趙艷芳，胡春艷，曹揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為無性態(tài)菌門絲孢綱鐮刀菌屬，由該菌引起的植物枯萎病是一種世界性土傳病害[1-2]。此類病原菌以兼性寄生為主，寄主范圍廣泛[3]，可引起瓜類、茄科、豆科等100多種植物枯萎病的發(fā)生，致作物在2～3 a內(nèi)大面積感染枯萎病[4]。被其所侵染的植物通常出現(xiàn)多器官及組織的腐爛，如根腐、花腐及穗腐等，嚴(yán)重危害作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。目前，植物枯萎病主要通過多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治[6]，但是長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染[7]。因此，尋找及研發(fā)替代化學(xué)農(nóng)藥的高效綠色產(chǎn)品成為近年來學(xué)者的研究熱點(diǎn)[8]，植物源農(nóng)藥因其具有對(duì)生態(tài)友好、可生物降解性、作用方式多樣等特點(diǎn)備受人們關(guān)注[9-10]。

丁子香（Syzygium aromaticum）又稱丁香，為桃金娘科蒲桃屬植物，在我國(guó)云南、海南等地多有種植，資源豐富[11]。研究表明，丁香提取物中主要的活性成分是丁子香酚[12]，丁香酚具有廣譜抗菌性，對(duì)金葡萄球菌等食源性病原菌[13]、禾谷鐮刀菌等植物病原真菌均有抑制作用[14]。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）又稱西北狼毒、斷腸草等，為瑞香科狼毒屬植物，其主要分布在我國(guó)的西北、西南、東北等地區(qū)。研究表明，瑞香狼毒在抑菌、消炎、祛痰、抗病毒、殺螨蟲、抗癌等方面有良好的生物活性，其主要化學(xué)成分包括香豆素類、黃酮類、萜類等六大類化合物[15]，在殺蟲、抗病毒等方面有特殊功效[16]。研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒根中香豆素的含量較高，具有良好的消炎、抑菌等作用[17]。

苦瓜以其清熱解涼、滋陰壯陽、降低血糖等獨(dú)特的藥理作用[18]，深受人們喜愛?？喙峡菸〉陌l(fā)生嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量與質(zhì)量，目前市場(chǎng)上銷售的對(duì)西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防治效果的農(nóng)藥及微生物制劑對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想[19]，因此，研究一種安全有效的防治苦瓜枯萎病措施十分必要。

本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定了丁香、八角、芫花、瑞香狼毒、羌活、結(jié)香等6種植物乙醇提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑菌效果，從中挑選出對(duì)苦瓜枯萎病抑制效果最好的丁香和瑞香狼毒2種植物提取物，并對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行了初探，旨在為進(jìn)一步開發(fā)植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物材料 丁香、瑞香狼毒、羌活、芫花、八角和結(jié)香等植物材料的信息如表1所示。

表1 供試植物材料名稱及組織Tab.1 Name and tissue of the plant materials for testing

1.1.2 供試菌種 苦瓜（尖孢鐮刀菌苦瓜?；停┛菸【‵usarium oxysporumf. sp.momordicae），由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文才藝教授提供。

1.1.3 主要儀器 氣引式粉碎機(jī)（佑崎有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），光照培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司），紫外分光光度計(jì)（島津有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備 將丁香、瑞香狼毒等各種植物材料磨成粉狀，將其與95%乙醇體積比為1∶2混合放置72 h進(jìn)行初步浸提，后在30 ℃條件下進(jìn)行30 min的超聲波振蕩提取，將浸提物放入真空抽濾裝置中進(jìn)行抽濾，收集到的液體即為植物的初提物，將抽濾出的固體物質(zhì)再次與乙醇混合，重復(fù)以上步驟4次，提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，并測(cè)定濃縮后提取液的提取率及質(zhì)量濃度，每種提取物進(jìn)行6次重復(fù)（表2）。

表2 供試植物提取物的提取率及質(zhì)量濃度Tab.2 Extraction rate and concentration of the plant extracts for testing

1.2.2 6種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定丁香、瑞香狼毒、八角等6種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑菌活性，將藥劑（無菌水稀釋）與培養(yǎng)基混合配制成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL質(zhì)量濃度的藥板，以加入等體積無菌水的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)5次。用0.7 cm的打孔器在培養(yǎng)6 d的目的菌株培養(yǎng)基上取菌餅，放在藥板中央，在28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h采用十字交叉法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)直徑，利用Excel軟件計(jì)算抑菌率、用SPSS 27.0軟件進(jìn)行毒力分析。

1.2.3 3種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響測(cè)定 將苦瓜枯萎病菌于PDB培養(yǎng)基中28 ℃恒溫、150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)3 d，菌液用2層滅菌紗布濾去菌絲，濾液于室溫下以4 500 r/min離心20 min，去上清液，制成1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。將孢子懸浮液與藥劑混合至藥物終質(zhì)量濃度分別為4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，滴于載玻片中在28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，當(dāng)空白對(duì)照萌發(fā)率高于85%時(shí)記錄孢子萌發(fā)數(shù)量，并進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 丁香、瑞香狼毒提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌酶活性測(cè)定 在無菌操作臺(tái)中，將丁香、瑞香狼毒提取物加入PDB培養(yǎng)基中，其中，丁香提取物的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，瑞香狼毒提取物的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，每25 mL接入一個(gè)苦瓜枯萎病菌菌餅，搖床設(shè)置為180 r/min，28 ℃，分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)取樣，常溫條件下8 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和菌液，放入-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。丙二醛（MDA）、丙酮酸（PA）和幾丁質(zhì)酶（CHT）使用北京Solarbio試劑盒（貨號(hào)分別為BC0020、BC2200、BC0825）進(jìn)行測(cè)定，可溶性蛋白（Pr）的測(cè)定參考張志良等[20]的方法進(jìn)行，測(cè)定菌體和菌液中的MDA、PA、Pr含量，測(cè)定菌體中的CHT活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel和SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，采用LSD法進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)（P＜0.5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果

6種植物提取物在4.0 mg/mL時(shí)對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果如表3所示，所有的植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌都有一定的抑制效果，丁香、瑞香狼毒、八角和結(jié)香提取物在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制率均達(dá)到了100%，羌活和芫花的抑制效果較差，但其抑菌率也大于50%。

表3 6種植物提取物4.0 mg/mL時(shí)對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果（120 h）Tab.3 Inhibition effect of 6 plant extracts at 4.0 mg/mL on the mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp. momordicae（120 h）

圖1為不同植物提取物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)苦瓜枯萎病菌菌落的抑制效果圖。由圖1可知，隨著植物提取物質(zhì)量濃度的降低，其抑制效果也逐漸下降。丁香提取物的抑制效果最好，其質(zhì)量濃度為4.0、2.0 mg/mL時(shí)，對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果均達(dá)到了100%；瑞香狼毒提取物次之，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，抑菌率達(dá)到了87.02%；在質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時(shí)，二者的抑菌率也在25%以上。八角和結(jié)香提取物在高質(zhì)量濃度時(shí)抑制效果較好，但在低質(zhì)量濃度時(shí)抑制效果較差，在質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時(shí)，抑菌率均在10%以下。

2.2 6種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的毒力

由表4可知，丁香提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果最好，EC50值為0.256 5 mg/mL；瑞香狼毒提取物效果次之，其EC50值為0.354 8 mg/mL；羌活和芫花提取物的抑制效果較差，其EC50值分別為1.885 5、2.378 0 mg/mL。

2.3 3種植物提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表5可知，丁香、瑞香狼毒和結(jié)香3種植物提取物處理后對(duì)苦瓜枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)都有一定的抑制作用；在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，3種植物提取物的孢子萌發(fā)抑制率均達(dá)到了80%以上，其中，瑞香狼毒提取物的抑制效果最好，丁香提取物次之。

2.4 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中MDA含量變化

從圖2可以看出，經(jīng)過2種植物提取物處理后，苦瓜枯萎病菌菌絲中的MDA含量在各個(gè)時(shí)期都顯著高于CK（P＜0.05），在24 h時(shí)，丁香和瑞香狼毒提取物處理組菌絲中的MDA含量均是CK處理組的2倍以上；MDA的含量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；菌液中的MDA含量處理組也均高于CK組，但整體差異沒有菌絲中的明顯，在24 h時(shí)，瑞香狼毒處理組菌液中的MDA含量較CK提高了2.5倍，丁香和瑞香狼毒提取物處理后，MDA含量均顯著升高（P＜0.05），說明二者通過破壞病菌的膜脂來影響其正常生長(zhǎng)。

圖2 不同時(shí)期不同處理苦瓜枯萎病菌中的MDA含量Fig.2 MDA contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.5 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中PA含量變化

從圖3可以看出，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的PA含量在各個(gè)時(shí)期與CK組相比，均有顯著差異（P＜0.05）。在48 h時(shí)，對(duì)照組和處理組中菌絲和菌液的PA含量差異最為顯著，對(duì)照組的PA含量均是處理組的1.5倍以上，處理組中PA含量整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而CK組的PA含量較為穩(wěn)定。丁香和瑞香狼毒提取物處理后，PA大量累積，意味著菌體內(nèi)反應(yīng)大部分停留在糖酵解途徑，病原菌代謝發(fā)生了紊亂。

圖3 不同時(shí)期不同處理苦瓜枯萎病菌中的丙酮酸含量Fig.3 Pyruvic acid contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.6 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中Pr含量變化

由圖4可知，經(jīng)丁香和瑞香狼毒提取物處理后，菌絲中的Pr含量均顯著低于CK組，在24 h時(shí)，瑞香狼毒提取物處理后Pr含量差異最為顯著（P＜0.05），較CK組降低了72%；丁香提取物處理組在48 h時(shí)與CK組相比差異最顯著（P＜0.05），降低了59%。而處理組菌液中Pr含量均顯著高于CK組（P＜0.05），瑞香狼毒提取物處理組在處理初期與CK組差異最顯著（P＜0.05），是CK組的3倍以上；丁香提取物處理組在48 h時(shí)差異最顯著（P＜0.05），隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，處理組中Pr含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。綜上可以得出，經(jīng)過植物提取物處理后，病原菌中的Pr外滲，說明二者均對(duì)病原菌的細(xì)胞膜有影響，通過破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)從而影響病原菌的生長(zhǎng)。

圖4 不同時(shí)期不同處理苦瓜枯萎病菌中的可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.7 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中CHT活性變化

由圖5可知，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的CHT活性均顯著低于CK組（P＜0.05），隨著時(shí)間的推移，丁香提取物處理后的CHT含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，瑞香狼毒提取物處理后的CHT含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。在72 h時(shí)，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的CHT活性與CK相比差異最顯著（P＜0.05），分別較CK降低了56%、34%。丁香和瑞香狼毒提取物均可通過影響病原菌CHT的活性來破壞病原菌的細(xì)胞壁，以干擾病原菌的正常生長(zhǎng)。

圖5 不同時(shí)期不同處理苦瓜枯萎病菌中的幾丁質(zhì)酶活性Fig.5 Chitirase activity of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

3 結(jié)論與討論

在過去半個(gè)多世紀(jì)，化學(xué)農(nóng)藥的濫用使得自然平衡被破壞，藥劑的殘留問題也慢慢地浮出水面[21]。目前，在全球倡導(dǎo)“綠色農(nóng)業(yè)”的形勢(shì)下，天然來源的植物源殺菌劑在實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用。植物源農(nóng)藥是由植物的天然化學(xué)成分或生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物加工而成，主要通過抑制呼吸代謝、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、影響核酸及蛋白合成等方面達(dá)到抑菌的效果，從而達(dá)到環(huán)保、高效、低毒害、低殘留等良好的防治效果[22]。

丁香為常綠喬木，高達(dá)10 m，原產(chǎn)于印尼馬魯古群島，公元前3世紀(jì)作為“香藥”傳入我國(guó)。丁香的主要活性成分為丁香酚[23]，具有較強(qiáng)的抗真菌、防霉活性，可作為冬季水果儲(chǔ)藏的天然抗真菌劑[24]，許多研究表明，其對(duì)高粱葉斑病[25]、小麥根腐病[26]、三七根腐病菌[27]、番茄疫霉根腐病菌[28]、番茄灰霉病菌[29]等病原菌均有較強(qiáng)的抑制效果。在本試驗(yàn)中，丁香對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果良好，在質(zhì)量濃度為4.0、2.0 mg/mL時(shí)，抑菌率均達(dá)到了100%；在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到了87.15%。葛達(dá)娥等[30]研究表明，不同濃度的丁香酚對(duì)鏈格孢霉的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都有抑制作用，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。王江來[31]研究表明，丁香精油可以抑制茄腐鐮刀菌孢子萌發(fā)及菌落生長(zhǎng)。陳吼等[32]研究發(fā)現(xiàn)，丁香揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、青霉菌均有抑制作用。魏倩倩等[33]研究發(fā)現(xiàn)，丁香乙醇提取物對(duì)番茄枯萎病菌有良好的抑制作用。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

瑞香狼毒分布于東北及河北、內(nèi)蒙古、甘肅、青海、寧夏、西藏等?。ㄗ灾螀^(qū)）。其主要成分是黃酮類物質(zhì)[34]，對(duì)茄子枯萎病菌[35]、番茄枯萎病菌[33]、西瓜枯萎病菌[36]、草莓灰霉病菌[37]等病原菌有較好的抑制效果。在本試驗(yàn)中，瑞香狼毒對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑制效果僅次于丁香，質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，抑菌率為100%，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，抑菌率也達(dá)到了87.02%。梁海英等[38]研究表明，瑞香狼毒對(duì)稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。鄭瑞瑞[36]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒對(duì)西瓜枯萎病菌有良好的抑制效果。陳云坤等[35]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒對(duì)茄子枯萎病、黃瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病、草莓紅中柱病、黃瓜靶斑病、黃瓜炭疽病均有較強(qiáng)的抑制作用。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)測(cè)定了丁香和瑞香狼毒對(duì)苦瓜枯萎病菌酶活性的影響，結(jié)果表明，二者對(duì)MDA、PA、Pr含量和CHT活性均有影響，丁香和瑞香狼毒提取物處理后，MDA、PA含量均顯著升高，菌絲中Pr含量降低，菌液中Pr含量顯著提高，CHT活性則顯著降低。黃曉芳等[39]研究表明，丁香提取物的主要成分丁香酚可以提高植物體內(nèi)水楊酸含量，而適宜濃度的水楊酸可以降低花生葉片膜損傷程度[40]，酚類物質(zhì)可以和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，低濃度時(shí)會(huì)造成細(xì)胞變性，高濃度時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生凝固。趙慧琳等[41]研究表明，瑞香狼毒可以顯著降低番茄植株的MDA含量，與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。丁香、瑞香狼毒提取物處理苦瓜枯萎病菌后均可破壞病原菌的膜脂結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，造成菌體內(nèi)Pr外滲，從而影響病原菌的正常生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)對(duì)病原菌的代謝途徑造成破壞，使其停留在糖酵解途徑。但其具體抑菌機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

本研究表明，丁香、瑞香狼毒提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌抑制效果良好，均有潛力作為防治苦瓜枯萎病的植物源農(nóng)藥，研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)植物源農(nóng)藥和枯萎病的防治提供了理論依據(jù)。