謝嶺平,賴麗莎,彭蘭芬 綜述,付文金△ 審校

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬厚街醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東東莞 523000;2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣東東莞 523808

聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)現(xiàn)象于2001年由唐本忠團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn),AIE是指該類型的物質(zhì)在稀溶液或單分子狀態(tài)下不發(fā)光,當(dāng)它在高濃度或者形成聚集態(tài)時(shí),熒光效應(yīng)增強(qiáng)。不同于傳統(tǒng)有機(jī)熒光分子在低濃度(分散狀態(tài))時(shí)發(fā)射熒光、在高濃度(聚集狀態(tài))時(shí)易發(fā)生聚集熒光猝滅(ACQ)[1-2]現(xiàn)象,具有AIE性質(zhì)的發(fā)光分子被稱之為聚集致發(fā)射發(fā)光物質(zhì)(AIEgens)。AIEgens作為新型熒光材料,因其優(yōu)異的光物理性能特別適用于細(xì)菌成像檢測和細(xì)菌感染治療。本文回顧了近幾年來AIEgens應(yīng)用于細(xì)菌成像檢測和細(xì)菌感染治療方面取得的進(jìn)展,現(xiàn)綜述如下。

1 AIEgens概述

1.1AIEgens的發(fā)光機(jī)制 熒光分子可通過發(fā)光發(fā)熱或分子物理運(yùn)動(dòng)等形式釋放吸收的能量。如早期的AIE原型分子四苯基乙烯(TPE),在稀溶液中,TPE分子四個(gè)苯環(huán)通過自由旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)消耗能量,不發(fā)射熒光;當(dāng)分子在聚集狀態(tài)時(shí),苯環(huán)的自由旋轉(zhuǎn)空間受限,其分子高度扭曲的構(gòu)型阻礙了分子間π-π相互作用,導(dǎo)致其熒光發(fā)射增強(qiáng),稱為分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限(RIR)[3];另一類AIE分子內(nèi)結(jié)構(gòu)可通過以某一部分為軸而振動(dòng)來消耗能量;由于聚集,分子內(nèi)自由震動(dòng)空間受限,激活發(fā)光分子,稱之為分子內(nèi)振動(dòng)受限( RIV)。RIR和RIV均屬于分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受限(RIM)[4]。到目前為止,RIM被公認(rèn)為是解釋AIE現(xiàn)象的主要機(jī)制[5]。

1.2AIEgens材料性能特點(diǎn) AIEgens作為新型熒光材料,具有一系列獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),包括易制備、靈敏度高、背景低、聚集態(tài)發(fā)光效率高、光穩(wěn)定性好、斯托克斯位移大等[6]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),AIEgens通過表面可修飾結(jié)構(gòu)與光敏劑(PSs)、抗菌肽(AMPs)等多平臺(tái)結(jié)合來合成具有多功能的AIE探針,以便捷高效的方式實(shí)現(xiàn)了AIEgens生物體應(yīng)用轉(zhuǎn)化,且合成探針均一性好,穩(wěn)定性高,具有較高的可重復(fù)性及實(shí)用性[7]。在滿足生物安全性及優(yōu)異性能的前提下有利于建立多功能的生物成像、診斷和治療系統(tǒng),使AIEgens成為有前景和可靠的光學(xué)平臺(tái)[8]。

2 AIEgens用于細(xì)菌檢測

2.1AIEgens用于細(xì)菌成像檢測 AIEgens具有優(yōu)良的光物理性能,根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞膜不同的結(jié)構(gòu),受調(diào)控的AIEgens可以選擇性地點(diǎn)亮細(xì)菌,且不需要洗滌步驟[9],通過熒光信號(hào)可以有效地實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的分類和鑒別,熒光定量檢測結(jié)果可動(dòng)態(tài)反映細(xì)菌濃度的變化,特別適用于細(xì)菌的熒光成像檢測。ZHAO等[10]基于TPE開發(fā)了一種帶正電荷的新型AIE分子材料(TPE-Py-Br),帶正電荷的TPE-Py-Br和帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜之間的靜電相互作用在細(xì)菌成像過程中起著關(guān)鍵作用。研究人員分別將革蘭陽性菌表皮葡萄球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌在10-6mol/L濃度的TPE-Py-Br溶液中染色10 min,由于其AIE特性,溶液中分散的TPE-Py-Br分子保持不發(fā)光,TPE-Py-Br通過靜電力驅(qū)動(dòng)與細(xì)菌膜結(jié)合形成局部聚集,激發(fā)出熒光,點(diǎn)亮細(xì)菌,兩種細(xì)菌均能清晰成像,實(shí)現(xiàn)細(xì)菌熒光成像檢測[10]。TPE-Py-Br和表皮葡萄球菌混合溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度比單獨(dú)的TPE-Py-Br溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度強(qiáng)15倍。即使在沒有洗滌過程的情況下,背景熒光非常低,發(fā)光效率高,避免了洗滌過程中的細(xì)菌丟失,簡化了成像步驟,提高了通過熒光強(qiáng)度來量化細(xì)菌濃度的準(zhǔn)確性。熒光開啟細(xì)菌可視化,利用AIEgens能與多種細(xì)菌結(jié)合引起聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng),其熒光強(qiáng)度與細(xì)菌量呈正比,高效的成像模式具有更高準(zhǔn)確性和大線性關(guān)系區(qū)域的特點(diǎn)使AIEgens能夠進(jìn)行高通量抗菌藥物篩選應(yīng)用,為建立一種新型快速的細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法提供了基礎(chǔ)。

2.2AIEgens用于細(xì)菌活性辨別 為辨別活細(xì)菌或死亡細(xì)菌,有研究者開發(fā)了3種AIE活性分子,即TPE-2BA、TriPE-3BA和TPE-4BA,TPE-2BA是一種能與雙鏈DNA凹槽結(jié)合的DNA染色劑,只有通過死亡細(xì)菌受損的細(xì)胞膜才能接觸到雙鏈DNA與其凹槽結(jié)合聚集激發(fā)出熒光[11]。因此,TPE-2BA 可以選擇性地對死亡的細(xì)菌(包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)進(jìn)行染色,只對死亡細(xì)菌顯示其AIE特性。TriPE-3BA和TPE-4BA的苯環(huán)通過與靜電作用,與細(xì)菌細(xì)胞膜羥基結(jié)合聚集,導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)受到限制,激發(fā)熒光,因此TriPE-3BA和TPE-4BA都可用于活菌染色[11]。

2.3AIEgens用于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的辨別 革蘭陽性菌引起的感染具有高發(fā)病率和病死率特點(diǎn),對公眾健康造成較大威脅。為快速區(qū)分出革蘭陽性菌,便于指導(dǎo)臨床進(jìn)行早期用藥,HU等[12]基于前期工作設(shè)計(jì)并合成了一種含嗎啉和萘基的AIEgens分子,即2-{[(二苯基亞甲基)腙]甲基}萘(M1-DPAN),其中嗎啉基團(tuán)在選擇性識(shí)別革蘭陽性菌方面發(fā)揮了重要作用,通過改變微生物細(xì)胞壁之間的相互作用,聚集到革蘭陽性菌細(xì)胞壁表面,發(fā)出強(qiáng)熒光。當(dāng)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和白色念珠菌3種細(xì)菌同時(shí)與M1-DPAN作用20 min后,M1-DPAN在革蘭陰性菌和白色念珠菌的存在下也能選擇性地結(jié)合革蘭陽性菌,只在革蘭陽性菌上觀察到熒光反應(yīng),能很好地區(qū)分革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及白色念珠菌;在與金黃色葡萄球菌孵育后,M1-DPAN發(fā)射的熒光信號(hào)強(qiáng)且可以持續(xù)24 h,這有利于長時(shí)間動(dòng)態(tài)可視化監(jiān)測感染過程。ZHAO等[13]也合成了新型納米工程肽接枝超支化聚合物(NPGHPs),該AIE探針能對多種細(xì)菌,尤其是革蘭陰性菌有高效抗菌活性,其熒光強(qiáng)度與細(xì)菌量呈正比,并建立了大腸埃希菌濃度監(jiān)測方法,檢出限達(dá)1×104cfu/mL,此外,AIE 探針NPGHPs對細(xì)菌的選擇性優(yōu)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

2.4AIEgens對特定細(xì)菌的選擇性成像檢測 基于前期建立了各種細(xì)菌成像和檢測方法[14],AIEgens也可被設(shè)計(jì)成高通量傳感器陣列,用于快速準(zhǔn)確地檢測細(xì)菌。ZHOU等[15]通過在四苯基乙烯上以烷氧基鏈為連接基團(tuán)引入帶有明顯疏水性差異的季銨鹽,得到7種具有精確調(diào)節(jié)親疏水性的AIE分子四苯基乙烯衍生物(TPE-AR),構(gòu)建了一系列基于TPE-AR的傳感器陣列來高通量地檢測和鑒別病原體。所檢測的7種微生物包括革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、耐青霉素的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌)、革蘭陰性菌(大腸埃希菌、耐氨芐西林大腸埃希菌和銅綠假單胞菌)及白色念珠菌。由于這些不同親疏水性的TPE-AR分子與病原菌間產(chǎn)生不同的多價(jià)相互作用,導(dǎo)致多樣的聚集行為,每種病原菌都呈現(xiàn)出不同特征的熒光信號(hào),每個(gè)傳感器陣列都可以對不同的病原菌提供特征的熒光響應(yīng)圖譜,通過線性判別分析病原菌的熒光模式,實(shí)現(xiàn)對7種病原菌的有效鑒定,該傳感器陣列也同樣適用于檢測病原菌混合物,具有快速(約0.5 h)識(shí)別、操作簡單、高通量和免洗等優(yōu)點(diǎn),有望用于高通量的細(xì)菌藥敏試驗(yàn),具有為臨床提供及時(shí)、可靠的病原菌篩查和藥敏試驗(yàn)結(jié)果的巨大潛力。

3 AIEgens用于細(xì)菌感染治療

細(xì)菌感染是人類健康的重大威脅之一,抗菌藥物的過度使用導(dǎo)致了耐藥菌株出現(xiàn)和傳播,已成為人類面臨的嚴(yán)重健康問題[16]。因此,迫切需要研發(fā)新的抗菌方法來對抗細(xì)菌感染。本研究總結(jié)幾種基于AIEgens的圖像引導(dǎo)診療系統(tǒng)。

3.1AIEgens用于光動(dòng)力治療(PDT)抗菌 PDT是一種利用特定波長的光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生細(xì)胞毒性自由基和活性氧(ROS)以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌感染治療的方法[17],由于其非侵入性和高時(shí)空選擇性的特點(diǎn),具有抗菌效率高和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢。PDT已經(jīng)在腫瘤和細(xì)菌感染等疾病治療方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[18]。基于AIEgens平臺(tái)搭載光敏劑(PSs),具有強(qiáng)光敏性的AIE-PSs在有效消除多重耐藥細(xì)菌方面表現(xiàn)出良好的性能[19],相對于傳統(tǒng)熒光材料,其不受 ACQ效應(yīng)制約,具有更好的PDT效果。KANG等[20]報(bào)道了一種帶正電荷的近紅外(NIR)光動(dòng)力治療探針(TTPy),由于更加小的單線態(tài)-三線態(tài)能量差,在白光的照射下能高效率地產(chǎn)生ROS,體外試驗(yàn)表明TTPy可通過PDT有效殺滅金黃色葡萄球菌;體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步地驗(yàn)證了 TTPy 在光照下能夠明顯抑制金黃色葡萄球菌引起的小鼠傷口感染,試驗(yàn)證明TTPy可選擇性染色并顯示出對革蘭陽性菌的有效光動(dòng)力學(xué)殺滅效果。此外,LEE等[21]進(jìn)一步開發(fā)了一種能快速區(qū)分革蘭陽性菌和高效光動(dòng)力殺滅細(xì)菌的水溶性NIR AIEgens(TTVP),TTVP 僅孵育 3 s 就能對金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)特異性的免洗成像,隨著孵育時(shí)間(約5 min)延長,大腸埃希菌逐漸被染色。因此,通過控制孵育時(shí)間,該探針能夠超快速地區(qū)分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的混合樣品。TTVP 在白光照射下能夠更高效地產(chǎn)生ROS,金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌與TTVP一起孵育的存活率極低;TTVP 燈照組顯示出最佳的傷口愈合效果,體外試驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)都證實(shí)了 TTVP有良好的光動(dòng)力殺滅細(xì)菌的特性[21]。探索具有AIE特性的PDT系統(tǒng)對研發(fā)新型抗菌材料有非常重要的指導(dǎo)意義。

3.2AIEgens用于對抗多重耐藥菌 在耐藥菌的抗菌光敏劑設(shè)計(jì)方面,萬古霉素常用于治療革蘭陽性菌引起的嚴(yán)重感染[22],尤其是對其他抗菌藥物耐藥的耐甲氧西林菌株。有研究者通過AIE修飾萬古霉素,開發(fā)了一種多功能探針(AIE-2Van)用于革蘭陽性菌的PDT,在光照射下,AIE-2Van產(chǎn)生ROS并通過PDT過程選擇性地殺滅革蘭陽性菌[23]。與萬古霉素相比,AIE-2Van對耐萬古霉素腸球菌(VRE)菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性,最小抑菌濃度(MIC)為34.9 mmol/L,提示AIE-2Van對耐藥菌株的殺傷能力在本質(zhì)上是通過ROS的產(chǎn)生得到提升的[23]。另有研究報(bào)道了一種基于AIEgens的細(xì)菌膜嵌入式光敏劑(TBD-anchor),得益于其本身AIE特征的單線態(tài)氧發(fā)生單元和靶向細(xì)菌膜的三季銨鹽,該光敏劑在水溶液里面具有高效的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率與特異靶向細(xì)菌膜的功能,這有利于該光敏劑在白光光照下產(chǎn)生高效單線態(tài)氧而起到原位抗菌作用[24]。研究表明,TBD-anchor對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有非常高效的光動(dòng)力抗菌能力,且在小于5 μmol/L濃度下TBD-anchor對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)都具有超過99.9%的殺菌作用;在800 nmol/L濃度下,TBD-anchor經(jīng)10 min低劑量(25 mW/cm-2)的白光照射可以殺死99.8% MRSA[24]。這是首次報(bào)道基于AIE特征的光敏劑在低光強(qiáng)度下,在nmol級(jí)別濃度下依舊具有超強(qiáng)的多藥耐藥菌抗菌效果,為抗耐藥菌光敏劑的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新思路。

3.3AIEgens用于生物偶聯(lián)抗菌 生物偶聯(lián)是指兩種生物學(xué)上相關(guān)的分子通過共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián),這里具體是指將AIE化合物共價(jià)鍵合到生物相關(guān)分子上的技術(shù)。噬菌體(PAP)是專門感染和裂解細(xì)菌的病毒,與抗菌藥物相比更具有特異性,并對抗菌藥物耐藥菌株具有溶菌活性[25]。HE等[26]用帶PDT活性AIE分子TVP偶聯(lián)PAP合成(TVP-PAP),將靶向性、熒光成像和PDT效應(yīng)集成在一起,受益于PAP生物學(xué)特性,非靶向細(xì)菌和正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞不受TVP-PAP影響。TVP-PAP在體外試驗(yàn)中幾乎100%殺死了多重耐藥的銅綠假單胞菌,在體內(nèi)試驗(yàn)中加速了多重耐藥細(xì)菌感染傷口的愈合[26]。此外,抗菌肽 (AMPs) 是小型基因編碼的宿主防御蛋白,是哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分,提供針對感染的內(nèi)在防御,由于它們的廣譜活性和較低的細(xì)菌耐藥概率,它們已被作為有效的抗菌劑來治療細(xì)菌感染,特別是多重耐藥的細(xì)菌感染[27]。然而AMPs的殺菌機(jī)制仍不清楚,AIEgens和AMPs的偶聯(lián)設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)成像監(jiān)測它們與陰離子細(xì)菌胞膜表面的相互作用,以及由此導(dǎo)致的病原菌完整性的破壞。另有研究者構(gòu)建了具有正電荷表面和AIE特性的抗菌聚合物肽多糖(COS-AMP),COS-AMP具有廣譜抗菌性能,COS-AMP對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的MIC分別為241、334和233 mg/mL[28]。CHEN等[29]將抗菌肽HHC36和HBT結(jié)合在一起開發(fā)了一種具有AIE特性的抗菌肽 (AMP-2HBT),AIE活性探針能夠高密度標(biāo)記細(xì)菌膜,通過熒光成像,可實(shí)時(shí)監(jiān)測AMP的抗菌過程。在抗菌肽HHC36上修飾HBT分子以后,并沒有降低其抗菌活性。另外,透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡結(jié)果證明,HHC36通過在細(xì)菌細(xì)胞膜上的不斷聚集來破壞細(xì)菌膜完整性,從而實(shí)現(xiàn)有效殺滅細(xì)菌的目的。這些最新成果證明生物偶聯(lián)AIEgens能夠高效協(xié)同殺菌,在治療細(xì)菌感染方面具有良好的應(yīng)用前景。

4 小結(jié)及展望

通過AIEgens作為可修飾的多功能平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了AIEgens在細(xì)菌成像檢測和細(xì)菌感染治療方面的應(yīng)用。盡管在AIEgens基礎(chǔ)上對細(xì)菌的成像檢測和鑒別技術(shù)取得了較大進(jìn)展,但對特定細(xì)菌的基于AIEgens的特異性成像檢測并沒有實(shí)現(xiàn),例如AIEgens對結(jié)核分枝桿菌的特異性成像檢測,未來應(yīng)探索AIEgens在特定細(xì)菌中的應(yīng)用,以實(shí)現(xiàn)特異性的細(xì)菌成像。目前,AIEgens用于細(xì)菌治療研究集中于圖像引導(dǎo)的光動(dòng)力療法,由于其具有非侵入性、高時(shí)空精度和低耐藥性等特點(diǎn),是一個(gè)有前景的研究方向。然而細(xì)菌的檢測和治療性能主要由聚集的形成決定,目前基于AIEgens的細(xì)菌成像檢測技術(shù)的抗菌性能尚不能令人滿意,還需要進(jìn)一步研究AIEgens的相關(guān)結(jié)構(gòu),提高ROS生成率,優(yōu)化其在體內(nèi)的生物降解性和生物相容性,實(shí)現(xiàn)病原菌的特異性靶向,探索更多簡便、經(jīng)濟(jì)的方法來合成具有細(xì)菌檢測和抗菌劑協(xié)同效應(yīng)的診療一體化材料,發(fā)揮精準(zhǔn)抗菌的效果,促進(jìn)AIEgens在細(xì)菌檢測和抗菌劑開發(fā)方面應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。