任高雅，范小瑞，張警文，張欣榮，賀俊平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

臨床上常使用白消安治療淋巴瘤、卵巢癌、兒童和成人慢性骨髓性白血病[1-2]，其治療效果很好，但對(duì)生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重的副作用[3]：它可以黏附在DNA鏈上抑制細(xì)胞分裂[4]，具有高分裂活性的器官、組織和細(xì)胞如睪丸、生殖細(xì)胞等更容易受到白消安毒性的影響[5]。有研究報(bào)道，體外分離培養(yǎng)的睪丸曲精小管細(xì)胞可用于藥物毒性篩選[4]，但目前對(duì)白消安的體外毒性尚未見(jiàn)報(bào)道。在體外分離培養(yǎng)曲精小管細(xì)胞的方法在大鼠和小鼠中已有研究報(bào)道[1-2]。人類體外試驗(yàn)的理想動(dòng)物模型是豬，因豬的基因組和器官大小與人類十分相似。但由于豬物種自身結(jié)構(gòu)的特殊性，間質(zhì)和曲精小管連接緊密，實(shí)際操作中難以分離，研究常見(jiàn)的是曲精小管易于分離的鼠，而關(guān)于豬曲精小管分離培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)嘗試找到分離豬曲精小管的方法并用于白消安生殖毒性研究。

PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）是DNA復(fù)制過(guò)程中必不可少的輔助因子[6]，可用于檢測(cè)細(xì)胞增殖[7]。PLZF（早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白）是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，調(diào)節(jié)未分化精原細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)[8]，并直接參與精原干細(xì)胞庫(kù)的自我更新和維護(hù)[9]。缺乏PLZF的小鼠表現(xiàn)為曲精小管內(nèi)精原細(xì)胞的漸進(jìn)性缺乏和精子發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致不孕[9-12]。GATA-4（含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在睪丸支持細(xì)胞成熟和睪丸發(fā)育中至關(guān)重要，表達(dá)于睪丸體細(xì)胞，尤其是睪丸支持細(xì)胞[13-14]。

白消安可影響雄性動(dòng)物精子發(fā)生[15]，但分子機(jī)制尚不清楚。白消安是否影響豬睪丸曲精小管增殖和分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致精子發(fā)生受損尚無(wú)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)增殖相關(guān)蛋白PCNA和分化相關(guān)蛋白PLZF在白消安作用下仔豬睪丸曲精小管中的表達(dá)變化進(jìn)行研究，旨在初步探索白消安對(duì)豬精子發(fā)生、增殖和分化的損傷調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 于山西省晉中市太谷區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集杜長(zhǎng)大三元雜交（1月齡）仔豬睪丸組織，保存于PBS緩沖液，運(yùn)輸至細(xì)胞房。在無(wú)菌環(huán)境下將組織剪碎，采用組合酶（DNaseⅠ和胰酶）4 °C過(guò)夜消化。次日收集曲精小管細(xì)胞置于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)1、2、3 d。將部分曲精小管組織置于Bouin氏固定液中，4 °C過(guò)夜，準(zhǔn)備進(jìn)行免疫組化分析；另一部分投入液氮中速凍，用于提取總RNA和蛋白。

1.1.2 主要儀器和試劑 1×PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素、去DNase/RNase水、PBS購(gòu)自索萊寶生物公司，DNaseⅠ購(gòu)自Sigma，DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclong，胎牛血清購(gòu)自Gibco，白消安購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，多克隆兔抗PCNA（bs-2007R）、多克隆兔抗PLZF（bs-5971R）購(gòu)自博奧森，多克隆兔抗GATA4（ab84593）購(gòu)自Abcam，單克隆鼠抗GAPDH（60004-1-Ig）購(gòu)自武漢三鷹。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、核酸染料購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司，DNA Ladder購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影粉、定影粉購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。用去DNase/RNase水配制5 mg/mL的白消安溶液，4 °C冷藏備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 曲精小管的分離培養(yǎng) 將睪丸組織放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，去除附睪和睪丸被膜，剪成約2 mm的均勻小塊，放入PBS溶液內(nèi)。將睪丸組織塊溶液、DNaseⅠ和胰酶按照4∶2∶1的比例混勻，4 °C過(guò)夜，顯微鏡下觀察到組織塊消化出均勻整齊的曲精小管后，立即加入等量終止液終止消化；去除未消化組織塊，加入Tris HCl低滲處理，收集曲精小管，鋪板培養(yǎng)，分成2組，一組為對(duì)照組（不處理），另一組為試驗(yàn)組（滴加50 μL白消安液），37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 石蠟切片及HE染色 將固定好的睪丸曲精小管組織梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋制作切片，切片厚度為4 μm。HE染色流程：切片經(jīng)二甲苯脫蠟15 min 2次后梯度酒精水化（100%酒精浸泡3 min重復(fù)2次、95%酒精浸泡3 min重復(fù)2次、90%酒精浸泡3 min、80%酒精浸泡2 min、70%酒精浸泡2 min、蘇木精浸泡5 min、自來(lái)水沖洗一次、蒸餾水搖床上清洗2 min重復(fù)2次）后再經(jīng)梯度酒精脫水（70%酒精浸泡2 min、80%酒精浸泡2 min、90%酒精浸泡3 min），伊紅染色10 s后95%酒精浸泡3 min重復(fù)2次、100%酒精浸泡3 min重復(fù)2次，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精水化，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加PBS-T，室溫孵育15 min后，PBS沖洗3次，每次3 min，置于熱檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中加熱15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加一抗（多克隆兔抗PCNA∶BSA=1∶200，多克隆兔抗GATA4∶BSA=1∶300，多克隆兔抗PLZF∶BSA=1∶300），4 °C過(guò)夜孵育。次日搖床復(fù)溫，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37 °C孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加DAB顯色，蒸餾水沖洗3次，每次2 min。隨后采用蘇木精染色，1%的鹽酸乙醇分化，1%濃氨水返藍(lán)，蒸餾水沖洗3次，每次2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后干燥，顯微鏡下拍照保存。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析PCNA、GATA4和PLZF免疫陽(yáng)性染色的吸光度。陰性對(duì)照切片一抗孵育過(guò)程使用血清代替。

1.2.4 曲精小管總RNA提取和qRT-PCR的擴(kuò)增 采用Trizol法提取總RNA并使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量鑒定，ND-1000（超微量分光光度計(jì)）測(cè)定濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程根據(jù)Vazyme試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。去除基因組DNA。反應(yīng)體系：4×g DNA wiper Mix 2 μL；總RNA 1 μg；加去RNA酶水至8 μL，42 °C孵育2 min。反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：取上面的反應(yīng)液8 μL加入5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 2 μL，37 °C 孵育15 min后，85 °C下反應(yīng)5 s。反轉(zhuǎn)錄后測(cè)定cDNA濃度并稀釋至100 ng/μL，-20 °C保存。qRT-PCR過(guò)程按照Vazyme公司定量試劑盒步驟進(jìn)行，使用18S rRNA作為內(nèi)參基因與目標(biāo)基因PCNA、GATA4和PLZF共同擴(kuò)增。

試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算PCNA、GATA4和PLZF在仔豬睪丸曲精小管中的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NCBI中公布的豬PCNA、GATA4和PLZF的mRNA序列，使用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物并送華大基因合成（表1）。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件Tab.1 Primer sequences and amplification conditions

1.2.5 曲精小管總蛋白提取和Western Blot分析收集曲精小管，放入0.5 mL白裂解液和5 μL PMSF的混合液中，冰上靜置30 min，離心10 min（4 °C，12 000 g）。取上清測(cè)定濃度，后采用1%SDS緩沖液稀釋至32 μL，加入3 μL蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，99 °C水浴變性10 min。配制蛋白質(zhì)濃縮膠和分離膠，分別加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)樣品，電泳獲得目標(biāo)條帶，轉(zhuǎn)膜后，室溫80 r/min封閉1 h。加入稀釋后的單克隆鼠抗GAPDH和多克隆兔抗PCNA、GATA4和PLZF（5%脫脂奶粉溶液分別稀釋2 000倍、300倍、800倍和300倍），垂直搖床4 °C過(guò)夜。次日取出復(fù)溫30 min，TBST孵育10 min，重復(fù)3次。加入山羊抗兔IgG（TBST稀釋18 000倍）和山羊抗鼠IgG（TBST稀釋15 000倍），80 r/min 37 °C孵育1 h，TBST 5 min，重復(fù)6次，ECL顯色，膠片曝光，Image J分析掃描膠片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬睪丸曲精小管對(duì)照組和白消安組的形態(tài)學(xué)差異

通過(guò)HE染色觀察對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化，結(jié)果顯示，培養(yǎng)1、2 d后，對(duì)照組曲精小管內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)高度濃縮的嗜酸性細(xì)胞，但睪丸支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞形態(tài)正常（圖1-A）；培養(yǎng)3 d后，可觀察到增大的嗜酸性細(xì)胞，但睪丸支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞模糊，不易辨別（圖1-C）。培養(yǎng)1～2 d后，白消安組支持細(xì)胞增大，生殖細(xì)胞數(shù)量減少，曲精小管內(nèi)出現(xiàn)空腔；培養(yǎng)3 d后，可觀察到增大的嗜酸性細(xì)胞。在對(duì)照組和白消安組中，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，管周肌樣細(xì)胞形態(tài)逐漸消失。

圖1 仔豬睪丸曲精小管對(duì)照組和白消安組的形態(tài)學(xué)差異Fig.1 Morphological differences in seminiferous tubules in testis of piglets between the control group and the buanlfan group

2.2 PCNA、PLZF和GATA4在正常組和白消安組的組織細(xì)胞學(xué)定位

免疫組化結(jié)果顯示，PCNA定位于支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的細(xì)胞核（圖2），對(duì)照組1、2、3 d蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000 2、1.000 7和1.000 9；白消安組1、2、3 d蛋白的表達(dá)量相對(duì)升高，分別為1.378 7、1.234 4和3.523 4，分別為對(duì)照組的1.38倍（P＜0.01）、1.23倍和3.52倍（圖3）。

圖2 PCNA在仔豬睪丸曲精小管對(duì)照組和白消安組的表達(dá)與定位Fig.2 Expression and localization of PCNA in seminiferous tubules in testis of piglets in the control group and the buanlfan group

圖3 培養(yǎng)1、2、3 d的對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管橫截面PCNA、PLZF和GATA4光密度值Fig.3 The optical density values of PCNA，PLZF，and GATA4 in seminiferous tubules in testis of piglets in the control group and the busulfan group cultured after 1，2，3 d

PLZF定位于生殖細(xì)胞的細(xì)胞核（圖4），對(duì)照組1、2、3 d蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.010 0、1.000 4和1.001 3；白消安組1、2 d蛋白的表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組下降，分別為0.864 3和0.226 3，3 d時(shí)白消安組蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.497 3，分別是對(duì)照組的0.85倍、0.22倍、1.50倍（圖3）。

GATA4定位于支持細(xì)胞的細(xì)胞核（圖5），對(duì)照組1、2、3 d蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.001 0、1.010 6和1.000 3；白消安組1、2、3 d蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高，分別為1.889 1、1.578 4和3.828 1，分別是對(duì)照組的1.89倍（P＜0.05）、1.56倍和3.81倍（P＜0.05）（圖3）。

2.3 PCNA、PLZF和GATA4mRNA在仔豬睪丸曲精小管中的表達(dá)差異

PCNA的qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組1、2、3 d mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.001 3、1.001 7、1.0022；白消安組1、2、3 d的mRNA相對(duì)表達(dá)量上升，分別為1.400 4、1.440 3和1.376 3，分別是對(duì)照組的1.39倍、1.44倍和1.37倍（圖6）。

PLZF的qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組1、2、3 d的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.001 5、1.003 2、1.000 5；白消安組1、2、3 d的mRNA相對(duì)表達(dá)量先降低后上升，分別為0.865 3、1.006 9和1.549 8，分別是對(duì)照組的0.86倍（P＜0.05）、1.01倍和1.55倍（P＜0.01）（圖6）。

GATA4的qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組1、2、3 d的 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.002 7、1.001 7、1.000 2；白消安組1、2、3 d mRNA的相對(duì)表達(dá)量上升，分別為1.158 4、1.429 6和6.902 1，分別是對(duì)照組的1.16倍、1.43倍和6.90倍（P＜0.01）（圖6）。

2.4 PCNA、PLZF和GATA4蛋白在仔豬睪丸曲精小管組織中的表達(dá)差異

PCNA、PLZF、GATA4和GAPDH蛋白在對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示。

圖7 PCNA、PLZF、GATA4和GAPDH蛋白在對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression levels of PCNA，PLZF，GATA4，and GAPDH proteins in seminiferous tubules in testis of piglets in the control group and the busulfan group

Western Blot結(jié)果顯示，對(duì)照組和試驗(yàn)組仔豬睪丸曲精小管總蛋白和多克隆兔抗PCNA、多克隆兔抗PLZF、多克隆兔抗GATA4及單克隆鼠抗GAPDH之間有特異性免疫反應(yīng)，分子質(zhì)量大小分別為29、74、44、37 ku（圖7-A、B）。對(duì)照組1、2、3 d，PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.605 0、0.859 3和0.381 8；白消安組1、2、3 d，PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高，分別為2.256 9、1.354 2和1.215 3，分別是對(duì)照組的1.41倍（P＜0.05）、1.57倍（P＜0.001）、3.18倍（P＜0.001）（圖7-C）。對(duì)照組1、2、3 d測(cè)得的PLZF蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.257 2、0.218 6和0.131 3；白消安組1、2 d，PLZF蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低，分別為0.198 5和0.207 7，3 d蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高為0.233 7，分別是對(duì)照組的0.77倍（P＜0.05）、0.95倍、1.78倍（P＜0.05）（圖7-C）。

3 結(jié)論與討論

本研究中，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曲精小管細(xì)胞形態(tài)在培養(yǎng)后發(fā)生變化，表現(xiàn)為睪丸支持細(xì)胞體積增大，生殖細(xì)胞體積略微縮小并伴隨數(shù)量的減少，管周肌樣細(xì)胞逐漸消失。OAKBERG等[16]在培養(yǎng)約30 d后觀察發(fā)現(xiàn)，曲精小管的管周肌樣細(xì)胞消失，管內(nèi)有活性的生殖細(xì)胞數(shù)量下降。這與本研究結(jié)果相似。

本研究中，用細(xì)胞增殖核抗原PCNA標(biāo)記細(xì)胞增殖，免疫組化結(jié)果顯示，PCNA表達(dá)于正常組和白消安組仔豬睪丸曲精小管內(nèi)生殖細(xì)胞的細(xì)胞核，這與CHANDRA等[17]的研究結(jié)果一致，同時(shí)本研究中PCNA也定位于支持細(xì)胞的細(xì)胞核，與CHAPMAN等[18]的研究結(jié)果一致，提示性成熟前，曲精小管內(nèi)有活性的支持細(xì)胞增殖活躍，支持細(xì)胞數(shù)量增加。本研究中，白消安組PCNAmRNA和蛋白的表達(dá)量大于對(duì)照組，提示當(dāng)睪丸遭受不良刺激時(shí)，支持細(xì)胞增殖速率增加，以抵御不良損傷。

本研究中，對(duì)照組和白消安組PLZF表達(dá)于曲精小管內(nèi)生殖細(xì)胞的細(xì)胞核，與SHARMA等[19]研究結(jié)果一致。培養(yǎng)1、2 d白消安組PLZFmRNA的表達(dá)低于正常組，這與白消安制造無(wú)精子癥模型[20]、消除生殖細(xì)胞的結(jié)果相一致。培養(yǎng)3 d白消安組PLZFmRNA的表達(dá)量高于正常組，與GUTIERREZ等[21]的研究結(jié)果一致，提示白消安導(dǎo)致雄性睪丸無(wú)精子癥，是持續(xù)給藥的結(jié)果，短期用藥后，生精能力有恢復(fù)的可能。

哺乳動(dòng)物的性腺發(fā)育離不開(kāi)轉(zhuǎn)錄因子GATA4的調(diào)控[22]。BIELINSKA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在胎兒發(fā)育過(guò)程中GATA4表達(dá)于支持細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞，出生后GATA4通常表達(dá)定位于睪丸的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞[24]。本研究結(jié)果顯示，在對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管中，GATA4蛋白主要定位于支持細(xì)胞的細(xì)胞核，與BIELINSKA等[23]的研究結(jié)果一致。HIRAYANAGI等[25]研究發(fā)現(xiàn)，使用40 mg/kg的白消安治療小鼠60 d后，小鼠體質(zhì)量降低，免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)曲精小管萎縮并且生精細(xì)胞變形、凋亡。白消安通過(guò)作用于生殖細(xì)胞來(lái)破壞精子發(fā)生[26]，長(zhǎng)期注射會(huì)出現(xiàn)性腺發(fā)育停滯和無(wú)精子癥[27]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，仔豬睪丸曲精小管的對(duì)照組和白消安組中，白消安組GATA4mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組，與羅小敏等[20]在白消安誘導(dǎo)小鼠無(wú)精子癥模型的研究結(jié)果相一致，提示白消安處理仔豬睪丸曲精小管導(dǎo)致支持細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量增加，為植入生殖細(xì)胞，恢復(fù)生精能力提供充足營(yíng)養(yǎng)和支持作用。

綜上所述，在本研究中，正常培養(yǎng)3 d后仔豬睪丸曲精小管內(nèi)的PCNAmRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低，提示該培養(yǎng)條件可以保持曲精小管的活性，但存活質(zhì)量不高，這可能與缺氧、浸泡時(shí)間長(zhǎng)等因素有關(guān)。PCNA、PLZF和GATA4在對(duì)照組和白消安組仔豬睪丸曲精小管內(nèi)均有表達(dá)，白消安導(dǎo)致增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)量增加，導(dǎo)致分化相關(guān)蛋白PLZF表達(dá)量先降低后增加，提示白消安通過(guò)影響增殖分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致豬睪丸精子發(fā)生受損。