zhì)量與24 h尿蛋白呈正相關(guān)性。

2.2 各組大鼠尿Alb、UCr和A/U對比

與空白組對比,模型組尿Alb、UCr水平及A/U升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比,右歸丸組尿Alb、UCr、A/U下降(P<0.05),且呈量效相關(guān)性。與醋酸潑尼松對比,右歸丸高劑量組尿Alb、UCr水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Alb、UCr和A/U對比

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)對比

光鏡下:與空白組對比,模型組可見腎小球體積變大且有水腫顯現(xiàn),腎小球囊粘連,系膜增生,毛細(xì)血管腔狹窄,腎小管上皮細(xì)胞呈空泡性。醋酸潑尼松組腎小球、腎小管損傷得到一定改善,病理損傷程度減輕。右歸丸3個劑量組腎組織病理損傷改善,毛細(xì)血管袢開放良好,毛細(xì)血管腔略顯狹窄,基底膜增生、囊壁粘連及小管上皮細(xì)胞病變顯著減緩,改變呈量效相關(guān)性。見圖1。

注:A.空白組;B.模型組;C至E依次為右歸丸低、中、高劑量組;F.醋酸潑尼松組

透視電鏡下:空白組大鼠足突呈線性分布且排列整齊,腎小球基底膜無異常變化。模型組腎小球基底膜薄厚不均,基底膜側(cè)有釘突,足突短粗且出現(xiàn)嚴(yán)重融合。醋酸潑尼松組基底膜的損傷明顯改善,足突輕度融合。右歸丸3個劑量組腎小球基底膜損傷明顯好轉(zhuǎn),足突的數(shù)量和密度恢復(fù)趨好,雖融合現(xiàn)象較明顯但可見較多較長足細(xì)胞且排列較緊密,且呈劑量相關(guān)性。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C至E依次為右歸丸低、中、高劑量組;F.醋酸潑尼松組

2.4 各組大鼠血清AOPPs、腎組織ROS含量對比

與空白組對比,模型組大鼠血清AOPPs、腎組織中ROS含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比,醋酸潑尼松組、右歸丸組大鼠的AOPPs、ROS含量減少(P<0.05)。醋酸潑尼松組與右歸丸高劑量組對大鼠AOPPs、ROS含量對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 各組大鼠血清AOPPs、腎組織ROS含量對比

2.5 各組大鼠腎組織中Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表達(dá)量對比

與空白組對比,模型組腎組織中Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表達(dá)量上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比,各藥物組腎組織Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)。醋酸潑尼松組與右歸丸高劑量組Wnt1、β-catenin及Snail1蛋白表達(dá)量對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和表4。

注:A.空白組;B.模型組;C至E依次為右歸丸低、中、高劑量組;F.醋酸潑尼松組

表4 各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表達(dá)量對比

2.6 各組大鼠Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表達(dá)量對比

與空白組對比,模型組Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表達(dá)量上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對比,醋酸潑尼松組和右歸丸各組Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。與醋酸潑尼松組對比,右歸丸組在下調(diào)Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA的作用弱于醋酸潑尼松組見表5。

表5 各組大鼠Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表達(dá)量對比

3 討 論

FSGS是腎病綜合征常見的病理類型之一,臨床治療中常存在激素抵抗或類固醇耐藥的現(xiàn)象。據(jù)報道,給予大劑量激素治療后仍有50%療效欠佳,且5～10年迅速發(fā)展為終末期腎病[15]。因此積極探索一種作用確切、安全有效治療方案來延緩或抑制FSGS病程進(jìn)展已成為目前國內(nèi)外腎病研究者關(guān)注的熱點。右歸丸是醫(yī)家治療腎性疾病常用的古方之一。本課題組前期臨床研究證實,右歸丸可改善患者24 h尿蛋白含量,保護(hù)腎功能,同時能下調(diào)多耐藥基因1、P-糖蛋白170的表達(dá),上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體-α(GRα)低表達(dá)量,從而增加難治性腎病綜合征患者對類固醇激素的敏感性[16]。蛋白尿是FSGS腎病主要的臨床癥狀,是由足細(xì)胞的損傷使致腎小球過濾屏障缺陷而致?，F(xiàn)在越來越多的研究者把治療FSGS的靶點聚焦于足細(xì)胞,并認(rèn)為FSGS肇始于足細(xì)胞的損傷。研究[17]指出,AOPPs的積累通過激活 ROS 依賴的Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)靶基因Snail的轉(zhuǎn)錄,引起nephrin和podocin的表達(dá)異常,從而導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生。

蛋白尿是導(dǎo)致FSGS發(fā)生的關(guān)鍵因素,同時也是該病病程進(jìn)展的加重因素,因此,尿蛋白量是防治FSGS的關(guān)鍵性指標(biāo)之一。尿蛋白/肌酐(ACR)是能準(zhǔn)確反映尿微量白蛋白排泄的指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠腎臟病理損傷明顯,尿Alb、UCr及A/U值升高,右歸丸干預(yù)后ACR水平明顯下降,腎臟的病理損傷程度及足細(xì)胞融合度明顯降低。結(jié)果提示,右歸丸可降低FSGS大鼠尿蛋白含量,緩減腎臟病理損害,對腎臟具有保護(hù)作用。此與于曉霞等[19]的研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激既是造成足細(xì)胞損傷的原因之一,又是FSGS發(fā)生發(fā)展的主要機制。ROS是生物系統(tǒng)中重要的氧化應(yīng)激因子,過量的ROS引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致血中的白蛋白被氧化為AOPPs;而AOPPs是一類促炎癥、促氧化的大分子生物毒素,隨血液循環(huán)沉積在腎臟中而誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。目前有研究[20]表明,EMT事件是AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的結(jié)果,也可能是FSGS早期發(fā)病的關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清AOPPs、腎組織中ROS水平均顯著升高,右歸丸治療后大鼠AOPPs、ROS含量明顯減少。由此筆者推測,ROS介導(dǎo)AOPPs是足細(xì)胞形成EMT的主要因素,且右歸丸可能通過抑制AOPPs、ROS減輕足細(xì)胞發(fā)生EMT從而保護(hù)腎臟。

隨著沉積在腎臟中AOPPs量逐漸升高,刺激足細(xì)胞糖基化終產(chǎn)物受體并激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化酶,激活后上調(diào)的NADP氧化酶誘導(dǎo)細(xì)胞(足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞)產(chǎn)生ROS,進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號通路。被激活的 Wnt/β-catenin信號又反過來能激活 ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激性反應(yīng),造成腎組織纖維化惡性循環(huán)。有研究[21-22]發(fā)現(xiàn),在阿霉素誘導(dǎo)的腎病小鼠模型中Wnt/β-catenin信號激活優(yōu)先于蛋白尿的發(fā)生,而特異性去除β-catenin的小鼠可以免受阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。前期研究[13]表明,足細(xì)胞是右歸丸作用的主要靶點。本研究結(jié)果顯示右歸丸可減少FSGS大鼠腎小球 Wnt1、β-catenin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),此為右歸丸治療足細(xì)胞疾病提供了一定的理論依據(jù)。

研究[23]表明,當(dāng)Wnt受到外界刺激時,其蛋白的表達(dá)量隨之增加,使β-catenin逃逸泛素水解系統(tǒng)降解而在細(xì)胞內(nèi)積聚,游離狀態(tài)的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合,募集蛋白P300在內(nèi)的共激活因子,促進(jìn)靶基因Snail1轉(zhuǎn)錄。Snail1是一種鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子,在誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT、促進(jìn)腎臟纖維化起關(guān)鍵作用。Boutet 等[24]研究發(fā)現(xiàn),成年轉(zhuǎn)基因小鼠Snail1活化后可誘導(dǎo)腎纖維化和EMT。王曉彤等[25]發(fā)現(xiàn):高糖刺激48 h后,足細(xì)胞Snail1 mRNA和蛋白顯著表達(dá),而nephrin 表達(dá)則明顯下調(diào);雷公藤甲素干預(yù)后,Snail1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少,而 nephrin mRNA及蛋白表達(dá)量較高糖組增加;足細(xì)胞中高的Snail1可抑制足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin表達(dá),誘發(fā)蛋白尿的發(fā)生和腎纖維化。本研究結(jié)果顯示,FSGS大鼠組織中Snail1 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),通過右歸丸干預(yù),各劑量組大鼠腎組織中Snail1 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下調(diào),提示右歸丸通過抑制Snail 1高表達(dá)而發(fā)揮治療FSGS的作用。此與國內(nèi)研究結(jié)果相一致。

綜上所述,右歸丸通過下調(diào)氧化應(yīng)激因子AOPPs、ROS進(jìn)而抑制FSGS大鼠ROS/Wnt/β-catenin/Snail1信號通路傳導(dǎo),實現(xiàn)對足細(xì)胞功能的保護(hù),延緩FSGS病程的進(jìn)展。本研究為闡明FSGS產(chǎn)生的分子機制提供了一定參考,同時也為中醫(yī)藥防治FSGS提供了新的治療靶點。