郝瑞林 ，單樹花 ，胡曉燕 ，張志怡 ，李榮山 ，李卓玉

（1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；2.忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000；3.山西省人民醫(yī)院，山西 太原 030006）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）屬于多孔菌屬，是一種罕見的白腐真菌，主要寄生在樺樹上[1-2]。樺褐孔菌主要分布在北緯45°～50°的寒冷地區(qū)，如中國的東北部以及北美和北歐的森林帶[3]。從樺褐孔菌中發(fā)現(xiàn)了豐富的次級代謝產(chǎn)物如多糖、萜類化合物、多酚以及黑色素[4-7]。樺褐孔菌的代謝產(chǎn)物顯示出優(yōu)異的預(yù)防腫瘤、改善炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血糖代謝、免疫和改善氧化應(yīng)激壓力的能力[8-13]，作為主要代謝物，樺褐孔菌來源的多酚顯示出多種生物學(xué)活性[14-16]。從樺褐孔菌中提取的3，4-二羥基苯甲醛肟（3，4-Dihydroxybenzaldoxime）對白血病和癌癥細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用[17]。兒茶酚丙烷類化合物可以通過阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶II，抑制癌細(xì)胞的生長[18]。此外，酚類化合物可以顯著降低IL-6和TNFα，進(jìn)而改善炎癥[19]。樺褐孔菌含有多種酚類化合物，可作為強(qiáng)效抗氧化劑[20]。樺褐孔菌的多酚提取物可防止過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而多糖、三萜和類固醇提取物無此作用[21]。目前，已從樺褐孔菌中鑒定出多種酚類化合物，包括在IO中鑒定出許多多酚，包括咖啡酸、3，4-二羥基二苯甲酮、沒食子酸、丁香酸、原兒茶醛、3，4-二羥苯甲醛、2，5-二羥基對苯二甲酸、Phelligridin C-I和 methylinoscavin A-B[18,22-23]。在這些酚類化合物中，Phelligridin D、Phelligridin E 和Phelligridin G顯示出較強(qiáng)的改善氧化應(yīng)激壓力的能力[23]。

活性氧（ROS）在O2還原過程中產(chǎn)生，包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（OH·）[24-25]。ROS可導(dǎo)致細(xì)胞中大分子的氧化損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[24]。過氧化氫酶是已知的ROS防御酶家族之一，能夠催化H2O2的分解，進(jìn)而緩解由H2O2過量累積導(dǎo)致的氧化損傷[24,26-27]。糖尿病、骨肉瘤、結(jié)直腸癌以及膀胱癌等病理導(dǎo)致的過氧化氫酶活性降低是細(xì)胞中過氧化氫累積以及氧化應(yīng)激壓力升高的主要原因[28-31]。CAT可以將代謝過程以及歧化反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾退宄w內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于過氧化氫的損害[32]。樺褐孔菌醇提取物和水提取物可以有效提高CAT的活性，進(jìn)而改善氧化應(yīng)激所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[33-34]。酚類化合物是樺褐孔菌重要的組成成分，通過酚類化合物激活過氧化氫酶可能是樺褐孔菌緩解氧化應(yīng)激壓力并改善相關(guān)疾病的重要途徑。

本研究應(yīng)用鉬酸銨顯色法評估了樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶的調(diào)節(jié)作用，利用分子動力學(xué)模擬進(jìn)一步分析了其具體機(jī)制，旨在闡明小分子化合物調(diào)控過氧化氫酶活性的可能機(jī)制，為抗氧化酶調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樺褐孔菌子實(shí)體，從吉林省延邊朝鮮族自治州敦化市農(nóng)貿(mào)市場購買，子實(shí)體經(jīng)60 ℃烘干至恒質(zhì)量備用。

1.2 試劑、儀器與設(shè)備

色譜純甲醇和乙腈（賽默飛世爾科技股份有限公司（馬薩諸塞州，美國））；來源于牛肝的過氧化氫酶，由碧云天生物技術(shù)研究所（上海，中國）提供；過氧化氫酶活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

LC-16P制備型高效液相色譜儀（日本，島津）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本，島津）；LC-MS8050三重四級桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本，島津）；Synergy HTX全波長酶標(biāo)儀（美國，安捷倫）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樺褐孔菌多酚的提取與分離純化 樺褐孔菌粉碎后過0.25 mm篩，提取和純化過程參考文獻(xiàn)[35]進(jìn)行。純化后的樺褐孔菌酚類化合物通過高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)一步分離，并使用反相C-18制備柱（10 mm×250 mm，10 μm）。使用20% CH3CN（5%甲酸）作為洗脫劑，以流速10 mL/min洗脫90 min后得到12個餾分。通過HPLC-DAD-MS/MS對餾分進(jìn)行表征[36]，餾分在60 ℃減壓濃縮后經(jīng)過冷凍干燥，將冷凍干燥后的樣品溶于蒸餾水后過0.22 μm濾膜。過濾后的樣品注入LC-MS8050高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，通過反相柱Poroshell 120 SB-C18（150 mm×4.60 mm，3.5 μm）分離和鑒定。分離采用0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B）作為流動相，洗脫梯度為0～5 min，5% B；5～45 min，5%～45% B；45～47 min，45%～5% B；47～50 min，5% B。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL。電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜法用于鑒定陽離子和陰離子模式下的酚類化合物。質(zhì)譜條件為電壓3.5 kV，干燥氣體為氮?dú)饧訜嶂?50 ℃，毛細(xì)管溫度為300 ℃，采集范圍為100～1 000 m/z。

1.3.2 過氧化氫酶活性檢測 過氧化氫酶分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm 處測定其變化量，可計(jì)算出過氧化氫酶的活力。牛肝過氧化氫酶溶于50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH值7.0），得到過氧化氫酶儲備液（4.0×10-9mol/L）。制備濃度為1 mmol/L的樺褐孔菌酚類化合物的儲備溶液，并將其添加到過氧化氫酶儲備溶液中，混合液與反應(yīng)緩沖液混勻后在37 ℃下孵育5 min。根據(jù)過氧化氫酶活性檢測試劑盒說明書，繼續(xù)操作并利用全波長酶標(biāo)儀，在405 nm處測定吸光值（A）。

其中，A化合物+過氧化氫酶表示化合物與過氧化氫酶混合后反應(yīng)液的吸光值，A化合物表示只含有樺褐孔菌酚類化合物的反應(yīng)液的吸光值，A空白表示用蒸餾水等體積代替過氧化氫酶和酚類化合物的反應(yīng)液的吸光值。

1.3.3 分子對接 使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行的計(jì)算對接研究樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶的影響[37]。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）中獲得過氧化氫酶（PDB ID：1TGU）的PDB格式文件。在對接模擬之前，使用UCSF Chimera程序?qū)⒌鞍踪|(zhì)的能量最小化[38]，用PyMOL軟件去除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的雜原子、水分子和重復(fù)鏈[39]。使用Autodock工具完成蛋白質(zhì)的脫氫、Gasteiger電荷的計(jì)算和非極性氫原子的融合[40]。處理后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件保存為pdbqt格式。為了確保過氧化氫酶的活性位點(diǎn)在對接過程中被完全覆蓋并且配體可以自由移動，建立了尺寸為60 ?×60 ?×60 ?的網(wǎng)格盒，對接中心的X、Y、Z軸坐標(biāo)分別為15.781、17.888和13.220。最大對接次數(shù)設(shè)置為50次。對接結(jié)果用PyMOL可視化和分析。

1.3.4 分子動力學(xué)模擬 為了收集更詳細(xì)的結(jié)合信息，使用GROMACS 2020.4對Phelligridin E與過氧化氫酶的對接結(jié)果進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬（MD）。使用acpype程序，GAFF力場用于預(yù)處理Phelligridin E。amber14ffSB力場用于處理過氧化氫酶。acpype軟件用于創(chuàng)建配體拓?fù)湮募?。設(shè)置大小為1 nm的盒子，通過添加Na+，使Phelligridin E/過氧化氫酶復(fù)合物的表面電荷降低到0后進(jìn)行時間為50 ns的分子動力學(xué)模擬（MD）。使用VMD對模擬過程中Phelligridin E/過氧化氫酶復(fù)合物的軌道和結(jié)構(gòu)進(jìn)行均方根偏差（RMSD）、溶劑可及表面積（SAS）、氫鍵分析和結(jié)合自由能分解。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，統(tǒng)計(jì)分析用Excel和SPSS 26.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌酚類化合物的鑒定

應(yīng)用HPLC-DAD-MS分析用于鑒定餾分1～12，結(jié)果如表1所示。

表1 HPLC-DAD-MS法鑒定樺褐孔菌中的酚類化合物Tab.1 Identification of phenolic compounds from Inonotus obliquus by HPLC-DAD-MS

由表1可知，餾分1～12被鑒定為原兒茶醛、丁香酸、8-去甲基桉樹素、2，5-二羥基對苯二甲酸、柚皮素、3-羥基-2-氧代苯-4，6-二羧酸、兒茶素、（E）-3，4-二羥基苯亞甲基丙酮、Phelligridin E、Methylinoscavin B、Interfungin B和Phelligridin I。

2.2 樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶是生物體抵抗氧化應(yīng)激的重要屏障，在許多氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中都出現(xiàn)了過氧化氫酶活性降低的現(xiàn)象[41]。通過激活過氧化氫酶等抗氧化酶的活性從而改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的相關(guān)疾病是一種有效的策略。為了進(jìn)一步探索樺褐孔菌酚類化合物應(yīng)用于干預(yù)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的可能性，本研究利用體外試驗(yàn)分析了樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響，結(jié)果顯示（圖1），12種樺褐孔菌酚類化合物中僅有原兒茶醛、Phelligridin E 和 Phelligridin I顯示出增強(qiáng)過氧化氫酶活性的潛能，特別是Phelligridin E。經(jīng)終濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol/L的Phelligridin E處理后，過氧化氫酶的活性分別增加了41.90%、44.68%、52.66%、58.10%、62.78%和68.10%。

圖1 樺褐孔菌中的酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effect of phenolic compounds from Inonotus obliquus on catalase′s activity

2.3 樺褐孔菌酚類化合物與過氧化氫酶的對接能量

為了分析樺褐孔菌酚類化合物激活過氧化氫酶的可能機(jī)制，應(yīng)用分子對接技術(shù)比較了12個餾分與過氧化氫酶的結(jié)合自由能。由表2可知，在12種酚類化合物中，苯乙烯基吡喃酮類多酚與過氧化氫酶的結(jié)合能低于其他多酚，特別是Phelligridin E。提示Phelligridin E可能通過與過氧化氫酶的結(jié)合來增強(qiáng)酶的活性。

表2 過氧化氫酶與樺褐孔菌酚類化合物的結(jié)合自由能Tab.2 The binding energy between catalase and phenolic compounds from Inonotus obliquus kcal/mol

2.4 分子動力學(xué)模擬

2.4.1 分子動力學(xué)模擬穩(wěn)定性評價(jià) 通過檢查過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物在動力學(xué)模擬過程中的勢能、溫度、壓力和密度的變化來評價(jià)分子動力學(xué)模擬的質(zhì)量。如圖2所示，在模擬過程中，過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物的體系勢能和密度保持了穩(wěn)定，而體系溫度和壓力分別保持在300 K和 0 Pa，表明對過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物的模擬是高質(zhì)量的。

圖2 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E的分子動力學(xué)模擬（MD）評估Fig.2 Evaluation of MD（molecular dynamics） simulations of catalase and catalase/Phelligridin E

2.4.2 RMSD、RMSF、SAS和Rg分析 對比分析過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物在分子動力學(xué)模擬過程中的RMSD、RMSF、Rg和SAS，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在模擬過程中，結(jié)合Phelligridin E后，過氧化氫酶的RMSD出現(xiàn)明顯波動；在模擬結(jié)束時，RMSD穩(wěn)定保持在0.6 nm。在與Phelligridin E結(jié)合的過程中，過氧化氫酶的0—100、400—450位的氨基酸殘基出現(xiàn)了較大的RMSF值變化。這些位置的氨基酸殘基可能參與了過氧化氫酶與Phelligridin E的結(jié)合及配體結(jié)合后引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化過程。與Phelligridin E結(jié)合后，過氧化氫酶的Rg輕微增大；ROG常用于表征蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的緊湊程度，ROG分析結(jié)果表明，Phelligridin E可能使過氧化氫酶的空間結(jié)構(gòu)變得松散。與Phelligridin E結(jié)合后，過氧化氫酶的SAS呈現(xiàn)出下降趨勢，表明Phelligridin E的結(jié)合可能使過氧化氫酶的親水性下降。

圖3 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物的50 ns分子動力學(xué)模擬結(jié)果Fig.3 Results of 50 ns molecular dynamics simulations of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.4.3 Phelligeidin E與過氧化氫酶相互作用分析 由圖4可知，在結(jié)合Phelligridin E之后，過氧化氫酶的20—50位以及360—400位的氨基酸殘基的空間構(gòu)象發(fā)生明顯變化（白色箭頭表明結(jié)合Phelligridin E前后氨基酸殘基的構(gòu)象有明顯變化）。這一改變與過氧化氫酶的RMSF的波動是一致的，過氧化氫酶空間結(jié)構(gòu)的變化是由于酶與Phelligridin E之間的相互作用導(dǎo)致的。圖4-B、C展示了Phelligridin E相對于過氧化氫酶的空間分布，圖4-D、E展示了應(yīng)用Protein_Ligand Interaction Profiler和LigPlot分析MD模擬第50 ns時的過氧化氫酶與Phelligridin E之間的相互作用。Protein_Ligand Interaction Profiler能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和配體做全面分析，包括氫鍵、疏水作用力和離子鍵分析[41]，而LigPlot能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和配體之間形成氫鍵的可能做更充分的評估[42]。Protein_Ligand Interaction Profiler分析結(jié)果顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶的ASN369、HIS372、ILE373形成較強(qiáng)的疏水作用力（圖4-D）。LigPlot分析結(jié)果顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶的ASP25、ASN369、HIS372、PRO391和CYS393形成氫鍵（圖4-E）。圖4-F顯示了MD模擬過程中Phelligridin E與過氧化氫酶間氫鍵的動態(tài)變化，在50 ns內(nèi)，過氧化氫酶與Phelligridin E間的氫鍵數(shù)量在2～6個。本研究利用gmx_MMPBSA對過氧化氫酶模擬過程中的吉布斯自由能進(jìn)行了分解，結(jié)果顯示，過氧化氫酶的GLU67、ILE373、PRO391、PHE326和MET392對Phelligridin E與過氧化氫酶的結(jié)合貢獻(xiàn)較大（圖4-G）。其中，ILE373與Phelligridin E形成距離為3.63 ?的疏水作用力，PRO391與Phelligridin E形成距離為2.54 ?的氫鍵，但過氧化氫酶的GLU67未與Phelligridin E形成4 ?范圍內(nèi)的作用力。GLU67在空間上位于ASP25附近，ASP25與Phelligridin E之間的氫鍵可能導(dǎo)致GLU67的位置發(fā)生改變。以上分析表明，氫鍵和疏水作用力在促進(jìn)Phelligridin E與過氧化氫酶的結(jié)合中可能同樣重要。

2.4.4 二級結(jié)構(gòu)的變化 通過對MD模擬前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成的對比分析，發(fā)現(xiàn)在結(jié)合Phelligridin E后，過氧化氫酶的二級結(jié)構(gòu)組成發(fā)生明顯改變。如圖5顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶之間的相互作用會導(dǎo)致酶分子的33—43、44—53、393—403、433—438位的氨基酸殘基所形成的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這些變化具體為40—43位以及50—53位氨基酸殘基傾向構(gòu)建B-Sheet，393—400位氨基酸殘基傾向構(gòu)建5-Helix，433—437位氨基酸殘基傾向構(gòu)建3-Helix。

圖5 由過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物的所有氨基酸殘基形成的二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure formed by all amino acid residues of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.4.5 過氧化氫酶的氨基酸殘基的二面角的變化 Phelligridin E 與過氧化氫酶間的相互作用力促進(jìn)酶分子的VAL41、CYS393、ASP396、GLY399、GLY400發(fā)生二面角扭轉(zhuǎn)（圖6），二面角扭轉(zhuǎn)具體為ASN33-GLN53傾向形成B-Sheet，CYS393-ASN403形成5-Helix，ASN433-ASP438形成3-Helix。

圖6 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復(fù)合物氨基酸殘基的拉氏構(gòu)象Fig.6 Ramachandran plot of amino acid residues of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.5 Phelligridin E 激活過氧化氫酶的可能機(jī)制

圖7-A詳細(xì)顯示了H2O2進(jìn)入過氧化氫酶活性位點(diǎn)的主要通道，H2O2進(jìn)入過氧化氫酶的通道被不同的氨基酸組包圍，包括由ALA333-ASN338形成的左側(cè)的隨機(jī)折疊片結(jié)構(gòu)、由GLU71-GLY78形成的右側(cè)的雙螺旋結(jié)構(gòu)、由TYR325-ILE332形成的上側(cè)的α-螺旋結(jié)構(gòu)和由PRO151-PRO158形成的下側(cè)的無規(guī)則卷曲。為了分析Phelligridin E結(jié)合后過氧化氫酶活性位點(diǎn)的主要通道的大小，對模擬前后的通道的左右兩側(cè)和上下兩側(cè)之間的距離進(jìn)行了分析。圖7-B結(jié)果顯示，結(jié)合Phelligridin E后，底物進(jìn)入通道的左右兩側(cè)之間的距離無明顯變化，而上下兩側(cè)氨基酸基團(tuán)之間的距離明顯增加。因此，推測由于上下氨基酸殘基之間的距離增加，底物進(jìn)入活性位點(diǎn)的途徑增加，過氧化氫酶的活性也增加（圖7-C）。

圖7 Phelligridin E激活過氧化氫酶的機(jī)制Fig.7 Mechanism of Pheligridin E activating catalase

3 結(jié)論與討論

過氧化氫酶含有幾個到達(dá)深埋活性位點(diǎn)血紅素基團(tuán)的通道。高度限制性的進(jìn)入通道（稱為主通道）作為底物（H2O2）到達(dá)活性位點(diǎn)的首選途徑，并且只能通過該通道（主通道）進(jìn)入活性位點(diǎn)血紅素基團(tuán)。通道的大小與這4個組的移動有關(guān)，其大小決定了進(jìn)入活性位點(diǎn)的襯底的量[43]。Phelligridin E與過氧化氫酶通過ASN369、HIS372、ILE373形成較強(qiáng)的疏水作用力，通過ASP25、ASN369、HIS372、PRO391和CYS393，形成氫鍵。Phelligridin E與過氧化氫酶之間的疏水作用力和氫鍵使過氧化氫酶的VAL41、CYS393、ASP396、GLY399、GLY400發(fā)生二面角扭轉(zhuǎn)，這種二面角扭轉(zhuǎn)推動ASN33-GLN53形成B-Sheet，CYS393-ASN403形成5-Helix，ASN433-ASP438形成3-Helix，其中，CYS393-ASN403形成的5-Helix和ASN433-ASP438形成的3-Helix,使活性中心上下兩側(cè)的氨基酸殘基之間的距離增加，使底物進(jìn)入活性中心的入口增大，底物更容易進(jìn)入包含血紅素輔基的活性中心，增強(qiáng)了過氧化氫酶消除過氧化氫的能力。