陳廣芳，文昌暉

1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

銀屑病是一種慢性炎癥性和自身免疫性疾病，典型病理學(xué)特征為大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于表皮［1］，中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)參與心血管、腎臟損傷等血管內(nèi)皮損傷過(guò)程［2］，增加心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，抑制中性粒細(xì)胞活化可減輕銀屑病皮損。銀屑病尚無(wú)根治方案，目前銀屑病的中醫(yī)藥治療確有療效，相比多數(shù)治療方案，可減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

前期參照孫遜等［3］的中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路及過(guò)程，分別分析4 位名家驗(yàn)方干預(yù)銀屑病的主要有效成分，包括趙炳南先生涼血活血湯［4］、國(guó)醫(yī)大師禤國(guó)維教授皮膚解毒湯［5］、李斌教授益氣活血方［6］、賈敏教授消疕湯［7］，通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)其干預(yù)銀屑病的有效成分均含有槲皮素。

目前無(wú)銀屑病外周血中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）病理機(jī)制以及槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 作用機(jī)制文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)GEO 芯片分析及分子對(duì)接原理分析銀屑病外周血NE 的病理機(jī)制，并探究槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE的作用機(jī)制。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)本研究主要運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫(kù)和平臺(tái)包括GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO數(shù)據(jù)庫(kù)（gene ontology，http：//geneontology.org/）、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）、DGIdb 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.dgidb.org/）、MY CANCER GENOME數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.mycancergenome.org/）、SwissTargetPrediction 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、String平臺(tái)（https：//string-db.org/）及RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）等。

1.2 疾病GEO芯片熱圖繪制通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)收集GSE106087芯片與平臺(tái)數(shù)據(jù)信息，通過(guò)R軟件及edgeR、pheatmap等插件，設(shè)定P＜0.05，F(xiàn)DR＜1，將差異基因?qū)隕xcel表格，繪制熱圖。

1.3 疾病差異性基因基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）運(yùn)用R 軟件及enrichplot、ggplot2、DOSE、cluster Profiler、colorspace、stringi等插件，上傳銀屑病NE差異性基因至GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，按照P＜0.01和q＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)篩選，將槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE的靶點(diǎn)基因富集分析結(jié)果分別導(dǎo)入Excel表格，繪制氣泡圖及圈圖。

1.4 化合物靶標(biāo)基因收集通過(guò)TCMSP、Drug-Bank［8］、DGIdb 和MY CANCER GENOME 數(shù)據(jù)庫(kù)收集槲皮素預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因，與Excel 表格取交集基因，匯總到txt文件中。

1.5 槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及驗(yàn)證將槲皮素與銀屑病外周血NE的差異基因取交集后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，依次運(yùn)用Bisogenet和CytoNCA 插件，設(shè)置計(jì)算中心度（DC）＞61，構(gòu)建蛋白互助拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，收集核心基因。運(yùn)用String平臺(tái)驗(yàn)證槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE差異性基因，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(proteinprotein interactions，PPI)，剔除PPI 網(wǎng)絡(luò)中游離蛋白，收集核心差異性蛋白及基因。

1.6 分子對(duì)接證據(jù)支持收集Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中槲皮素結(jié)構(gòu)，通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 核心差異性蛋白結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMOL軟件去除水分子、小分子配體，并運(yùn)用AutoDock軟件加氫等處理后，運(yùn)用Vina 進(jìn)行分子對(duì)接模擬并獲取對(duì)接能量，通過(guò)PyMOL 獲得受體與配體分子對(duì)接可視化圖。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病外周血NE 的GEO 芯片熱圖從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE106087芯片與平臺(tái)數(shù)據(jù)，共6個(gè)樣本，獲得下調(diào)基因36個(gè)，上調(diào)基因153個(gè)。展示上調(diào)基因和下調(diào)基因各30 個(gè)，顏色深度代表基因表達(dá)程度，顏色越紅，基因表達(dá)越顯著；顏色越綠，基因表達(dá)越不顯著。Con 代表健康人NE 樣本基因、Treat代表銀屑病患者樣本基因。見圖1。

圖1 正常人與銀屑病患者外周血NE差異基因熱圖

2.2 銀屑病外周血NE差異性基因GO富集分析銀屑病外周血NE 差異性基因GO 富集分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC），按照P＜0.01 和P.adjust＜0.05篩選，共461種生物功能，其中432條BP、23條CC、6 條MF，均展示前10 條。綜合P 值及富集程度，繪制圈圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)。主要與生物過(guò)程中性粒細(xì)胞活化、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子反應(yīng)等上調(diào)，以及與生物過(guò)程嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫等下調(diào)密切相關(guān)。見圖2—3。

圖2 銀屑病患者外周血NE的GO富集分析氣泡圖

圖3 銀屑病患者外周血NE的GO富集分析圈圖

2.3 銀屑病外周血NE 差異性基因KEGG 富集分析按照P＜0.01和P.adjust＜0.05篩選，共12條信號(hào)通路。綜合P值及富集程度，繪制氣泡圖和圈圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)，結(jié)果顯示銀屑病外周血NE 的病理機(jī)制主要與ECHDC3、ARG1、OLFM4、CLEC12A 基因及中性粒細(xì)胞活化、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等信號(hào)通路等上調(diào)，以及XIST、BTNL3、CCR3、SPP1 基因和中性粒細(xì)胞脫顆粒生物過(guò)程、NOD 樣受體信號(hào)通路等下調(diào)關(guān)系密切。見圖4—5。

圖4 銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析氣泡圖

圖5 銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈圖

2.4 槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)將槲皮素與銀屑病外周血NE 的差異基因取交集后，共收集11個(gè)差異性基因于txt文件中，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟 件，使 用Bisogenet 和Cyto NCA，設(shè)置計(jì)算中心度（DC）＞61，構(gòu)建蛋白互助拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)共得到JUN、SSP1 等28 個(gè)候選基因，其中JUN 處于最核心位置。將txt 與Excel 進(jìn)行交集分析，獲得槲皮素下調(diào)銀屑病外周血NE 基因?yàn)镸AOA、FLT3、MPO、CYP1B1、CDK5R1、ARG1、NQO2，上調(diào)銀屑病NE 基因?yàn)镃CL2、IL1B、JUN、SPP1。此外，將JUN、SPP1等11個(gè)差異性基因上傳至String平臺(tái)，進(jìn)行PPI分析，可見下調(diào)銀屑病外周血NE 基因FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上調(diào)銀屑病外周血NE 基因CCL2、IL1B、JUN、SPP1 處于核心位置。綜上可知JUN、SPP1 靶標(biāo)處于核心地位。見圖6—7。

圖6 槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE的基因拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖

圖7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息

2.5 槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE靶點(diǎn)基因GO富集分析使用R 軟件，根據(jù)槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE靶點(diǎn)基因，進(jìn)行GO富集分析，并分別以BP、CC和MF歸類收集，以P＜0.01和q＜0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選，共收集291條BP、7條CC、14條MF。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，繪制氣泡圖和圈圖，fold change＞0為上調(diào)，反之為下調(diào)，可知，槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 主要與ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、JAK-STAT 信號(hào)通路的脂多糖和受體等上調(diào)，以及ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)等下調(diào)密切相關(guān)。見圖8—9。

圖8 槲皮素干預(yù)銀屑病患者外周血NE的GO富集分析氣泡圖

圖9 槲皮素干預(yù)銀屑病患者外周血NE的GO富集分析圈圖

2.6 槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE靶點(diǎn)基因KEGG富集分析取P＜0.02 和P＜0.05，共篩選出34條（展示前20 條），主要涉及：可卡因成癮、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、IL-17信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE 信號(hào)通路、美洲錐蟲病、Toll 樣受體信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、耶爾森菌感染、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、色氨酸代謝、NOD 樣受體信號(hào)通路。綜合P值及富集程度，繪制氣泡圖，fold change＞0 為上調(diào)，反之為下調(diào)。結(jié)果顯示槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 主要與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路等上調(diào)，以及可卡因成癮、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等下調(diào)密切相關(guān)，logFC＞0 為上調(diào)信息，反之為下調(diào)信息。見圖10—13。

圖10 槲皮素干預(yù)銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析氣泡圖

圖11 槲皮素干預(yù)銀屑病患者外周血NE的KEGG富集分析圈圖

圖12 白細(xì)胞介素17信號(hào)通路

圖13 腫瘤壞死因子信號(hào)通路

2.7 分子對(duì)接證據(jù)支持通過(guò)RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別收集槲皮素可下調(diào)的FLT3、MPO、CDK5R1、ARG1 以及上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1 蛋白（受體）結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用PyMOL、AutoDock、Vina 等軟件處理受體與配體（槲皮素）結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行分子對(duì)接模擬，分別收集分子對(duì)接模擬的最佳對(duì)接能量，繪制可視化圖，以能量最低的結(jié)構(gòu)為最佳結(jié)構(gòu)，能量小于0 說(shuō)明配體和受體可自主結(jié)合，繪制槲皮素與JUN、SPP1 等6 種受體的分子對(duì)接可視化圖，而槲皮素與FLT3、CDK5R1 蛋白無(wú)法進(jìn)行分子對(duì)接。圖中紅色箭頭處為槲皮素與蛋白分子對(duì)接最佳結(jié)構(gòu)。見圖14、表1。

表1 槲皮素及其相關(guān)蛋白分子對(duì)接模擬能量

以上結(jié)果表明，槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE機(jī)制主要與下調(diào)MPO、ARG1 和上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1 及其影響的病理過(guò)程密切相關(guān)，進(jìn)而下調(diào)IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路，以及上調(diào)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路等，其中與下調(diào)IL-17 信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路關(guān)系最大。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性和自身免疫性疾病，目前病理機(jī)制尚不清楚，文獻(xiàn)認(rèn)為IL-23/Th17 軸深度參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制，調(diào)節(jié)IL-23/Th17軸可以減輕銀屑病皮損［1］。中性粒細(xì)胞是含量最多的固有免疫細(xì)胞，其致病機(jī)制主要與慢性炎癥性、自身免疫性疾病相關(guān)［9］，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與銀屑病的初始和維持階段有關(guān)［1］。IL-23/Th17 軸由中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用產(chǎn)生［10］，中性粒細(xì)胞可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、胞漿細(xì)胞、受損皮膚和滑膜液中的固有淋巴樣細(xì)胞分泌IL-17A［11］，IL-17A 上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)CCL20 水平，CCL20 可與趨化因子受體CCR6 結(jié)合；浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)HSP70，TLR4與其受體HSP70結(jié)合后產(chǎn)生IL-23，IL-23 促進(jìn)Th17 細(xì)胞的活化并分泌IL-17A、IL-17F 和IL-22，IL-17A 和IL-22 誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖［12］；活化的角質(zhì)形成細(xì)胞可釋放外泌體，負(fù)反饋促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化［13］；同時(shí)，在CCR6 影響下，天然Th17 細(xì)胞被招募到銀屑病表皮，并在IL-23和IL-1β輔助下浸潤(rùn)于表皮下，創(chuàng)建IL-23/Th17軸框架，加重銀屑病皮損。在關(guān)節(jié)中，IL-17A 可作用于成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞等，上調(diào)抗菌肽、趨化因子、促炎和增殖細(xì)胞因子水平，促進(jìn)組織炎癥和骨重塑，引發(fā)銀屑病關(guān)節(jié)炎［11］。SHAO 等［14］認(rèn)為，中性粒細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞中炎癥基因表達(dá)，通過(guò)上調(diào)NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，上調(diào)IL-1β、IL-36G、IL-18、TNF-α和趨化因子（C-X-C基序）配體等表達(dá)水平，并募集于皮膚中，且活化的IL-36可抑制彈性酶、組織蛋白酶G和絲氨酸蛋白酶抑制劑A1 和A3［15］，最終引發(fā)膿皮病型銀屑病。另外，活化的NF-κB 信號(hào)誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞角蛋白6 和16 表達(dá)，減少細(xì)胞代謝周期［12］，進(jìn)而促進(jìn)角化不全。IL-17A和IL-22可上調(diào)TNF-α 表達(dá)，銀屑病皮損中過(guò)表達(dá)抗菌肽LL-37，均可激活樹突狀細(xì)胞，加速中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞從外周血向皮膚浸潤(rùn)［12］。因此，有效干預(yù)銀屑病中性粒細(xì)胞活化及浸潤(rùn)可減輕銀屑病皮損，中性粒細(xì)胞成為干預(yù)銀屑病的有效靶點(diǎn)之一。

槲皮素是一種黃酮類物質(zhì)，廣泛存在于中藥材及食物中，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血管及免疫調(diào)節(jié)等多種生物特性，可被用于干預(yù)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾?。?6］。槲皮素通過(guò)下調(diào)Th17 細(xì)胞活性［17-18］，進(jìn)而下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36G、TNF-α和趨化因子配體等表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞從外周血浸潤(rùn)于皮膚；同時(shí)，下調(diào)IL-17A、IL-17F和IL-22 表達(dá)，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，從而減輕銀屑病皮損。槲皮素減少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)角化細(xì)胞的刺激，進(jìn)而釋放趨化因子［19］。槲皮素通過(guò)炎癥相關(guān)信號(hào)通路抑制中性粒細(xì)胞活性［20］，同時(shí)，抑制中性粒細(xì)胞自噬及NETs 形成，并抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低外周血炎癥細(xì)胞因子水平，最終促進(jìn)活化的中性粒細(xì)胞凋亡［21］。此外，ZHU 等［22］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素抑制UVB照射誘導(dǎo)毒性引起角質(zhì)形成細(xì)胞釋放ROS 短暫性升高，并促進(jìn)細(xì)胞膜流動(dòng)性和抑制線粒體膜去極化，進(jìn)而減輕ROS對(duì)細(xì)胞膜和線粒體的損害。

綜上所述，槲皮素干預(yù)銀屑病外周血NE 主要與6 個(gè)核心靶點(diǎn)基因有關(guān)，分別是下調(diào)MPO、ARG1和上調(diào)CCL2、IL1B、JUN、SPP1靶標(biāo)基因，而JUN、SSP1處于核心地位，說(shuō)明槲皮素主要通過(guò)下調(diào)IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)銀屑病1L-23/Th17軸，達(dá)到干預(yù)銀屑病外周血NE 水平，抑制中性粒細(xì)胞在銀屑病皮損區(qū)的浸潤(rùn)，減輕銀屑病皮損。此外，槲皮素可減輕UVB 對(duì)皮膚照射的損傷，因此，將含槲皮素的中藥作為干預(yù)銀屑病的單體或一種防曬劑值得進(jìn)一步研究。