張曉雪,張會敏,牛亞蒙,梁若鵬,韓麗萍

(鄭州大學附屬第一醫(yī)院 a.體檢科;b.婦科;c.肝膽胰外科,河南 鄭州 450052)

卵巢癌是全球女性因癌癥死亡的主要原因之一,其早期臨床表現(xiàn)有限,當患者就診時,疾病往往已經(jīng)進展到一定程度,且卵巢癌的復發(fā)率和化療耐藥性較高[1-2]。此外,卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的細胞和分子機制十分復雜,包括但不限于細胞異質(zhì)性、表觀遺傳調(diào)控和多個信號通路的串擾。因此,有必要進一步研究其潛在機制,為診斷、預后和靶向治療提供新的生物標志物。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路是調(diào)節(jié)細胞行為,如增殖、凋亡、遷移和分化的關(guān)鍵途徑。在癌癥中,TGF-β信號通路具有雙重作用,即在早期通過抑制促進細胞生長基因的表達和促進促凋亡基因的表達發(fā)揮抑癌作用[3],在晚期通過觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和與MAPKs串擾發(fā)揮促癌作用[4]。越來越多的研究聚焦到卵巢癌抗TGF-β療法。Trabedersen是TGF-β2的反義寡核苷酸,D’Cruz等[5]通過小鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中聯(lián)合使用Trabedersen和紫杉醇與單獨使用紫杉醇相比,降低了腫瘤負荷,并提高了總體生存率。LY2109761是一種影響TGF-β受體Ⅰ/Ⅱ激酶活性的小分子抑制劑,與順鉑聯(lián)合使用時,在卵巢癌小鼠模型中可降低耐藥性[6-7]。LY2157299是一種針對細胞膜TGF-β受體酪氨酸激酶功能的藥物,研究表明其可以減弱卵巢癌細胞系對TGF-β信號傳導的反應,并減少卵巢癌患者來源的異種移植模型中的腫瘤負荷和腹水形成[8]。A-83-01特異性靶向TGF-β受體Ⅰ,在OV2944-HM-1癌細胞系的同源小鼠模型中發(fā)現(xiàn),注射A-83-01能夠減少腫瘤播散,改善生存[9]。此外,有研究報道TGF-β信號參與結(jié)直腸癌[10]、乳腺癌[11]和肺癌[12]腫瘤微環(huán)境的重塑。因此,篩選TGF-β信號通路相關(guān)基因并研究其在癌癥中的作用有望指導癌癥患者的治療。隨著高通量測序和生物信息學的發(fā)展,可以利用公共數(shù)據(jù)庫對人類疾病進行更深入的挖掘。然而,TGF-β信號通路相關(guān)基因?qū)β殉舶╊A后和腫瘤微環(huán)境的影響尚不清楚。因此,本研究旨在鑒定新的TGF-β信號通路相關(guān)基因用于預測卵巢癌患者的預后,并探索它們在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中的作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

352例卵巢癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息下載于癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov),該群體作為訓練集;GSE13876數(shù)據(jù)集中415例卵巢癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息下載于基因表達集錦(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),該群體作為驗證集;121個TGF-β信號通路相關(guān)基因下載于分子標簽數(shù)據(jù)庫(the molecular signatures database,MSigDB)數(shù)據(jù)庫(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。

1.2 一致性聚類分析

基于TGF-β信號通路相關(guān)基因的表達,利用R包“Consensus Cluster Plus”對訓練集中的卵巢癌患者進行一致性聚類分析,使用累積分布函數(shù)和累積分布函數(shù)曲線下面積的相對變化確定聚類數(shù)量,使用主成分分析評估聚類的效果。同時,通過CIBERSORT算法計算卵巢癌患者的免疫細胞浸潤水平(記憶B細胞、初始B細胞、活化樹突狀細胞、靜息樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化肥大細胞、靜息肥大細胞、單核細胞、中性粒細胞、活化NK細胞、靜息NK細胞、漿細胞、活化CD4+記憶T細胞、靜息CD4+記憶T細胞、初始CD4+T細胞、CD8+T細胞、卵泡輔助性T細胞、γδT細胞、調(diào)節(jié)性T細胞),利用ESTIMATE算法計算卵巢癌患者的免疫評分、基質(zhì)評分、腫瘤純度評分,比較不同聚類間卵巢癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境是否存在差異。

1.3 預后基因的鑒定

利用R包“l(fā)imma”篩選不同聚類間的差異表達基因,篩選標準為假陽性率(false discovery rate,FDR)<0.01以及|log2FC|>0.585。利用單因素Cox回歸分析從差異表達基因中篩選與卵巢癌預后相關(guān)的基因,篩選標準為P<0.01。根據(jù)預后基因的表達量,將卵巢癌患者分為預后基因高表達組和低表達組,比較高、低表達組間卵巢癌患者的生存差異。

1.4 預后評分系統(tǒng)的建立

利用預后基因進行主成分分析,根據(jù)每個基因前2個主成分(PC1和PC2)的得分計算卵巢癌患者的預后評分。隨后根據(jù)評分中位數(shù)將卵巢癌患者分為高、低評分組,比較高、低評分組間卵巢癌患者的生存差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。此外,將預后評分和臨床特征納入多因素Cox回歸分析,檢測預后評分是否為卵巢癌的獨立預后因素。

1.5 預后評分在卵巢癌中的作用

(1)比較不同亞型、有/無淋巴浸潤以及不同腫瘤殘余病分組之間的預后評分。(2)比較預后評分低分組和高分組之間的免疫、基質(zhì)、估計評分和腫瘤純度。(3)比較預后評分低分組和高分組之間免疫檢查點的表達。(4)通過CIBERSORT算法比較預后評分低分組和高分組的免疫細胞浸潤。(5)進行基因富集分析以探索預后評分低分組與高分組富集的生物功能。(6)通過單樣本基因富集分析計算標志性基因集的歸一化富集分數(shù)(normalize enrichment score,NES),并對每個標志性基因集的富集分數(shù)與預后評分進行Spearman相關(guān)性分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用R軟件(4.1.2版本)進行分析。兩組間比較用Wilcoxon檢驗,多組間比較用Kruskal-Wallis檢驗,采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗比較生存率,采用Fisher精確概率法比較不同組之間的臨床特征。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同聚類下的卵巢癌患者具有不同的免疫微環(huán)境

富集分析結(jié)果顯示,TGF-β信號通路富集在Ⅲ/Ⅳ期 (圖1A、B)。累積分布函數(shù)曲線和曲線下面積的相對變化結(jié)果表明,在聚類數(shù)量K值為2時累積分布函數(shù)的曲線最為穩(wěn)定(圖1C),且曲線下面積的相對變化較小(圖1D),此外在K值為2時,一致性矩陣邊緣清晰(圖1E),因此2為一致性聚類分析的最佳K值。根據(jù)上述結(jié)果,卵巢癌患者被劃分為兩組(組1和組2),主成分分析結(jié)果進一步表明TGF-β信號通路相關(guān)基因的表達可將組1和組2的樣本分成2類(圖1F)。兩組間前50個差異表達的TGF- β信號通路相關(guān)基因見圖2A。此外,兩組卵巢癌患者的腫瘤分期(Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ)、腫瘤殘余病(無肉眼病變、1～10 mm、11～20 mm、>20 mm)和亞型(間充質(zhì)型、增殖型、免疫反應型、分化型)的分布差異有統(tǒng)計學意義(圖2A)。Kaplan-Meier曲線結(jié)果顯示,組1生存率高于組2(圖2B)。組1的免疫、基質(zhì)和估計評分低于組2,但腫瘤純度評分高于組2(圖2C)。CIBERSORT結(jié)果顯示兩組間靜息樹突狀細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化肥大細胞、中性粒細胞、活化NK細胞、活化CD4+T細胞、靜息記憶CD4+T淋巴細胞、CD8+T細胞,卵泡輔助T細胞的水平差異有統(tǒng)計學意義(圖2D)。兩組間的免疫相關(guān)信號通路,例如炎癥應答、IL6-JAK-STAT3信號通路、PI3K-AKT-mTOR信號通路以及細胞行為相關(guān)標志,例如EMT、細胞凋亡、有絲分裂紡錘體在兩組間的富集程度差異有統(tǒng)計學意義(圖2E)。

A為TGF-β信號通路基因集在不同腫瘤分化程度中的GSEA分析結(jié)果;B為TGF-β信號標志基因集在不同腫瘤分化程度中的GSEA分析結(jié)果;C為聚類數(shù)量(K)為2、3、4、5時的累積分布函數(shù)曲線;D為聚類數(shù)量(K)為2～5時累積分布函數(shù)曲線下面積的相對變化;E為聚類數(shù)量(K)為2時的一致性矩陣;F為聚類數(shù)量(K)為2時的主成分分析散點圖,其中綠色圓點為組1,橙色圓點為組2。

A為組1和組2患者的臨床特征分布熱圖及兩組差異表達前50的TGF-β相關(guān)基因的表達熱圖;B為K-M曲線比較組1和組2患者的生存差異;C為組1和組2的估計、免疫、基質(zhì)和腫瘤純度評分;D為組1和組2中免疫細胞的浸潤水平;E為組1和組2間差異富集的信號通路熱圖;nsP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

2.2 卵巢癌中TGF-β信號通路相關(guān)預后基因的鑒定

差異表達和功能富集分析結(jié)果顯示,兩組間的差異表達基因主要富集于細胞外基質(zhì)相關(guān)的生物學過程和通路中,例如細胞外基質(zhì)-受體互作、細胞外基質(zhì)構(gòu)成、PI3K-AKT通路等(圖3)。進一步通過單因素Cox回歸分析,篩選得到10個與卵巢癌患者預后相關(guān)的基因,即GMPR、PIEZO1、EMP1、CXCL13、GADD45B、SORCS2、FOSL2、PODN、LYNX1和SLC38A5(圖4A)。Kaplan-Meier生存曲線顯示高GMPR和高CXCL13表達組卵巢癌患者的生存率高于低GMPR和低CXCL13表達組,而低PIEZO1/EMP1/GADD45B/SORCS2/FOSL2/PODN/LYNX1/SLC38A5表達組卵巢癌患者的生存率高于高PIEZO1/EMP1/GADD45B/SORCS2/FOSL2/PODN/LYNX1/SLC38A5表達組(圖4B)。

圖3 組1和組2差異表達基因的功能富集分析

2.3 預后評分的多因素分析

根據(jù)預后基因計算每個卵巢癌患者的預后評分,將卵巢癌患者分為高評分組和低評分組,Kaplan-Meier生存曲線顯示訓練集和驗證集中高評分組患者的生存高于低評分組(圖5A、B)。多因素Cox回歸分析表明在訓練集和驗證集中預后評分均是獨立預后因素(圖5C、D)。為了探討TGF-β信號通路預后評分影響卵巢癌患者預后的機制,本研究首先分析了預后評分與卵巢癌臨床特征之間的關(guān)系,結(jié)果顯示無肉眼可見疾病和無淋巴浸潤的患者得分較高(圖5E、F)。此外,不同TCGA亞型的患者得分不同,其中增殖亞型得分最高,間充質(zhì)亞型得分最低(圖5G)。

A為Kaplan-Meier曲線分析訓練集中高、低預后評分組的生存差異,其中紅色曲線為高評分組,藍色曲線為低評分組;B為Kaplan-Meier曲線分析驗證集中高、低預后評分組的生存差異,其中紅色曲線為高評分組,藍色曲線為低評分組;C為訓練集中預后評分和臨床性狀的多因素Cox回歸分析;D為驗證集中預后評分和臨床性狀的多因素Cox回歸分析;E為不同腫瘤殘余病間的預后評分;F為有/無淋巴浸潤組間的預后評分;G為不同卵巢癌亞型間的預后評分。

2.4 預后評分與卵巢癌進展和微環(huán)境的關(guān)系

富集結(jié)果顯示,免疫相關(guān)通路(趨化因子信號通路、PI3L-Akt信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路)(圖6A)和生物學過程(細胞對趨化因子的反應、白細胞遷移、對趨化素的反應、T細胞遷移)在預后評分低分組中顯著富集(圖6B)。此外,預后評分低分組和高分組之間的腫瘤免疫環(huán)境并不相同,具體表現(xiàn)為低分組的估計、免疫、基質(zhì)評分較高,腫瘤純度較低(圖6C)。并且7種免疫細胞(活化和靜息樹突狀細胞、靜息和活化肥大細胞、中性粒細胞、活化NK細胞、卵泡輔助T細胞)的比率也存在差異(圖6D)。在預后評分與腫瘤標志物相關(guān)性分析中,預后評分與NF-κB(r=-0.54)、缺氧(r=0.62)、TGF-β信號(r=-0.60)、凋亡(r=-0.54)、肌肉生成(r=-1.54)、心尖連接(r=0.74)、心尖表面(r=-0.64)、EMT(r=0.70)、p53通路(r=-0.53)、紫外線反應下調(diào)(r=-0.59)、血管生成(r=0.66)、凝血(r=0.60)、IL2/STAT5信號傳導(r=0.54)、KRAS信號傳導上調(diào)(r=0.65)相關(guān)(圖6E)。15個免疫檢查點(ADORA2A、CD160、CD200R1、CD276、CTLA4、HAVCR2、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LAIR1、PDCD1、SIRPA、TDO2、TIGIT)的表達在預后評分低分組和高分組間也存在差異(圖6F)。

A為KEGG信號通路基因集在高、低評分組中的GSEA分析結(jié)果;B為GO-BP基因集在高、低評分組中的GSEA分析結(jié)果;C為高、低預后評分組的估計、免疫、基質(zhì)和腫瘤純度評分;D為高、低預后評分組免疫細胞的浸潤水平;E為預后評分與癌癥標志物相關(guān)性的熱圖;F為高、低預后評分組免疫檢查點分子表達,其中nsP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

3 討論

TGF-β信號通路在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色,但TGF-β信號通路相關(guān)基因在卵巢癌中的預后價值尚不清楚。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌患者測序數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)同Ⅰ/Ⅱ期患者相比,TGF-β信號通路基因集顯著富集到Ⅲ/Ⅳ期患者中,表明TGF-β信號通路相關(guān)基因與卵巢癌的進展密切相關(guān)。隨后,本研究進一步分析了TGF-β信號通路相關(guān)基因在卵巢癌中的作用:根據(jù)TGF-β信號通路相關(guān)基因可以將卵巢癌患者分為兩組,這兩組患者具有不同的生存期和免疫微環(huán)境,表明TGF-β信號通路相關(guān)基因在卵巢癌的分子病理中起著重要作用。此外,兩組之間的差異表達基因富集到細胞外基質(zhì)相關(guān)的生物功能中,表明TGF-β信號通路相關(guān)基因可能通過細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)卵巢癌的進展。

通過單變量Cox回歸分析,本研究從差異表達基因中選擇GMPR、PIEZO1、EMP1、CXCL13、GADD45B、SORCS2、FOSL2、PODN、LYNX1和SLC38A5作為卵巢癌的預后生物標志物。其中,預后基因GMPR和CXCL13是保護因子,PIEZO1、EMP1、GADD45B、SORCS2、FOSL2、PODN、LYNX1和SLC38A5是風險因子。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果進一步證實了這一點,即GMPR和CXCL13高表達組患者的生存率高于低表達組,而PIEZO1、EMP1、GADD45B、SORCS2、FOSL2、PODN、LYNX1和SLC38A5高表達組的生存率低于低表達組。GMPR是一種催化GMP脫氨基為IMP并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)堿基平衡的酶[13]。據(jù)報道,GMPR的過表達可促進HL-60白血病細胞的分化[14],并介導MITF基因?qū)谏亓黾毎忠u的抑制作用[15]。PIEZO1編碼一種受機械力激活的離子通道。在肝細胞癌中,它通過激活TGF-β信號通路在體外和體內(nèi)促進EMT[16]。敲低PIEZO1降低了卵巢癌的生長速度,并通過Hippo/YAP信號削弱了肺轉(zhuǎn)移[17]。據(jù)報道,EMP1是一種膜蛋白,它通過增加MAPK的表達來調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的侵襲和增殖[18]。CXCL13是腫瘤免疫微環(huán)境中的一種重要趨化因子[19],TGF-β可誘導其在免疫細胞中的表達[20]。CXCL13由于在形成免疫激活腫瘤微環(huán)境[21]和T細胞治療[22]方面的功能,在卵巢癌治療中很有前景。GADD45B調(diào)節(jié)細胞對TGF-β的應答[23],卵巢癌細胞系中GADD45B的過表達促進了細胞遷移[24]。FOSL2是AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族的一員,其表達受TGF-β調(diào)節(jié),它主要通過與SMAD3互作通過TGF-β信號通路誘導細胞遷移[25]。此外,在卵巢癌中,FOSL2不僅調(diào)節(jié)細胞凋亡[26],還調(diào)節(jié)順鉑耐藥性[27]。在骨肉瘤細胞中過表達PODN會削弱TGF-β信號通路,進而抑制細胞的增殖、侵襲和遷移[28]。

本研究基于預后基因的表達計算了預后評分,并在2個獨立的卵巢癌隊列中構(gòu)建了一個模型,發(fā)現(xiàn)該評分與卵巢癌的預后相關(guān),并且通過多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)該預后評分是卵巢癌的獨立預后因素,并且該預后評分與卵巢癌的亞型、淋巴浸潤、殘余病以及標志物密切相關(guān)。通過比較預后評分低分組和高分組的特征,發(fā)現(xiàn)該預后評分與卵巢癌的進展密切相關(guān),并且可通過多種免疫途徑調(diào)節(jié)卵巢癌。此外,預后評分低分組和高分組的免疫微環(huán)境,包括免疫細胞的浸潤比率和免疫檢查點的表達均存在差異,這表明所選預后基因在卵巢癌腫瘤微環(huán)境重塑中的潛在作用。腫瘤微環(huán)境顯著影響卵巢癌患者的免疫治療,并最終影響卵巢癌患者的預后。因此,推測上述預后基因可能還通過調(diào)控卵巢癌患者對免疫治療的應答影響卵巢癌患者的預后。

上述結(jié)果表明GMPR、PIEZO1、EMP1、CXCL13、GADD45B、SORCS2、FOSL2、PODN、LYNX1和SLC38A5在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要功能,靶向這些預后基因的小分子化合物可能是治療卵巢癌的候選藥物。Liu等[29]通過CMap數(shù)據(jù)庫預測到小分子藥物呋喃唑酮和利福平可靶向GMPR。ZY0511能夠通過誘導GADD45B基因啟動子區(qū)H3K4甲基化進而靶向調(diào)控GADD45B基因的表達,并抑制肝癌細胞的增殖[30]。Sennoune等[31]發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺通過阻斷SLC38A5介導的大型胞飲作用誘導癌細胞營養(yǎng)匱乏。然而,上述藥物能否用于卵巢癌的治療仍需大量的動物實驗和臨床試驗進行驗證。

本研究具有一定的局限性。首先,篩選出的預后基因需要進一步在臨床中檢驗其預測效果;其次,它們是否能夠作為卵巢癌治療的靶點仍需長期的動物實驗和臨床試驗;更重要的是,需要進行體內(nèi)和體外實驗闡明每個預后基因調(diào)控卵巢癌免疫微環(huán)境的具體分子機制以及在卵巢癌中它們是如何與TGF-β信號通路串擾發(fā)揮作用的。

4 結(jié)論

本研究在卵巢癌中鑒定了新的TGF-β信號通路相關(guān)預后基因,構(gòu)建了一個與卵巢癌預后相關(guān)的新的TGF-β信號通路相關(guān)評分,并探討了TGF-β信號調(diào)控卵巢癌的潛在機制,這些發(fā)現(xiàn)可能為卵巢癌患者的治療提供有價值的信息。