馬紅珍 ，閆敏 ，李磊 ，楊治平 ，張家星 ，蒙秋霞 ，史向遠(yuǎn)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)環(huán)境產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)研究院，山西 太原 030031）

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，具有良好的生物學(xué)功能，在促進(jìn)植物生長和防治植物真菌病害方面具有重要作用。相關(guān)研究表明，貝萊斯芽孢桿菌FKM10可以通過增加生物量、促進(jìn)養(yǎng)分吸收、改善土壤肥力、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等促進(jìn)湖北海棠的生長[1]。多花黃精內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌ZJU-3可產(chǎn)生多種植物激素[2]，發(fā)酵液中的脂肽粗提物能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長，抑制率達(dá)到51.6%，展現(xiàn)出較好的促生與抑菌效果。KIM等[3]研究證實，貝萊斯芽孢桿菌AK-0對真菌病原體Colletotrichum gloeosporioidesYCHH4的菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用，在田間條件下可有效防制蘋果炭疽病。此外，貝萊斯芽孢桿菌還陸續(xù)被證實對黃瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、亞麻炭疽病菌、亞麻枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、油茶炭痕病菌及馬鈴薯立枯病菌均有明顯的抑制效果[4]，是一種極具應(yīng)用前景的新型生防菌[5-7]。貝萊斯芽孢桿菌C44分離自渾源健康黃芪根際土壤中，對黃芪根腐病的主要致病菌尖孢鐮刀菌[8]有較強(qiáng)的抗菌活性，有較大的應(yīng)用需求與應(yīng)用價值。但有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵研究尚少，發(fā)酵效果較差，要想將貝萊斯芽孢桿菌C44廣泛生產(chǎn)并應(yīng)用于環(huán)境中還需要對其發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分（碳源、氮源和無機(jī)鹽等）和培養(yǎng)條件（溫度、pH和轉(zhuǎn)速等）對微生物數(shù)量和抗菌活性強(qiáng)弱有很大的影響[9-10]。目前，在有關(guān)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法中，報道最多的是采用響應(yīng)面法。響應(yīng)面分析法對工藝條件優(yōu)化效果較好[11-13]，其中Plackett-Burman試驗與Box-Behnken試驗可用來判斷試驗因素及交互作用對目標(biāo)響應(yīng)值影響程度，準(zhǔn)確表達(dá)因素對響應(yīng)值的影響。通過中心組合試驗，擬合得到二次多項式模型，從試驗設(shè)計到結(jié)果表述，均較為準(zhǔn)確[14]。響應(yīng)面法對試驗設(shè)計進(jìn)行了優(yōu)化，以科學(xué)的方法來布置試驗，并對試驗結(jié)果進(jìn)行處理，消耗最小的人力、物力，在最少的時間獲得更多更好的生產(chǎn)[15]。因此，響應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵過程的優(yōu)化并取得了較好的效果，喬佳慧子等[16]使用響應(yīng)面法優(yōu)化萎縮芽孢桿菌E20303發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后抑菌率由51.15%提高至72.51%；郭艷霞[17]等用響應(yīng)面法對貝萊斯芽孢桿菌YB19產(chǎn)生中性蛋白酶的活力進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，使得其菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力為370.03 U/g。

本研究將通過單因素試驗與響應(yīng)面法相結(jié)合，以微生物數(shù)量和抗菌活性物質(zhì)為參考指標(biāo)，優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌C44發(fā)酵條件，使之高效發(fā)酵，增加菌落數(shù)，同時增強(qiáng)抗菌活性，還盡可能地縮短貝萊斯芽孢桿菌菌株擴(kuò)培周期，以期為該生防菌進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)提供一定的幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）C44和黃芪根腐病菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院實驗室保存。

供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基[18]有LB培養(yǎng)基、SOB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、NBG培養(yǎng)基。

主要試劑有胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；蔗糖、乳糖、葡萄糖（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硫酸銨（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；硫酸鎂、硫酸錳（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈣（分析純，天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌落數(shù)與抗菌活性測定

1.2.1.1 菌落數(shù)測定 用菌落計數(shù)法[19]，取貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵菌液1 mL加入9 mL無菌試管水中，充分振搖，梯度稀釋到1.0×107倍，然后將100 μL稀釋液吸入牛肉膏蛋白胨平板（NA）中，涂勻后在30 °C下培養(yǎng)48 h，對NA培養(yǎng)平板上的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計并重復(fù)3次。

1.2.1.2 抗菌活性測定 用雙層平板法進(jìn)行研究[20]，將發(fā)酵好的菌液于10 000 r/min離心25 min，取上清液，過濾（0.22 μL濾膜）備用。將瓊脂培養(yǎng)基10 mL注入培養(yǎng)皿內(nèi)，放置在水平面上，待其凝固，再取孢子濃度1.0×106cfu/mL尖孢鐮刀菌菌懸液，在熔化50 °C左右PDA培養(yǎng)基里混合，二者液體之比為1∶10，混合液倒入上述凝固培養(yǎng)皿內(nèi)5 mL，放在水平臺面固化。將無菌牛津杯豎直放置于雙層檢測平板之上，添加200 μL的貝萊斯芽孢桿菌待測液進(jìn)行試驗，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)72 h，測抑菌圈的直徑并重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 將活化后的C44菌株在NB液體培養(yǎng)基中接種，于30 °C、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h為種子液?；A(chǔ)培養(yǎng)的條件為：轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量體積比為3%、裝液量體積比為40%、培養(yǎng)時間24 h。在5種供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，接種上述培養(yǎng)液3%，按照上述基本培養(yǎng)條件發(fā)酵。再取液體發(fā)酵液，統(tǒng)計菌落數(shù)，檢測發(fā)酵液抗菌活性，以篩選出最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化 采用1.2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)條件，改變發(fā)酵培養(yǎng)基組成，24 h后按照1.2.1測定發(fā)酵液菌落數(shù)和抑菌圈大小，篩選出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成，每個處理重復(fù)3次，具體培養(yǎng)基組成設(shè)定如下。

碳源組分和質(zhì)量濃度：分別用蔗糖（Su）、乳糖（La）、葡萄糖（Gl）、麥芽糖（Ma）、甘露醇（Mn）、可溶性淀粉（Ss）替換1.2.2.1優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)基LB中的胰蛋白胨（Tr），其他組分不變，篩選出最佳碳源組分。在最佳碳源組分基礎(chǔ)上，設(shè)置最佳碳源的質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20 g/L處理，其他組分不變，篩選出最佳碳源質(zhì)量濃度。氮源組分和濃度：LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用尿素（Ur）、牛肉膏（BE）、硫酸銨（AS）、硝酸銨（AN）、麩皮（Br）替換LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母提取物（YE），基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變，篩選出最佳氮源。在最佳氮源基礎(chǔ)上，改變培養(yǎng)基中最佳氮源的質(zhì)量濃度（5、10、15、20 g/L），基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變，篩選出最佳氮源質(zhì)量濃度。無機(jī)鹽組分和質(zhì)量濃度：LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用氯化鉀（PC）、磷酸氫二鉀（DH）、磷酸氫二鈉（DP）、硫酸鎂（MS）、硫酸錳（MG）、氯化鈣（CC）替換LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氯化鈉（SC），基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變，篩選出最佳無機(jī)鹽。在最佳無機(jī)鹽基礎(chǔ)上，改變培養(yǎng)基中最佳無機(jī)鹽的質(zhì)量濃度（5、10、15、20 g/L），基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他組分不變，篩選出最佳無機(jī)鹽質(zhì)量濃度。

1.2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 在1.2.2.2優(yōu)化的LB培養(yǎng)基上，改變發(fā)酵條件，24 h后按照1.2.1測定發(fā)酵液菌落數(shù)和抑菌圈大小，篩選出最佳發(fā)酵條件，每個處理重復(fù)3次，具體發(fā)酵條件設(shè)置如下。

pH值：設(shè)初始pH值為5、6、7、8、9，復(fù)篩pH值為7.1、7.2、7.3、7.4、7.5；培養(yǎng)溫度為25、30、35 ℃；轉(zhuǎn)速為150、180、210 r/min；250 mL體積裝液量為50、100、150、200 mL；接種量為1%、3%、5%、7%。

1.2.3 響應(yīng)面試驗

1.2.3.1 Plackett-Burman試驗 為確定影響C44菌株菌落數(shù)較顯著的發(fā)酵參數(shù)，基于單因素試驗結(jié)果，使用Design-Expert.V 8.0.6.1對胰蛋白胨添加量、酵母提取物添加量、磷酸氫二鈉添加量、初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量等8個發(fā)酵參數(shù)設(shè)計Plackett-Burman試驗（N=12的8因素2水平）。以菌落數(shù)為響應(yīng)值，每個處理重復(fù)3次，取平均值為響應(yīng)值。各因素對應(yīng)因子編碼如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素水平和編碼Tab.1 Factors，levels，and codes of Plackett-Burman experimental design

1.2.3.2 最陡爬坡試驗 基于Plackett-Burman試驗結(jié)果，通過方差分析，發(fā)現(xiàn)對菌落數(shù)有顯著影響的3個因子，綜合考慮每個因子效應(yīng)的正負(fù)以及試驗成本，設(shè)計最陡爬坡試驗中每個因子的步長以及爬坡方向。

1.2.3.3 Box-Behnken試驗 基于Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1對N=17的3因素3水平Box-Behnken試驗進(jìn)行設(shè)計，自變量為磷酸氫二鈉（A）、溫度（B）及轉(zhuǎn)速（C）的3組平行試驗并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計的因素水平和編碼Tab.2 Factors， levels，and codes of Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知，在LB培養(yǎng)基中，貝萊斯芽孢桿菌C44菌落數(shù)、抑菌圈直徑均明顯大于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），分別為1.27×1010cfu/mL和13 mm，比NB處理中的菌落數(shù)和拮抗活性分別高出533.3%和550.0%，表明LB培養(yǎng)基對貝萊斯芽孢桿菌生長較為有利，抑菌物質(zhì)較多。故在后續(xù)優(yōu)化試驗中，以LB培養(yǎng)基作為本菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對C44菌株菌落數(shù)和抑菌圈的影響Fig.1 Effect of basal medium on colony number and inhibition zone of C44 strain.

2.2 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

不同碳源對菌株C44菌落數(shù)和活性的影響如圖2-A所示，在供試的7種碳源中，Tr處理的菌落數(shù)和抑菌圈直徑最高，分別為1.27×1010cfu/mL和13.3 mm，菌落數(shù)比其他處理分別高出111.1%、40.7%、81.0%、442.9%、26.7%、18.8%，Ma的菌落數(shù)和抗菌活性最低。

圖2 不同營養(yǎng)成分對C44菌株菌落數(shù)和抑菌圈的影響Fig.2 Effects of different nutrients on colony number and inhibition zone of C44 strain

由圖2-B可知，Tr的質(zhì)量濃度為5～10 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性逐漸升高；Tr的質(zhì)量濃度為10～15 g/L時，菌株C44的菌落數(shù)和抗菌活性逐漸降低；Tr的質(zhì)量濃度為15～20 g/L時，菌株C44的菌落數(shù)和抗菌活性變化不大，這可能是大量的Tr使貝萊斯芽孢桿菌C44菌體快速增長的同時也增加了代謝產(chǎn)物的積累，一些有害代謝產(chǎn)物會抑制菌體的生長繁殖。因此，確定Tr的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

不同氮源對菌株C44菌落數(shù)和活性的影響如圖2-C所示，在供試的6種氮源中，YE處理的菌落數(shù)和抑菌圈直徑最高，分別為1.68×1010cfu/mL和13.7 mm，其菌落數(shù)分別比其他處理高出215.6%、32.9%、288.5%、1 583.3%、1 583.3%，而Ur和BE則不利于菌株C44的生長繁殖，菌落數(shù)和抗菌活性均較低。從圖2-D可以看出，YE的質(zhì)量濃度為5～10 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性逐漸升高；YE的質(zhì)量濃度為10～15 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性逐漸降低，YE的質(zhì)量濃度為15～20 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性變化不大，說明高質(zhì)量濃度的YE不利于菌株C44的繁殖生長。故YE的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

無機(jī)鹽不僅是組成菌體細(xì)胞最主要的營養(yǎng)成分之一，同時，它還是酶的組成部分、酶激活劑或者抑制劑，對培養(yǎng)基滲透壓、pH、氧化還原電位等有調(diào)節(jié)作用。不同無機(jī)鹽對菌株C44菌落數(shù)和活性的影響如圖2-E所示，在供試的7種無機(jī)鹽中，DP和MS處理的菌落數(shù)和抑菌圈直徑均較高，其中DP的菌落數(shù)和抑菌圈直徑最高，分別為2.27×1010cfu/mL和14.6 mm，而CC處理的菌落數(shù)和抗菌活性最低。

從圖2-F可以看出，DP的質(zhì)量濃度為5～10 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性逐漸升高；DP的質(zhì)量濃度為10～25 g/L時，菌落數(shù)和抗菌活性逐漸下降，說明高質(zhì)量濃度的DP會抑制C44菌體的繁殖。故確定DP的最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

由圖3-A可知，初篩過程中，隨培養(yǎng)基pH值升高，菌株C44菌落數(shù)增大，活性提高，在pH值為7～8時，對菌株生長最為有利，其中，pH值在7時，菌落數(shù)和抑菌圈直徑都達(dá)到最大值，分別為2.43×1010cfu/mL和14.7 mm，之后則顯著下降（P＜0.05）。為確定最佳pH值，依次對pH值為7.1、7.2、7.3、7.4、7.5進(jìn)行復(fù)篩，從圖3-B可以看出，pH值為7.1～7.3時，菌株C44菌落數(shù)增大，活性提高，在pH值為7.3時，菌落數(shù)和抑菌圈直徑最高；從抑菌圈直徑來看，pH值為7.1～7.4時均較高，pH值為7.4之后逐漸下降。結(jié)合菌株C44菌落數(shù)與抑菌活性，將7.2～7.3確定為貝萊斯芽孢桿菌最適宜pH值。

圖3 不同發(fā)酵條件對C44菌株菌落數(shù)和抑菌圈的影響Fig.3 Effects of different fermentation conditions on colony number and inhibition zone of C44 strain

圖4 磷酸氫二鈉、溫度和轉(zhuǎn)速三者交互作用對貝拉斯芽孢桿菌C44生長影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of interactions among disodium hydrogen phosphate，temperature，and rotation speed on the growth of Bacillus velezensis C44

溫度對確保酶活性至關(guān)重要，同時也影響著細(xì)胞膜流動性及發(fā)酵液內(nèi)物質(zhì)溶解度，溫度偏低和偏高都會抑制菌株C44的繁殖生長。如圖3-C所示，30 ℃下菌落數(shù)和拮抗活性最高，菌落數(shù)和抑菌圈直徑分別為2.97×1010cfu/mL和16.0 mm，比25、35 ℃處理分別高出81.6%、53.5%和20.9%、12.9%。故確定30 ℃為最佳溫度。

由圖3-D可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150～180 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的升高，C44菌落數(shù)明顯增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，180 r/min轉(zhuǎn)速時菌落數(shù)和抑菌活性最高，分別為3.39×1010cfu/mL和17.5 mm；此后菌落數(shù)及抑菌活性隨轉(zhuǎn)速升高而下降，表明當(dāng)轉(zhuǎn)速超過180 r/min后，其對貝萊斯芽孢桿菌生長繁殖會造成一定程度的障礙。故選擇最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。

從圖3-E可以看出，裝液量在50～100 mL時，C44菌株隨著裝液量增加菌落數(shù)和抑菌活性逐漸升高，并在100 mL時的菌落數(shù)和抑菌圈直徑達(dá)最大，分別為3.63×1010cfu/mL和17.9 mm；裝液量為100～200 mL時，菌株菌落數(shù)和抑菌活性隨著裝液量增加逐漸降低，因為裝液量越大，營養(yǎng)物質(zhì)越多，菌株生長會越好，就會導(dǎo)致耗氧量增加，這必然會影響菌株的生長代謝。故選100 mL為最佳裝液量。

接種量太低，會延長發(fā)酵周期，菌株繁殖生長峰值推遲，接種量過大會使培養(yǎng)基內(nèi)有限營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，縮短周期。由圖3-F可知，接種量為1%～5%時，菌株的菌落數(shù)和抑菌活性逐漸升高，當(dāng)接種量為5%時，C44菌落數(shù)和抑菌圈直徑為最大，分別為3.87×1010cfu/mL和18.3 mm；接種量為5%～7%時，菌株的菌落數(shù)和抑菌活性逐漸降低。故選5%為最佳接種量。

2.4 基于響應(yīng)面法對發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定研究因素和水平后，按照表1對發(fā)酵條件中8種因素進(jìn)行考察，對試驗設(shè)計得出的結(jié)果進(jìn)行方差分析，以篩選出對菌落數(shù)影響顯著的因素作進(jìn)一步優(yōu)化。

由表3可知，Plackett-Burman試驗?zāi)Ｐ蚏2=0.983 5，P值為0.013 5、低于0.05，說明此模型有統(tǒng)計學(xué)意義。由各因子P值可知，DP、溫度、轉(zhuǎn)速和胰蛋白胨對菌落數(shù)的值影響極顯著（P＜0.01），其余4種因素對菌落數(shù)的值影響不顯著（P＞0.05），從極顯著因素中選出3個P值最小的因素進(jìn)行后續(xù)試驗。根據(jù)表3的各因素預(yù)估系數(shù)（系數(shù)為正表示正效應(yīng)，需對試驗設(shè)計的試劑用量梯度增加；系數(shù)為負(fù)表示負(fù)效應(yīng)，需對試驗設(shè)計的試劑用量梯度減少）可知，DP、溫度、轉(zhuǎn)速對菌落數(shù)的值均表現(xiàn)為正效應(yīng)。因此，根據(jù)P值和因素的正效應(yīng)進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗。

表3 Plackett-Burman 試驗方差分析Tab.3 Variance analysis of Plackett-Burman test

2.4.2 最陡爬坡試驗結(jié)果 依據(jù)表3的Plackett-Burman試驗方差分析因子的正負(fù)效應(yīng)，并結(jié)合實際情況，確定了爬坡試驗中因子的爬坡方向及步長，其具體設(shè)計與結(jié)果如表4所示。由表4可知，第2組試驗菌落數(shù)最高，為7.933×1010cfu/mL，故以此為試驗的水平中心進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗與分析。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 The steepest ascent experiment design

2.4.3 響應(yīng)面試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，以菌落數(shù)為響應(yīng)值，以DP 10 g/L、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min為中心點，對Box-Behnken試驗設(shè)計的結(jié)果建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面試驗方差分析Tab.5 Variance Analysis of response surface test

方差分析結(jié)果顯示，所選擇的回歸模型P＜0.000 1，R2=0.983 4，說明此模型對于試驗結(jié)果的影響極為顯著，具有較好的可信度；且失擬項P=0.158 1＞0.05，不顯著，回歸模型擬合度較高，能充分解釋試驗因子和響應(yīng)變量的函數(shù)關(guān)系。菌落數(shù)值（Y）對DP（A）、溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C）的多元二次回歸方程為：Y=123.00－12.75A+3.00B－5.25C+0.75AB－3.75AC+3.75BC+3.37A2－16.13B2－11.62C2。

由4圖可知，當(dāng)磷酸氫二鈉一定時，菌落數(shù)隨轉(zhuǎn)速的升高而逐漸升高，達(dá)到某一轉(zhuǎn)速后菌落數(shù)開始呈現(xiàn)下降趨勢；在一定轉(zhuǎn)速下菌落數(shù)隨磷酸氫二鈉含量升高而降低。當(dāng)磷酸氫二鈉用量一定時，菌落數(shù)隨溫度升高而逐漸升高，達(dá)到某一溫度后，菌落數(shù)開始慢慢下降；在一定的溫度范圍，高溫較低溫更有利于菌落的生長；當(dāng)溫度一定時，隨著磷酸氫二鈉的增加，菌落數(shù)呈逐漸下降趨勢。當(dāng)溫度一定時，菌落數(shù)隨轉(zhuǎn)速升高表現(xiàn)為先升高后降低；當(dāng)轉(zhuǎn)速一定時，菌落數(shù)隨溫度升高有個上升過程，溫度約28 °C菌落數(shù)達(dá)到最大值，然后開始下降。

通過構(gòu)建的響應(yīng)面模型，實現(xiàn)了參數(shù)最優(yōu)化分析，結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌菌落數(shù)最多時，其最佳培養(yǎng)條件為：磷酸氫二鈉5.6 g/L、溫度28.7 °C、轉(zhuǎn)速172 r/min。

為驗證響應(yīng)面試驗所得結(jié)果的可靠性，對通過響應(yīng)面試驗得出的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行3次平行試驗，測得C44菌落數(shù)為1.28×1011cfu/mL，與預(yù)測值1.35×1011cfu/mL相當(dāng)接近。因此，得到的模型能夠較好預(yù)測實際C44菌株的菌落數(shù)，響應(yīng)面法適用于貝萊斯芽孢桿菌菌落數(shù)研究。

3 結(jié)論與討論

本研究以單因素為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法篩選得到了貝萊斯芽孢桿菌C44的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，結(jié)果表明，生防菌生產(chǎn)發(fā)酵效率及抗菌物質(zhì)生產(chǎn)與培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件都密切相關(guān)[21]。李姝江等[18]和武天上等[22]先后對貝萊斯芽孢桿菌ZJ20菌株、CC0955菌株等進(jìn)行優(yōu)化研究，但得到的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件都不一致，說明不同貝萊斯芽孢桿菌在不同環(huán)境中受溫度、培養(yǎng)條件等外界因素的影響下對營養(yǎng)成分的需求存在差異。

本研究以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選定Plackett-Burman試驗得到的3個主要影響因子磷酸氫二鈉、溫度、轉(zhuǎn)速為自變量，以菌落數(shù)作為響應(yīng)值進(jìn)行了分析，所得因素對菌落數(shù)影響程度大小依次是磷酸氫二鈉＞轉(zhuǎn)速＞溫度。其中磷酸氫二鈉與轉(zhuǎn)速以及溫度與轉(zhuǎn)速之間交互作用大于磷酸氫二鈉與溫度交互作用。研究認(rèn)為，貝萊斯芽孢桿菌菌落數(shù)最多時，其最佳培養(yǎng)條件：磷酸氫二鈉為5.6 g/L、溫度為28.7 °C、轉(zhuǎn)速為172 r/min，并對所得貝萊斯芽孢桿菌C44菌株的優(yōu)化發(fā)酵條件加以驗證，試驗得到的C44菌落數(shù)為1.28×1011cfu/mL，與預(yù)測值具有較好的一致性，表明該模型是有效的。這與曹可可等[23]、李冰等[24]的研究結(jié)果相似，均反映出響應(yīng)面法可提高試驗效率，優(yōu)化菌量，降低成本等。本研究結(jié)果為貝萊斯芽孢桿菌的后期深入研究及開發(fā)應(yīng)用鑒定了基礎(chǔ)。